JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא ישירות bioprint תאי אפיתל השד כמו כדוריות רב תאיות על רשתות אנדותל שנוצרו מראש כדי ליצור במהירות מודלים 3D השד אנדותל שיתוף תרבות אשר ניתן להשתמש בהם עבור מחקרים הקרנת סמים.

Abstract

Bioprinting מתגלה ככלי מבטיח לפברק מודלים של סרטן אנושי 3D כי טוב יותר לסכם סימני ההיכר הקריטיים של ארכיטקטורת רקמת vivo. בהדפסה ביולוגית של שחול שכבה אחר שכבה, תאים בודדים מובלטים בביו-ינק יחד עם רמזים מרחביים וטמפורליים מורכבים לקידום הרכבה עצמית של רקמות היררכיות. עם זאת, טכניקה זו biofabrication מסתמך על אינטראקציות מורכבות בין תאים, bioinks ורמזים ביוכימיים וביופיזיים. לכן, הרכבה עצמית עשויה להימשך ימים או אפילו שבועות, עשויה לדרוש bioinks ספציפי, ולא תמיד יכול להתרחש כאשר יש יותר מסוג תא אחד מעורב. לכן פיתחנו טכניקה להדפסה ביולוגית ישירה של ספירואידים אפיתל שד תלת-ממדיים שנוצרו מראש במגוון ביו-לינקים. ספירואידים אפיתל שד 3D מעוצבים מראש קיימו את הכדאיות שלהם ואת הארכיטקטורה המקוטבת לאחר ההדפסה. בנוסף הדפסנו את הכדורואידים בתלת-ממד על רשתות תאי אנדותל של כלי הדם כדי ליצור מודל של תרבות משותפת. לכן, טכניקת ההדפסה הביולוגית החדשה יוצרת במהירות מודל שד אנושי תלת מימדי רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית בעלות נמוכה יותר ועם גמישות גבוהה יותר מאשר טכניקות הדפסה ביולוגית מסורתיות. טכניקת ביו-הדפסה רב-תכליתית זו ניתנת להדפסה כדי ליצור מודלים תלת-ממדיים של רקמות אחרות בביו-ינקים נוספים.

Introduction

מודלים של גידולים במבחנה במבחנה הם כלים חיוניים למחקר מכני של צמיחת סרטן וגרורות. עבור סרטן השד בפרט, תאי אפיתל השד בתרבית Matrigel לארגן לתוך ספרואידים מקוטבים הדומים יותר לארכיטקטורה acinus ממארי in vivo1,2,3,4,5,6,7,8. 3D תרבית תאי אפיתל השד משפיע גם על תפקוד התא, עם תרביות 3D מראה הבדלים אפנון קולטן אפידרמיס (EGF)8,9; פונקציית אונקוגן, כולל ErbB210; צמיחה ואפופטוזיס איתות11,12; והתנגדותכימותרפית 13,14. תאי אנדותל כלי דם מגיבים באופן דומה באופן שונה לגירויים סביבתיים בתלת מימד לעומת תרבות דו מימדית מסורתית15,16,17,18. עם זאת, רוב ההבנה של אינטראקציות אנדותל ושד כלי הדם אפיתל מגיע תרבות 2D באמצעות בינוני מותנה או Transwell מוסיף, או מודלים 3D שבו שני סוגי התאים מופרדים פיזית19,20,21,22,23. מודלים אלה של תרבות משותפת מספקים תובנה פיזיולוגית מוגבלת, שכן הן תרבות 3D והן מגע תאים הם קריטיים אנדותל כלי הדם – אינטראקציות תא אפיתל השד24,25,26.

מודלים סרטן 3D כבר מפוברק באמצעות מגוון רחב של טכניקות, כולל היווצרות ספירואיד טיפה תלויה, bioprinting, הרכבה מגנטית, ותרבות בתוך הידרוג'לים או על פיגומים מהונדסים5,27,28,29. לאחרונה, מודלים גידול 3D נוצרו עם סוגי תאים מרובים מסודרים במבנים 3D בהתאמה שלהם. בדוגמה אחת של פלטפורמת גידול על שבב, סרטן, אנדותל, תאים סטרומה היו מעורבבים לתוך מטריצה ולאחר מכן מוזרק לתוך שלושת תאי הרקמה המרכזיים במכשיר polydimethylsiloxane (PDMS). תאי הרקמה היו גובלים בשני ערוצים חוץים שייצגו עורק ונוזל. לאחר 5-7 ימים של תרבות, תאי אנדותל יצרו רשת microvascular ותאי סרטן התפשטו כדי ליצור גידולים קטנים ליד כלי הדם. פלטפורמה זו שימשה אז כדי לסנן סמים ושילובי סמים30. פלטפורמות נוספות לגידול על שבב נוצרו כדי לחקור גרורות וסוגי סרטן עם גירויים מכניים ספציפיים (למשל, זן מכני בריאה)31,32. עם זאת, פלטפורמות אלה בדרך כלל אינן כוללות הן כלי דם וסרטן במבנים 3D בהתאמה שלהם.

