JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

والهدف من هذا البروتوكول هو مباشرة بيولوجيا خلايا الثدي الظهارية كما الزاوي المتعددة الخلايا على شبكات البطانية شكلت قبل لإنشاء بسرعة 3D الثدي endothelial نماذج الثقافة المشتركة التي يمكن استخدامها لدراسات فحص المخدرات.

Abstract

تظهر الطباعة البيولوجية كأداة واعدة لاختلاق نماذج سرطان الإنسان ثلاثية الأبعاد التي تختبأ بشكل أفضل السمات المميزة الحرجة في هندسة الأنسجة الحية. في طبقة الحالية طبقة بطباعة بيولوجية، يتم بثق الخلايا الفردية في bioink جنبا إلى جنب مع الإشارات المكانية والزمانية المعقدة لتعزيز الأنسجة الهرمية التجميع الذاتي. ومع ذلك، تعتمد تقنية المعالجة البيولوجية هذه على التفاعلات المعقدة بين الخلايا والبيوinkز والإشارات الكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية. وهكذا، قد يستغرق التجميع الذاتي أيامًا أو حتى أسابيع، وقد يتطلب وجود بيوينكس معينًا، وقد لا يحدث دائمًا عندما يكون هناك أكثر من نوع خلية واحد. لذلك قمنا بتطوير تقنية لطباعة مباشرة بيولوجى قبل تشكيل 3D ظهارة الثدي الظهارية في مجموعة متنوعة من bioinks. Bioprinted قبل تشكيلها 3D ظهارة الثدي الظهارية 19999 19909 الحفاظ على حيوية والهندسة المعمارية المستقطبة بعد الطباعة. بالإضافة إلى ذلك قمنا بطباعة الـ 3D spheroids على شبكات الخلايا البطانية الوعائية لإنشاء نموذج مشترك للثقافة. وهكذا، فإن تقنية الطباعة البيولوجية الجديدة تخلق بسرعة نموذج الثدي البشري ثلاثي الأبعاد ذي الصلة من الناحية الفسيولوجية بتكلفة أقل وبمرونة أعلى من تقنيات الطباعة البيولوجية التقليدية. ويمكن استقراء هذه التقنية متعددة الاستعمالات البيولوجية لإنشاء نماذج 3D من الأنسجة الأخرى في bioinks إضافية.

Introduction

3D في النماذج في المختبر الأوعية الدموية هي أدوات أساسية للدراسة الميكانيكية لنمو السرطان والانبثاث. لسرطان الثدي على وجه الخصوص، خلايا الثدي الظهارية المستزرعة في Matrigel تنظيم في spheroids المستقطبة التي تشبه بشكل أوثق في في هندسة الأمومة في1،2،3،4،5،6،7،8. 3D الثدي ظهارية الخلية الثقافة يؤثر أيضا على وظيفة الخلية, مع الثقافات 3D تظهر الاختلافات في عامل النمو البشرة (EGF) مستقبلات التشكيل8,9; وظيفة oncogene، بما في ذلك ErbB210؛ النمو و المبرمجات signaling11,12; و علاج كيميائي المقاومة13,14. الخلايا البطانية الوعائية بالمثل تستجيب بشكل مختلف للمحفزات البيئية في 3D مقابل الثقافة التقليدية 2D15,16,17,18. ومع ذلك ، فإن الكثير من فهم التفاعلات الظهارية البطانية والثدي تأتي من 2D باستخدام المتوسطة أو إدراج ترانسويل ، أو نماذج ثلاثية الأبعاد التي يتم فصلها في نوعين من الخلايا جسديا19،20،21،22،23. هذه النماذج المشتركة في الثقافة توفر رؤية فسيولوجية محدودة، منذ كل من الثقافة 3D والاتصال الخلية هي حاسمة لالأوعية البطانية – الثدي التفاعلات خلية الظهارية24,25,26.

وقد تم تصنيع نماذج السرطان 3D باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات، بما في ذلك شنقا قطرة تشكيل spheroid، والطباعة الحيوية، والتجمع المغناطيسي، والثقافة داخل الهيدروجيل أو على السقالات هندسيا5،27،28،29. في الآونة الأخيرة، تم إنشاء نماذج الورم 3D مع أنواع الخلايا المتعددة مرتبة في هياكلها 3D. في مثال واحد من منصة ورم على رقاقة، السرطان، البطانية، والخلايا السترومال اختلطت في مصفوفة ومن ثم حقنها في غرف الأنسجة المركزية الثلاث في جهاز بوليديميثيلسيلوكسيان (PDMS). كانت غرف الأنسجة تحدها قناتان خارجيتان تمثلان شريانًا وناجولًا. بعد 5-7 أيام من الثقافة، شكلت الخلايا البطانية شبكة الأوعية الدموية الدقيقة وتكاثرت الخلايا السرطانية لتشكيل أورام صغيرة بالقرب من الأوعية الدموية. ثم تم استخدام هذه المنصة لفحص المخدرات وتركيبات المخدرات30. وقد تم إنشاء منصات إضافية للورم على رقاقة لدراسة الانبثاث وأنواع السرطان مع المحفزات الميكانيكية محددة (على سبيل المثال، سلالة ميكانيكية في الرئة)31،32. ومع ذلك، فإن هذه المنصات عموما لا تشمل كلا من الأوعية الدموية والسرطان في هياكلها 3D.