Biofabrication מראה הבטחה גדולה בקידום 3D במודלים גידולים במבחנה כלי דם, שכן הוא מאפשר שליטה מרחבית הדוקה על מיקום התא. למרות הצמיחה של bioprinting בעשור האחרון, מחקרים מעטים להתמקד במיוחד על גידולים33,34. בדוגמה אחת, הדפסה תלת מימדית של תאי HeLa בהידרוגל ג'לטין/אלגינט/פיברינוגן שימשה ליצירת מודל סרטן צוואר הרחם במבחנה. תאים סרטניים הודפסו ביולוגית כתאים בודדים ולאחר מכן הורשו ליצור ספרואידים, אשר הראו קצב התפשטות גבוה יותר, ביטוי מטאלופרוטאינאז מטריצה מוגברת, ו chemoresistance גבוה יותר מאשר תאים בתרבות 2D35. במחקרים אלה, כמו רבים אחרים36,37, השעיות תאים מנותקים הודפסו ביולוגית, ולאחר מכן תרביות התא סופקו עם רמזים מכניים וביוכימיים הנדרשים כדי לאפשר לתאים ליצור מבנה 3D. עם זאת, הרכבה עצמית תאית עשויה להימשך ימים או שבועות, עשויה לדרוש רמזים סביבתיים מרחביים וטמפורליים מורכבים, או לא להתרחש כאשר שני סוגי תאים הם תרבית משותפת. לדוגמה, תאי אפיתל השד גרמו למוות תאי בתאי אנדותל בתרבית דו-ממדית, ותאי אפיתל שד מנותקים לא נוצרו כדוריות תלת-ממדיות כאשר הודפסו ביולוגית באלגינאט/ג'לטין הידרוג'ל38. אפיתל שד מנותק או תאים סרטניים יצרו ספרואידים בביוינקים מבוססי אלגינט רק כאשר נלכדו בתבניות PDMS עגולות. במקרים אחרים, spheroids נוצרו באמצעות טיפות מושעה בלוחות באר עגולים מצורף אולטרה נמוך ולאחר מכן מעורבב לתוך bioinks מבוסס אלגינט39,40.

כעת אנו מתארים שיטה חלופית 3D רקמה biomanufacturing בפרוטוקול זה. במקום לזרוע תאים מנותקים ולחכות שתאים אלה ייצרו את המבנים תלת-ממדיים, אנו מתארים כיצד ליצור ולהדפיס ביולוגית ספרואידים של גידולים תלת-ממדיים ברשת צינור כלי דם כדי ליצור מודל תרבות-שיתוף גידולים שניתן להשתמש בו כמעט מיד. ניתן לגדל ספרואידים של גידולים במבחנה או להפיקם מרקמות אנושיות (אורגנואידים). באופן דומה, צינורות כלי דם ניתן לגדל או יכול להיגזר שברים microvascular רקמת שומן. Bioinks יכול לנוע בין אלגינט פעיל ביולוגית כדי Matrigel פעיל מאוד ביולוגית41. מאז מודל זה 3D גידול שיתוף תרבות יכול להיווצר עם מגוון רחב של מבני תאים bioinks, זה יכול לשלב סוגי תאים מרובים, מטריצות חוץ תאיות, ומדרגי כימוקין15,42. בעוד בניסוח הנוכחי שלה, רשתות אנדותל לא ניתן לחדור, איטרציות עתידיות יכול לשלב שיטה זו עם microfluids או על שבב מערכות. הדפסה ביולוגית של ספירואידים אפיתל שד תלת מימדי על רשתות אנדותל מאפשרת ביופבריציה מהירה של מודלים של השד האנושי לבדיקות סמים ורפואה מדויקת מותאמת אישית27.

Protocol

1. צמיחת תאי אפיתל השד ומדיה Assay

  1. MCF10A תאי אפיתל השד
    הערה: קו תאי אפיתל השד המונצח שאינו גידולי נגזר מחולה עם מחלה פיברוציסטית43. תאים אינם מבטאים קולטן אסטרוגן.
    1. כדי להכין 20 מיקרוגרם / מ"ל גורם גדילה אפידרמיס (EGF), להמיס 100 מיקרוגרם של EGF lyophilized ב 500 μL של dH סטרילי2O לעשות 200 מיקרוגרם / מ"ל EGF. הוסף 500 μL של 200 מיקרוגרם / מ"ל EGF לתוך 4.5 מ"ל של סטרילי 0.1% BSA ב dH2O לעשות פתרון EGF 20 מיקרוגרם / מ"ל. חנות מוכנה 20 מיקרוגרם / מ"ל EGF aliquots ב -20 מעלות צלזיוס עד 12 חודשים.
    2. כדי להכין 500 מיקרוגרם / מ"ל הידרוקורטיזון, לדלל 1 מ"ג של הידרוקורטיזון ב 1 מ"ל של אתנול מוחלט (200 הוכחה). הוסף 1 מ"ל של DMEM F:12 סטרילי לתערובת זו כדי להפוך פתרון 500 מיקרוגרם / מ"ל הידרוקורטיזון מלאי. חנות הידרוקורטיזון מניות aliquots ב -80 °C (60 °F) עד 12 חודשים.
    3. כדי להכין 10 מיקרוגרם / מ"ל רעלן כולרה, להמיס 1 מ"ג של אבקת כולרה רעלן lyophilized ב 1 מ"ל של dH סטרילי2O כדי להפוך 1 מ"ג / מ"ל כולרה רעלן פתרון מלאי. חנות כולרה רעלן aliquots מלאי ב -80 מעלות צלזיוס עד 12 חודשים.
    4. כדי להכין את מדיום הצמיחה, להוסיף 500 μL של EGF (20 מיקרוגרם / מ"ל), 500 μL של הידרוקורטיזון (500 מיקרוגרם / מ"ל), 5 μL של רעלן כולרה (1 מ"ג / מ"ל), 500 μL של אינסולין שור (10 מ"ג / מ"ל), 10 מ"ל של פניצילין ואסטרטומיצין, ו 25 מ"ל של סרום סוס ל 500 מ"ל של DMEM F:12 עבור ריכוז סופי של 20 ng / mL EGF, 500 ng/mL הידרוקורטיזון, 10 ng/mL רעלן כולרה, 10 ng/mL אינסולין שור, 2% v / v פניצילין סטרפטומיצין, ו 5% v / v סרום סוס. ריכוז אנטיביוטי הוגדל ל 2% כדי להסביר את הסטריליות ירד בתהליך ההדפסה הביולוגית; עם זאת, ריכוז אנטיביוטי ניתן להוריד ל 1%.
    5. כדי להכין Assay בינוני, להוסיף 500 μL של הידרוקורטיזון (500 מיקרוגרם / מ"ל), 5 μL של רעלן כולרה (1 מ"ג / מ"ל), 500 μL של אינסולין שור (10 מ"ג / מ"ל), 10 מ"ל של פניצילין וסטרפטומיצין, ו 25 מ"ל של סרום סוס ל 500 מ"ל של DMEM F:12 עבור ריכוז סופי של 500 ng / mL הידרוקורטיזון, 10 ng / mL רעלן כולרה, 10 ng / mL אינסולין שור, 2% v / v פניצילין ו סטרפטומיצין, ו 5% v / v סרום סוס.
  2. מד"א-מגה-231
    הערה: משולש שלילי (חסר קולטן אסטרוגן, קולטן פרוגסטרון, קולטן גורם גדילה אפידרמיס 2) קו תא אפיתל סרטן השד נוצר תפליט pleural של חולה נקבה עם אדנוקרצינומה mammary גרורתי44. התאים מייצגים סרטן שד אגרסיבי, פולשני ומובחן בצורה גרועה.
    1. כדי להכין את הצמיחה ואת Assay בינוני, להוסיף 50 מ"ל של סרום שור עוברי, 10 מ"ל של פניצילין וסטרפטומיצין, ו 25 מ"ל של סרום סוס ל 500 מ"ל של DMEM לריכוז סופי 10% v / v סרום שור עוברי, 2% v / v פניצילין ו סטרפטומיצין, ו 5% v / v סרום סוס.