يظهر Biofabrication وعدًا كبيرًا في تقدم نماذج الأورام ثلاثية الأبعاد في الأوعية الدموية ، لأنها تمكن من التحكم المكاني المحكم في موقع الخلية. على الرغم من نمو الطباعة البيولوجية على مدى العقد الماضي، تركز دراسات قليلة على الأورامتحديدا 33،34. في أحد الأمثلة، تم استخدام الطباعة ثلاثية الأبعاد لخلايا HeLa في هيدروجيل الجيلاتين/ألجينات/الفيبرينوجين لإنشاء نموذج لسرطان عنق الرحم في المختبر. كانت الخلايا السرطانية مطبوعة بيولوجياً كخلايا فردية ثم سمح لها بتشكيل spheroids ، والتي أظهرت معدل انتشار أعلى ، وزيادة تعبير مصفوفة metalloproteinase ، وsemoresistance أعلى من الخلايا في ثقافة 2D35. في هذه الدراسات، كما في كثير من الآخرين36،37، تم طباعة التعليقات الخلية المنفصلة بيولوجيا، ومن ثم تم تزويد الثقافات الخلية مع العظة الميكانيكية والبيوكيميائية اللازمة لتمكين الخلايا لتشكيل هيكل 3D. ومع ذلك، قد يستغرق التجميع الذاتي الخلوي أيامًا أو أسابيع، وقد يتطلب إشارات بيئية مكانية وزمنية معقدة، أو قد لا يحدث عندما يكون نوعان من الخلايا مُزَمَّقَين. على سبيل المثال، خلايا الثدي الظهارية الناجمة موت الخلايا في الخلايا البطانية في 2D المشتركة في الثقافة، والخلايا الظهارية الثدي تفكك لم تشكل 3D spheroids عندما مطبوعة بيولوجيا في الهيدروجين / الجيلاتينhydrogels 38. فصل الثدي الظهارية أو الخلايا السرطانية شكلت spheroids في bioinks alginate القائمة فقط عندما تتشابك في قوالب PDMS دائرية. في حالات أخرى، تم تشكيل spheroids باستخدام قطرات معلقة في مرفق منخفضة جدا لوحات الآبار الدائرية ثم مختلطة في bioinks alginate القائمة39،40.

نحن الآن وصف بديل 3D الأنسجة البيولوجية طريقة في هذا البروتوكول. بدلا من البذور تفكك الخلايا والانتظار لهذه الخلايا لتشكيل هياكل 3D، ونحن وصف كيفية إنشاء و bioprint 3D الورم spheroids على شبكة أنبوب الأوعية الدموية لإنشاء نموذج الورم الثقافة المشتركة التي يمكن استخدامها على الفور تقريبا. يمكن زراعة الوريث الورمي في المختبر أو مشتق من الأنسجة البشرية (العضويات). وبالمثل، يمكن زراعة أنابيب الأوعية الدموية أو يمكن أن تستمد من شظايا الأنسجة الدهنية الدقيقة الأوعية الدموية. يمكن أن تتراوح Bioinks من ألجينات غير نشطة بيولوجيا إلى ماتريجل41نشطة بيولوجيا للغاية . منذ هذا الورم 3D المشتركة في الثقافة نموذج يمكن إنشاؤها مع مجموعة متنوعة من هياكل الخلايا وbioinks، فإنه يمكن أن تتضمن أنواع الخلايا المتعددة، المصفوفات خارج الخلية، وتدرجات chemokine15،42. وفي حين أنه لا يمكن في صياغته الحالية أن تكون شبكات البطانية مُطعّمة، فإن التكرارات المستقبلية يمكن أن تدمج هذه الطريقة مع أنظمة الـ microfluids أو الأنظمة على الشريحة. Bioprinting 3D ظهارة الثدي الظهارية على شبكات الضمان تمكن biofabrication السريع من نماذج الثدي البشري لاختبار المخدرات و الطب الدقيق شخصية27.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. الثدي نمو الخلايا الظهارية وملايس وسائل الإعلام

  1. خلايا الظهارية MCF10A
    ملاحظة: غير ورم خلد الثدي خلد خط الخلية الظهارية مشتق من المريض مع مرض فيزيائية43. الخلايا لا تعبر عن مستقبلات هرمون الاستروجين.
    1. لإعداد 20 ميكروغرام / مل عامل نمو البشرة (EGF), قم بحل 100 ميكروغرام من EGF التحلل في 500 ميكرولتر من dH2O العقيمة لجعل 200 ميكروغرام / مل EGF. إضافة 500 ميكرولتر من 200 ميكروغرام / مل EGF في 4.5 مل من العقيمة 0.1٪ BSA في dH2O لجعل 20 ميكروغرام / مل EGF حل الأسهم. مخزن أعد 20 ميكروغرام / مل EGF aliquots في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 12 شهرا.
    2. لتحضير 500 ميكروغرام/مل هيدروكورتيزون، تخفيف 1 ملغ من الهيدروكورتيزون في 1 مل من الإيثانول المطلق (200 دليل). إضافة 1 مل من DMEM العقيمة F:12 إلى هذا الخليط لجعل 500 ميكروغرام / مل محلول الأسهم الهيدروكورتيزون. تخزين ال aliquots مخزون الهيدروكورتيزون في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 12 شهرا.
    3. لإعداد 10 ميكروغرام / مل سم الكوليرا، حل 1 ملغ من مسحوق الكوليرا السمي في 1 مل من dHالعقيمة 2O لجعل 1 ملغم / مل الكوليرا السموم حل الأسهم. تخزين الكوليرا الأسهم السموم aliquots في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 12 شهرا.
    4. لإعداد متوسط النمو، إضافة 500 ميكرولتر من EGF (20 ميكروغرام / مل)، 500 ميكرولتر من الهيدروكورتيزون (500 ميكروغرام / مل)، 5 ميكرولتر من سم الكوليرا (1 ملغ / مل)، 500 ميكرولتر من الأنسولين البقري (10 ملغ / مل)، 10 مل من البنسلين والstreptomycin، و 25 مل من مصل الخيل إلى 500 مل من DMEM F:12 لتركيز نهائي من 20 نانوغرام / مل EGF، 500 نانوغرام / مل هيدروكورتيزون، 10 نانوغرام / مل سم الكوليرا، 10 نانوغرام / مل من الأنسولين البقري، 2٪ v / v البنسلين وstreptomycin، و 5٪ v / v مصل الخيل. وزاد تركيز المضادات الحيوية إلى 2 في المائة لمراعاة انخفاض العقم في عملية الطباعة البيولوجية؛ ومع ذلك، يمكن خفض تركيز المضادات الحيوية إلى 1٪.
    5. لإعداد Assay Medium، أضف 500 ميكرولتر من الهيدروكورتيزون (500 ميكروغرام/مل)، 5 ميكرولتر من سم الكوليرا (1 ملغ/مل)، 500 ميكرولتر من الأنسولين البقري (10 ملغم/مل)، 10 مل من البنسلين والستربتوميسين، و 25 مل من مصل الخيل إلى 500 مل من DMEM F:12 لتركيز نهائي من 500 نانوغرام / مل هيدروكورتيزون، 10 نانوغرام / مل سم الكوليرا، 10 نانوغرام / مل من الأنسولين البقري، 2٪ v / v البنسلين وstreptomycin، و 5٪ الخامس / الخامس مصل الخيل.
  2. MDA-MB-231
    ملاحظة: ثلاثية السلبية (تفتقر إلى مستقبلات هرمون الاستروجين، مستقبلات البروجسترون، ومستقبلات عامل النمو الجلدي 2) سرطان الثدي خط الخلية الظهارية يتم إنشاؤه من الانصباب الجنبي للمريضة مع الثدييات النقيلي44. تمثل الخلايا سرطان الثدي العدواني، الغازية، وضعف التمييز.
    1. لإعداد النمو والمدس المتوسطة، إضافة 50 مل من مصل البقر الجنين، 10 مل من البنسلين وstreptomycin، و 25 مل من مصل الخيل إلى 500 مل من DMEM لتركيز النهائي 10٪ v / v مصل البقر الجنين، 2٪ الخامس / الخامس البنسلين وstreptomycin، و 5٪ الخامس / الخامس مصل الخيل.

2. الثدي الظهارية الخلية ثقافة

  1. بذور 500،000 MCF10A أو MDA-MB-231 الخلايا في 10 سم (P100) طبق زراعة الأنسجة مع 10 مل من MCF10A أو MDA-MB-231 وسائل الإعلام النمو. تصل خلايا MCF10A و MDA-MB-231 إلى >90٪ في التقاء 48 ساعة.
  2. لتمرير الخلايا الظهارية الثدي، وغسل الخلايا الأولى مع 10 مل من برنامج تلفزيوني دافئ.
  3. فصل خلايا الثدي الظهارية بإضافة 2 مل من 0.05٪ تريبسين-EDTA إلى الطبق. ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 لمدة 20-25 دقيقة.
  4. إضافة 5 مل من MCF10A أو MDA-MB-231 متوسطة النمو إلى الخلايا التربسينيف لتحييد التربسين. Pipette الخلية وسائل الإعلام الخليط صعودا وهبوطا إلى خلايا resuspend وتفتيت مجموعات الخلايا.
  5. إضافة تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل وطاردة مركزية في 1200 x ز لمدة 3 دقائق. التعرق بعناية وsususpend بيليه الخلية في 5 مل من MCF10A أو MDA-MB-231 متوسطة النمو.
  6. لوحة 1 مل من تعليق الخلية في 5 جديد 10 سم أطباق زراعة الأنسجة جنبا إلى جنب مع MCF10A أو MDA-MB-231 متوسطة النمو. ضع الأطباق في حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. الخلايا ستكون جاهزة للمرور مرة أخرى في 2-3 أيام. يمكن الحفاظ على خلايا MCF10A إلى رقم مرور 35 ، وبعد ذلك تظهر التغيرات المورفولوجية. يمكن الحفاظ على خلايا MDA-MB-231 إلى رقم 24، وبعد ذلك تظهر التغيرات المورفولوجية.