2. תרבות תאי אפיתל השד

  1. זרע 500,000 MCF10A או MDA-MB-231 תאים בצלחת 10 ס"מ (P100) תרבית רקמה עם 10 מ"ל של MCF10A או MDA-MB-231 מדיה צמיחה. תאי MCF10A ומד"א-MB-231 מגיעים ל-90% מפגשים ב-48 שעות.
  2. כדי לעבור תאים אפיתל השד, הראשון לשטוף תאים עם 10 מ"ל של PBS חם.
  3. נתק תאי אפיתל השד על ידי הוספת 2 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA למנה. מניחים את המנה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 אינקובטור במשך 20-25 דקות.
  4. הוסף 5 מ"ל של MCF10A או MDA-MB-231 בינוני צמיחה לתאים טריפסיניזציה כדי לנטרל את הנסיון. פיפטה תערובת מדיה סלולרית למעלה ולמטה כדי resuspend תאים לשבור אשכולות תאים.
  5. מוסיפים את השעיית התא לצינור חרוט 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 1,200 x גרם במשך 3 דקות. בזהירות לשאוף את supernatant ו resuspend גלולה התא ב 5 מ"ל של MCF10A או MDA-MB-231 צמיחה בינוני.
  6. צלחת 1 מ"ל של השעיית תאים ב 5 חדש 10 ס"מ רקמות תרבית מנות יחד עם MCF10A או MDA-MB-231 צמיחה בינוני. מניחים את הכלים באינקובטור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. התאים יהיו מוכנים למעבר שוב בעוד 2-3 ימים. ניתן לשמור על תאי MCF10A למעבר מספר 35, ולאחר מכן הם מראים שינויים מורפולוגיים. תאי מד"א-MB-231 יכולים להישמר למעבר מספר 24, ולאחר מכן הם מראים שינויים מורפולוגיים.

3. היווצרות ספירואיד אפיתל השד

  1. להקפיא 200 טיפים פיפטה μL במשך 30 דקות לפני תחילת ההסתעפות. שמור על תמיסת מטריצה מופחתת גורמי גדילה (למשל, Matrigel) (10 מ"ג/מ"ל) על הקרח לאורך כל התהליך.
  2. לאט פיפטה 30 μL של פתרון מטריצה קרה כקרח באמצעות קר כקרח 200 טיפים פיפטה μL לתוך כל באר של שקופית 8 באר. התחל מהצדדים וגרור את קצה פיפטה לאורך הפינות, הוספת טיפה סופית למרכז הבאר כדי להבטיח אפילו ציפוי של כל באר. הימנע בועות אוויר במהלך שלב זה כדי להבטיח שכבת פתרון מטריצה אחידה. השתמש טיפים פיפטה חדשה עבור כל באר.
  3. שקופיות תא דגירה ב 37 °C (70 °F), 5% CO2 אינקובטור במשך 15-20 דקות כדי polymerize פתרון המטריצה.
  4. Resuspend תאי MCF10A טריפסין ב MCF10A Assay בינוני ב 200,000 תאים / מ"ל או resuspend תאי מד"א-MB-231 במדיום צמיחה MDA-MB-231 ב 200,000 תאים / מ"ל.
  5. אם אתם משתמשים בתאי MCF10A, הכינו מדיום צמיחה ספירואידי חדש MCF10A על ידי הוספת 5 μL של EGF (20 מיקרוגרם/מ"ל) ו-100 מיקרו-ל' של פתרון מטריצה ל-5 מ"ל של Assay Medium לריכוז סופי של 2% פתרון מטריצה.
  6. הסר את שקופית התא מראש עם תמיסת מטריצה מהחממה. הוסף 50 μL של MCF10A או MDA-MB-231 התא השעיה (10,000 תאים) לכל באר. אם אתם משתמשים בתאי MCF10A, הוסיפו 450 מיקרו-ל' של מדיום צמיחה כדורי MCF10A. אם אתם משתמשים בתאי MDA-MB-231, הוסיפו 450 מיקרו-ל' של MDA-MB-231 Growth Medium עם 2% פתרון מטריצה (9 μL). מקם באופן מיידי את שקופית התא באינקובטור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
  7. החלף את המדיום כל 44 ימים. בזהירות פיפטה 200 μL של מדיה ישנה החוצה מפינה אחת של כל באר באמצעות קצה פיפטה 200 μL. במהלך תהליך זה, הטה את שקופית התא ב- 45° כדי להבטיח שהספרואידים לא יפריעו. הוסף 200 μL של בינוני צמיחה כדורית MCF10A שהוכן טרי או MDA-MB-231 צמיחה בינוני מעורבב בעבר עם 2% פתרון מטריצה לכל באר בפינה בטיפות כדי להבטיח כי spheroids להישאר מחובר לשכבת המטריצה. רק ~ 50% מהמדיה מוחלפת כך שכל הציטוקינים המיוצרים על ידי הכדורואידים אינם מרוקנים לחלוטין.
    הערה: ספירואידים אפיתל השד MCF10A לקחת עד 8 ימים כדי קיטוב וליצור מרכזים חלולים. ספירואידים אפיתל שד MDA-MB-231 לקחת עד 5 ימים כדי ליצור ואין מרכזים חלולים.