3. الثدي تكوين الظهارية

  1. تجميد 200 μL نصائح ماصة لمدة 30 دقيقة قبل بدء الفحص. الحفاظ على عامل النمو حل مصفوفة مخفضة (على سبيل المثال، Matrigel) (10 ملغ / مل) على الجليد لكامل العملية.
  2. ببطء ماصة 30 ميكرولتر من الجليد الباردة حل المصفوفة باستخدام الجليد الباردة 200 μL نصائح ماصة في كل بئر من شريحة غرفة 8-جيدا. تبدأ من الجانبين واسحب تلميح ماصة على طول الزوايا، مضيفا قطرة النهائي إلى وسط البئر لضمان طلاء حتى من كل بئر. تجنب فقاعات الهواء خلال هذه الخطوة لضمان طبقة حل مصفوفة موحدة. استخدام نصائح جديدة الماصات لكل بئر.
  3. منزلقات غرفة احتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 حاضنة لمدة 15-20 دقيقة البلمرة حل المصفوفة.
  4. resuspend تريبسسيند MCF10A الخلايا في MCF10A Assay المتوسطة في 200،000 الخلايا / مل أو resuspend تبسيند MDA- MB-231 الخلايا في MDA-MB-231 متوسط النمو في 200،000 الخلايا / مل.
  5. إذا كان استخدام خلايا MCF10A، إعداد جديدة MCF10A Spheroid متوسط النمو عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من EGF (20 ميكروغرام / مل) و 100 ميكرولتر من مصفوفة الحل إلى 5 مل من Assay المتوسطة لتركيز النهائي من 2٪ مصفوفة الحل.
  6. إزالة شريحة الغرفة مُطفّلة مع حل المصفوفة من الحاضنة. أضف 50 ميكرولتر من MF10A أو MDA-MB-231 خلية تعليق (10,000 خلية) إلى كل بئر. في حالة استخدام خلايا MCF10A، أضف 450 ميكرولتر من MCF10A Spheroid Growth Medium. إذا كان استخدام خلايا MDA-MB-231، أضف 450 ميكرولتر من MDA-MB-231 Growth Medium مُزَوَّل مُسبقًا مع محلول مصفوفة 2٪ (9 ميكرولتر). مكان فوري الشريحة الغرفة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 حاضنة.
  7. استبدال المتوسطة كل 4 أربعة أيام. بعناية ماصة 200 μL من وسائل الإعلام القديمة من زاوية واحدة من كل بئر باستخدام 200 ميكرولتر ماصة تلميح. أثناء هذه العملية، إمالة الشريحة الغرفة في 45 درجة للتأكد من أن لا يتم إزعاج الـ spheroids. إضافة 200 μL من إعداد حديثا MCF10A Spheroid متوسط النمو أو MDA-MB-231 متوسط النمو مختلطة سابقا مع 2٪ حل مصفوفة لكل بئر في الزاوية في قطرات لضمان أن تظل الزاويين تعلق على طبقة المصفوفة. يتم استبدال فقط ~ 50 ٪ من وسائل الإعلام بحيث لا يتم استنفاد جميع السيتوكينات التي تنتجها spheroids تماما.
    ملاحظة: MCF10A الظهارية الثدي الظهارية ظهارية يستغرق ما يصل إلى 8 أيام لاستقطاب وتشكيل مراكز جوفاء. MDA-MB-231 ظهار الثدي الظهارية 5 أيام يستغرق ما يصل إلى تشكيل وليس لديهم مراكز جوفاء.

4. تشكيل شبكة الخلايا endothelial

  1. ثقافة الخلية الوريدة الوريدية (HUVEC)
    1. إضافة محتويات واحدة Endothelial النمو متوسط 2 مجموعة تحتوي على عامل نمو الانسولين، عامل النمو الليفي، عامل النمو البطانية الوعائية، حمض الاسكوربيك، عامل نمو البشرة، الهيبارين وجنتاميسين-أمبروترين B، جنبا إلى جنب مع 50 مل من مصل الأبقار الجنين، 5 مل البنسلين-الستربتوميسين و5 مل من 200 مل الجلوتامين إلى 500 مل من Endothelial Basal متوسط-2 (EBM-2) لإنشاء كامل Endothelial النمو المتوسط (EGM-2).
    2. بذور 500،000 الخلايا البطانية في طبق ثقافة الأنسجة 10 سم في 10 مل من EGM-2. وضع الخلايا في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 حاضنة حتى تصل إلى> 80٪ التقاء (حوالي 48 ساعة).
    3. إلى الخلايا الممر، وغسل الخلايا البطانية مع 10 مل من برنامج تلفزيوني دافئ. فصل HUVEC بإضافة 2 مل من 0.05٪ تريبسين-EDTA إلى طبق زراعة الأنسجة 10 سم. مراقبة الخلايا عن كثب عن طريق المجهر النقيض المرحلة. الخلايا جاهزة عندما يتم ّ ّ ّ ّ ّ ّ ّ ّ ّ ّ ّ اِلتِها، لكن تبقى مُلتصقة بالطبق.
    4. التعرق بعناية التربسين من الطبق. أضف 8 مل من EGM-2 إلى الطبق. غسل الخلايا قبالة الطبق عن طريق الأنابيب وEGM-2 صعودا وهبوطا على سطح الطبق بأكمله.
    5. بدلا من ذلك، إضافة 5 مل من EGM-2 إلى الخلايا التربسينized لتحييد التربسين. Pipette الخلية وسائل الإعلام الخليط صعودا وهبوطا إلى خلايا resuspend وتفتيت مجموعات الخلايا. إضافة تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل وطاردة مركزية في 1200 x ز لمدة 3 دقائق. التعرق بعناية على افرا و resuspend بيليه الخلية في 10 مل من EGM-2.
    6. أضف 1 مل من تعليق الخلايا إلى 9 مل من EGM-2 في طبق زراعة الأنسجة 10 سم. ضع الأطباق في حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. تبادل 2/3 من المتوسط مع جديد EGM-2 كل 2 أيام. الخلايا ستكون جاهزة للمرور في 3-5 أيام. ويمكن الحفاظ على HUVEC حتى مرور 8 بعد ذلك أنها تفشل في تشكيل الشبكات.
  2. تشكيل الشبكة الخلوية (HUVEC)
  3. تجميد 200 μL نصائح ماصة لمدة 30 دقيقة قبل بدء الفحص. الحفاظ على عامل النمو حل مصفوفة مخفضة (10 ملغ / مل) على الجليد للعملية برمتها.
  4. ببطء ماصة 30 ميكرولتر من الجليد الباردة حل المصفوفة باستخدام الجليد الباردة 200 μL نصائح ماصة في كل بئر من شريحة غرفة 8-جيدا. تبدأ من الجانبين واسحب تلميح ماصة على طول الزوايا، مضيفا قطرة النهائي إلى وسط البئر لضمان طلاء حتى من كل بئر. تجنب فقاعات الهواء خلال هذه الخطوة لضمان طبقة حل مصفوفة موحدة. استخدام نصائح جديدة الماصات لكل بئر.
  5. منزلقات غرفة احتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 حاضنة لمدة 15-20 دقيقة لبليمرة Matrigel.
    1. ما قبل وصمة عار طبق 10 سم من HUVEC مع 10 ميكرولتر من تعقب الخلايا الحمراء (1:1000) لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 حاضنة.
    2. غسل الخلايا البطانية مع 10 مل من برنامج تلفزيوني دافئ. فصل HUVEC بإضافة 2 مل من 0.05٪ تريبسين-EDTA إلى طبق زراعة الأنسجة 10 سم. ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 لمدة 5 دقائق لفصل الخلايا بالكامل.
    3. إضافة 5 مل من EGM-2 إلى الطبق لتحييد التربسين. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 25 مل. جهاز طرد مركزي HUVEC في 1200 x ز لمدة 5 دقائق. التعرق وssuspend بيليه الخلية في 5 مل من المصل خالية EBM-2.
    4. عد الخلايا باستخدام Trypan الأزرق لتحديد الخلايا القابلة للحياة. إنشاء 1 × 106 خلية / مل الحل.
    5. إضافة 100،000 HUVEC إلى كل بئر مع 200 ميكرولتر من مصل خال EBM-2. إذا تم إضافة المزيد من الخلايا، فإنها سوف تخلق سطح أحادية الطبقات بدلا من شبكة أنبوب.
    6. احتضان HUVEC في حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. بعد 6 ساعات، شبكات HUVEC الصورة عن طريق المجهر النقيض المرحلة. الشبكات جاهزة الآن لزراعة تربية النخاع مع ثدي.

5. bioprinting الثدي الظهارية spheroids على شبكات HUVEC شكلت مسبقا

ملاحظة: ينبغي استخدام نظام ترسب أحيائي مزدوج الفوهة لعملية المعالجة البيولوجية. في هذه الحالة، كان لدى النظام ثلاثة أذرع للحركة للسماح بالتحكم المكاني على نطاق ميكرون في ترسب المواد بالإضافة إلى محركين مُحركين من أجل إيداع بيوينك من 10 مَقنَنَعٍ 10 مل. وينبغي أن يكون هذا النظام وظيفيا مع نظام تصفية الهواء الجسيمات عالية الكفاءة، فضلا عن قدرات الأشعة فوق البنفسجية التعقيم للحفاظ على بيئة معقمة أثناء الطباعة الحيوية. الطابعة الحيوية هي الأشعة فوق البنفسجية تعقيم لمدة ساعة قبل عملية الطباعة.

  1. إنشاء ظهارة الثدي الظهارية وشبكات HUVEC كما هو موضح سابقا. تقدير عدد الظهارية الثدي spheroids في كل بئر عن طريق عد الزفيرويدات في مرحلة تمثيلية على النقيض صور المجهر.
  2. قطع 0.5 سم قبالة نهاية 1000 ميكرولتر ماصة تلميح. استخدام تلميح قطع ماصة إلى ماص بعناية جميع spheroids من الشريحة غرفة 8-جيدا وإلى أنبوب 50 مل. فسوسيبند spheroids في bioink المحدد في 100 spheroids /100 μL.
    ملاحظة: قد يؤدي تركيزات الزفير الأعلى في تجميع spheroid ومنع التصور من التفاعلات بين spheroids والشبكات البطانية.
  3. تمرير الخليط من خلال مصفاة الخلايا 70 ميكرومتر لإزالة أي الزفيرويدات الكبيرة أو متفاوتة المسافات.
  4. قم بتحميل الـ spheroids المجمعة في حقنة معقمه 10 مل و اِكدها بإبرة معقمه قياس 25 قياساً. ربط الحقنة بنظام الترسيب الحيوي.
  5. التعرق الوسيط قبالة شبكات HUVEC في الشريحة غرفة 8-جيدا.
  6. قذف 100 ميكرولتر من الظهارات الثدي على 6 آبار من شبكات HUVEC بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة. الحفاظ على بئرين من شبكات HUVEC كضوابط.
  7. إضافة 400 μL من MCF10A Spheroid متوسط النمو إذا كان استخدام SPHEROIDs MCF10A المطبوعة على شبكات HUVEC أو إضافة 400 ميكرولتر MDA-MB-231 متوسط النمو مختلطة سابقا مع 2٪ حل مصفوفة إذا كان يستخدم MDA-MB-231 spheroids المطبوعة على شبكات HUVEC. وينبغي استخدام وسيلة النمو ذات الزفيرة في آبار التحكم في HUVEC.
  8. احتضان الثقافات المشتركة في حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 حاضنة لمدة 24 - 96 ساعة دون تغيير وسائل الإعلام. وستظل الثقافات المشتركة قابلة للحياة في الوسط الأصلي لمدة تصل إلى أربعة أيام.