4. היווצרות רשת תאי אנדותל

  1. תרבות תא אנדותל של וריד טבור אנושי (HUVEC)
    1. הוסף את התוכן של ערכת גדילה אנדותל אחת בינונית-2 המכילה פקטורי גדילה של אינסולין, גורם גדילה fibroblast, גורם הגדילה אנדותל כלי הדם, חומצה אסקורבית, גורם גדילה אפידרמיס, הפרין וגנטמיצין-אמפוטריצין B, יחד עם 50 מ"ל של סרום שור עוברי, 5 מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין ו-5 מ"ל של 200 מ"מ גלוטמין עד 500 מ"ל של בזל אנדותל בינוני-2 (EBM-2) ליצירת מדיום צמיחה אנדותל מלא (EGM-2).
    2. זרע 500,000 תאי אנדותל בצלחת תרבית רקמות 10 ס"מ ב 10 מ"ל של EGM-2. מניחים תאים באינקובטור 37 °C (67 °F), 5% CO2 עד שהם מגיעים >80% מפגש (סביב 48 שעות).
    3. לתאי מעבר, לשטוף תאי אנדותל עם 10 מ"ל של PBS חם. נתק HUVEC על ידי הוספת 2 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA לצלחת תרבית רקמות 10 ס"מ. נטר מקרוב את התאים לפי מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה. התאים מוכנים כאשר הם כדור למעלה אבל להישאר מחוברים לצלחת.
    4. בזהירות לשאוף את טריפסין מתוך המנה. מוסיפים 8 מ"ל של EGM-2 למנה. לשטוף תאים את המנה על ידי pipeting EGM-2 למעלה ולמטה על פני כל משטח המנה.
    5. לחלופין, להוסיף 5 מ"ל של EGM-2 לתאים טריפסיניזציה כדי לנטרל את טריפסין. פיפטה תערובת מדיה סלולרית למעלה ולמטה כדי resuspend תאים לשבור אשכולות תאים. מוסיפים את השעיית התא לצינור חרוט 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 1,200 x גרם במשך 3 דקות. בזהירות לשאוף את supernatant ו resuspend גלולת התא ב 10 מ"ל של EGM-2.
    6. הוסף 1 מ"ל של השעיית תאים ל 9 מ"ל של EGM-2 בצלחת תרבית רקמות 10 ס"מ. מניחים את הכלים באינקובטור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. החלף 2/3 של המדיום עם EGM-2 טרי כל יומיים. התאים יהיו מוכנים למעבר בעוד 3-5 ימים. HUVEC יכול להישמר עד קטע 8 שלאחרו הם נכשלים ליצור רשתות.
  2. היווצרות רשת של תאי אנדותל (HUVEC)
  3. להקפיא 200 טיפים פיפטה μL במשך 30 דקות לפני תחילת ההסתעפות. שמור על תמיסת מטריצה מופחתת גורמי גדילה (10 מ"ג/מ"ל) על הקרח לאורך כל התהליך.
  4. לאט פיפטה 30 μL של פתרון מטריצה קרה כקרח באמצעות קר כקרח 200 טיפים פיפטה μL לתוך כל באר של שקופית 8 באר. התחל מהצדדים וגרור את קצה פיפטה לאורך הפינות, הוספת טיפה סופית למרכז הבאר כדי להבטיח אפילו ציפוי של כל באר. הימנע בועות אוויר במהלך שלב זה כדי להבטיח שכבת פתרון מטריצה אחידה. השתמש טיפים פיפטה חדשה עבור כל באר.
  5. שקופיות תא דגירה באינקובטור 