6. المجهر الكونكوكل

  1. Immunofluorescence وPBS-جلايسين تحضير العازلة
    1. إعداد Immunofluorescence (IF) العازلة 10x حل المخزون بإضافة 2.5 غرام من أزيميد الصوديوم، 5 غرام من الألبومين مصل الأبقار، 10 مل من تريتون X-100، و 2.05 مل من توين-20 في 500 مل من برنامج تلفزيوني 10x. ضبط درجة اله إلى 7.4. تخزين المحلل المخزون لمدة تصل إلى عام في 4 درجة مئوية لتجنب الترسب.
    2. إنشاء عازلة IF العمل عن طريق تمييع 50 مل من 10x IF العازلة في 450 مل من المياه المعقمة deionized. قم بتخزين حل العمل في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
    3. إعداد 10x PBS-Glycine محلول المخزون الاحتياطي بإضافة 37.5 غرام من الجليسين إلى 500 مل من برنامج تلفزيوني 10x. ضبط درجة اله إلى 7.4. تخزين المحلل المخزون لمدة تصل إلى 6 أشهر في 4 درجة مئوية لتجنب الترسب.
    4. إنشاء العمل برنامج تلفزيوني-جليكاين حل عن طريق تخفيف 50 مل من 10x PBS-الجليسين العازلة في 450 مل من المياه المعقمة deionized. تخزين حل العمل في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
  2. تسمية عينات مطبوعة بيولوجيا والصورة عن طريق المجهر Confocal
    1. متوسطة من الاستزراع المشترك ثلاثي الأبعاد المطبوعة بيولوجيًا وشطف 3 مرات مع PBS الدافئ. إصلاح الثقافات المشتركة ثلاثية الأبعاد المطبوعة بيولوجيًا مع 4٪ من الـ paraformaldehyde لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. شطف العينات 3 مرات لمدة 20 دقيقة مع 1X PBS-جليسين.
    2. عينات كتلة مع عازلة IF مختلطة مع مصل الماعز 10٪ لمدة 90 دقيقة (كتلة الأولية)، تليها 40 دقيقة مع IF العازلة بالإضافة إلى مصل الماعز 10٪ و أفينيبور فاب جزء (1:100، كتلة الثانوية).
    3. إذا كان استخدام MCF10A spheroids، تسمية عينات مع جسم مضاد الأولية ل α integrin (1:100) في العازلة منع الثانوية بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية، تليها اليكسا فلور 488 الأجسام المضادة الثانوية (1:200) وهويشت 33342 (1:1000) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء. تعبر خطوط خلايا MCF10A عن مستويات عالية من α6 integrin، وهو أمر ضروري لإظهار الاستقطاب الزنجي والمورفولوجيا.
    4. إذا كان استخدام MDA-MB-231 spheroids، التي تعبر عن مستويات منخفضة من integrin α6، تسمية العينات مع اليكسا فلور 488 phalloidin (1:100) وهويشت 33342 (1:1000) في العازلة منع الثانوية لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء. Phalloidin تمكن actin خيوط التصور حتى يمكن تقييم المورفولوجيا غير متبلور والغازية.
    5. غسل العينات مع 1X PBS-الجليسين 3 مرات لمدة 20 دقيقة.
    6. إعداد عينات للتركيب عن طريق إزالة شريحة الغرفة باستخدام أداة الشركة المصنعة. إضافة قطرة صغيرة من حل antifade إلى كل بئر. ضع غطاء 22 مم × 60 مم على كل شريحة غرفة وختم الحواف بعناية بتلميع الأظافر الواضح.
    7. عينات الصورة باستخدام المجهر confocal كما مكدسات Z من ~ 10 شرائح في 5 μm الخطوات. إذا رغبت في ذلك، ضغط طائرات Z في مستوى واحد باستخدام الأمر "التركيز الموسع" في برامج التصوير الخلوي.
    8. كمي التصاق spheroid إلى الشبكات البطانية باستخدام صورة J. يمكن قياس عدد الـ spheroids المُلتزم به كميًا باستخدام البرنامج المساعد التحليل مع حجم الجسيمات والتواميم المناسبة. تطبيع عدد الـ spheroids المرفقة إلى ناحية الصورة.
    9. لضمان إعادة التكاثر، كمي عدد الزى المنضم في 4 × 4 صور من الثقافات المشتركة. إذا كان عدد spheroid أقل بشكل ملحوظ إحصائيًا من التجارب الأخرى، يجب تكرار التجربة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يجب أن خلايا الثدي الظهارية الذاتي تنظيم في 3D spheroids بعد 5-8 أيام من الثقافة على حل مصفوفة وفي ثقافة المتوسطة مع 2٪ حل مصفوفة. غير ورم MCF10A ظهار الثدي الطفو يجب أن تظهر جولة ولها مركز أجوف، مع α6 integrin الاستقطاب إلى الحافة الخارجية للpheroid(الشكل 1، inset يظهر مراكز جوفاء). تتشكل الخلاي?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هذا البروتوكول هو الأول من نوعه لـ bioprint spheroids في هندستها المعمارية ثلاثية الأبعاد من أجل المشاركة في الثقافة مع الخلايا البطانية أيضًا في هندستها ثلاثية الأبعاد. وتشمل خطوات البروتوكول الحاسمة التكوين الأولي لبشرة الثدي الظهارية وشبكات HUVEC. يجب توخي الحذر الشديد في تغذية الظهارية الثدي sp...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم تمويل هذا البحث من قبل المعاهد القومية للصحة 1R01HL140239-01 إلى AMC. نود أن نشكر مركز التصوير الخلوي في جامعة دريكسل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
37°C incubator, 5% CO2 and 95% humiditySanyoMCO-20AICCell incubation
3D Bio printercustom-madeNoneUsed for bioprinting
8-well chamber slidesVWR, Radnor, PA53106-306for seeding spheroids
25-gauge needleSigma, St. Louis, MOZ192406-100EAbioprinting syringe needle
Absolute ethanol (200 proof )Sigma, St.Louis, MOE7023-500MLreconsitution of media components
Affinipure F(ab′)2 fragment goat anti-mouse IgGJackson ImmunoResearch, West Grove, PA115006020secondary block - Immunofluorescence
Alexa Fluor 488 (1:200)Thermo Fisher, Waltham, MAA-11006Seconday antibody-Immunofluorescence
Bovine insulinSigma, St.Louis, MOI-035-0.5MLMCF10A Media additive
Bovine serum albumin (BSA)Sigma, St.Louis, MOA2153-500GBlocking agent -Immunofluorescence
Falcon 70 µm Cell StrainerCorning, Corning, NY352350Remove large or clustered spheroids
CellTracker™ Red CMTPX DyeThermo Fisher, Waltham, MAC34552pre-stain for HUVEC tubes
Compact CentrifugeHermle- Labnet, Edison ,NJZ206AFor cell centrifugations
Cholera ToxinSigma, St.Louis, MOC8052-.5MGMCF10A Media additive
Conical tubes 15 mLVWR, Radnor, PA62406-200Collecting and resuspending cells
Countess II-FL Cell counterThermo Fisher, Waltham, MAAMQAF1000counting cells
Glass pipettes (10 mL)VWR, Radnor, PA76184-746cell resuspension
DMEM F:12Thermo Fisher, Waltham, MA11320033MCF10A basal media
DMEM 1XVWR, Radnor, PA10-014-CVMDA-MB-231 basal media
Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2)Lonza, Durham, NCCC-3156HUVEC basal media
Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2)Lonza, Durham, NCCC-3162Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors)
Alexa Fluor™ 488 PhalloidinThermo Fisher, Waltham, MALabelling MDA-MB-231 spheroids
Fetal Bovine serumCytiva, Logan, UTSH30071.03HUVEC/MDA-MB-231 media additive
Goat serumThermo Fisher, Waltham, MA16210064Immunofluorescence labelling component
GlycineSigma, St.Louis, MOG8898-500Gimmunofluorescence buffer component
Hoescht 33342Thermo Fisher, Waltham, MA62249Nuclei stain immunofluorescence
Horse SerumThermo Fisher, Waltham, MA16050130MCF10A Media additive
HydrocortisoneSigma, St.Louis, MOH0888-5GMCF10A Media additive
Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs)Cell applications, San Diego , CA200-05fEndothelial cell lines
Integrin α6Millipore, Billerica, MAMAB1378Immunofluorescence spheroid labelling component
Live Dead assayThermo Fisher, Waltham, MAL3224Live and dead cell stain assay for cell viability
LSM 700 Confocal microscopeZeiss, Thornwood, NYUsed to visualize cells
Matrigel - growth factor reduced 10 mg/mlVWR, Radnor, PA354230Spheroid formation
MCF10A cellsATCCCRL-10317Breast cell line
MDA-MB-231 cellsATCCHTB-26Breast cell line
ParaformaldehydeSigma, St.Louis, MO158127-500Gcell fixative
Penicillin and streptomycinThermo Fisher, Waltham, MA15140122MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive
Phosphate Buffered Saline 1X (PBS)Thermo Fisher, Waltham, MA7001106Wash buffer for cells before trypsinization
Phosphate buffer saline 10XThermo Fisher, Waltham, MAAM9625immunofluorescence buffer component
Prolong gold antifadeThermo Fisher, Waltham, MAP36934immunofluorescence mountant medium
Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGFPeprotech, Rocky Hill, NJAF-100-15MCF10A/ assay media component
Sodium AzideSigma, St.Louis, MOS2002-25Gimmunofluorescence buffer component
Sterile syringe (10 mL)VWR, Radnor, PA75846-757bioprinting process
Tissue culture dish (10cm)VWR, Radnor, PA25382-166monolayer cell culture
Triton X-100Sigma, St.Louis, MOT8787-250MLimmunofluorescence buffer component
Trypan blue 0.4%Thermo Fisher, Waltham, MA15250061cell counter additive
Trypsin-EDTA 0.05%Thermo Fisher, Waltham, MA25300054cell detachment
Tween -20Thermo Fisher, Waltham, MA85113immunofluorescence buffer component
Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165)Peprotech, Rocky Hill, NJ100-20HUVEC tube additive
Volocity 6.3 cell imaging softwarePerkinElmer, Hopkinton, MAZ stack compresser

References

  1. Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
  2. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  3. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  4. Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
  5. Sokol, E. S., et al. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 19(2016).
  6. Howlett, A. R., Bailey, N., Damsky, C., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Cellular growth and survival are mediated by beta 1 integrins in normal human breast epithelium but not in breast carcinoma. Journal of Cell Science. 108, Pt 5 1945-1957 (1995).
  7. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  8. Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
  9. Wang, F., et al. Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (25), 14821-14826 (1998).
  10. Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nature Cell Biology. 3 (9), 785-792 (2001).
  11. Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (2), 521-526 (2003).
  12. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111 (1), 29-40 (2002).
  13. Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2 (3), 205-216 (2002).
  14. Yamada, K. M., Clark, K. Cell biology: survival in three dimensions. Nature. 419 (6909), 790-791 (2002).
  15. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116, Pt 12 2377-2388 (2003).
  16. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
  17. Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 83-101 (2008).
  18. Sacharidou, A., et al. Endothelial lumen signaling complexes control 3D matrix-specific tubulogenesis through interdependent Cdc42- and MT1-MMP-mediated events. Blood. 115 (25), 5259-5269 (2010).
  19. Buchanan, C. F., et al. Cross-talk between endothelial and breast cancer cells regulates reciprocal expression of angiogenic factors in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (4), 1142-1151 (2012).
  20. Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. In vitro angiogenesis induced by tumor-endothelial cell co-culture in bilayered, collagen I hydrogel bioengineered tumors. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (11), 864-874 (2013).
  21. Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Stromal endothelial cells directly influence cancer progression. Science Translational Medicine. 3 (66), 66(2011).
  22. Franses, J. W., Drosu, N. C., Gibson, W. J., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Dysfunctional endothelial cells directly stimulate cancer inflammation and metastasis. International Journal of Cancer. 133 (6), 1334-1344 (2013).
  23. Phamduy, T. B., et al. Printing cancer cells into intact microvascular networks: a model for investigating cancer cell dynamics during angiogenesis. Integrative Biology. 7 (9), Cambridge. 1068-1078 (2015).
  24. Connor, Y., et al. Physical nanoscale conduit-mediated communication between tumour cells and the endothelium modulates endothelial phenotype. Nature Communications. 6, 8671(2015).
  25. Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nature Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
  26. Strilic, B., et al. Tumour-cell-induced endothelial cell necroptosis via death receptor 6 promotes metastasis. Nature. 536 (7615), 215-218 (2016).
  27. Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), Kidlington. 539-553 (2015).
  28. Belgodere, J. A., et al. Engineering Breast Cancer Microenvironments and 3D Bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66(2018).
  29. Jang, J., Yi, H. G., Cho, D. W. 3D Printed Tissue Models: Present and Future. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (10), 1722-1731 (2016).
  30. Sobrino, A., et al. 3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks. Scientific Reports. 6, 31589(2016).
  31. Chen, M. B., Whisler, J. A., Jeon, J. S., Kamm, R. D. Mechanisms of tumor cell extravasation in an in vitro microvascular network platform. Integrative Biology. 5 (10), Cambridge. 1262-1271 (2013).
  32. Hassell, B. A., et al. Human Organ Chip Models Recapitulate Orthotopic Lung Cancer Growth, Therapeutic Responses, and Tumor Dormancy In vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
  33. Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
  34. Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), 539-553 (2015).
  35. Zhao, Y., et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. 6 (3), 035001(2014).
  36. Zhang, Y. S., et al. Bioprinting the Cancer Microenvironment. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (10), 1710-1721 (2016).
  37. Ouyang, L., et al. Three-dimensional bioprinting of embryonic stem cells directs highly uniform embryoid body formation. Biofabrication. 7 (4), 044101(2015).
  38. Swaminathan, S., Ngo, O., Basehore, S., Clyne, A. M. Vascular Endothelial-Breast Epithelial Cell Coculture Model Created from 3D Cell Structures. ACS Biomaterials Science & Engineering. 3 (11), 2999-3006 (2017).
  39. Vorwald, C. E., Ho, S. S., Whitehead, J., Leach, J. K. High-Throughput Formation of Mesenchymal Stem Cell Spheroids and Entrapment in Alginate Hydrogels. Methods in Molecular Biology. 1758, 139-149 (2018).
  40. Chaji, S., Al-Saleh, J., Gomillion, C. T. Bioprinted Three-Dimensional Cell-Laden Hydrogels to Evaluate Adipocyte-Breast Cancer Cell Interactions. Gels. 6 (1), (2020).
  41. Swaminathan, S., Hamid, Q., Sun, W., Clyne, A. M. Bioprinting of 3D breast epithelial spheroids for human cancer models. Biofabrication. 11 (2), 025003(2019).
  42. Radisky, D., Muschler, J., Bissell, M. J. Order and disorder: the role of extracellular matrix in epithelial cancer. Cancer Investigation. 20 (1), 139-153 (2002).
  43. Qu, Y., et al. Evaluation of MCF10A as a Reliable Model for Normal Human Mammary Epithelial Cells. PLoS One. 10 (7), 0131285(2015).
  44. Chavez, K. J., Garimella, S. V., Lipkowitz, S. Triple negative breast cancer cell lines: one tool in the search for better treatment of triple negative breast cancer. Breast Disease. 32 (1-2), 35-48 (2010).
  45. Swaminathan, S., Cranston, A. N., Clyne, A. M. A Three-Dimensional In vitro Coculture Model to Quantify Breast Epithelial Cell Adhesion to Endothelial Cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (10), 609-618 (2019).
  46. Lee, J. M., et al. Generation of uniform-sized multicellular tumor spheroids using hydrogel microwells for advanced drug screening. Scientific Reports. 8 (1), 17145(2018).
  47. Frueh, F. S., Spater, T., Scheuer, C., Menger, M. D., Laschke, M. W. Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering. Journal of Visualized Experiments. (122), e55721(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

165 bioinks 3D spheroids

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved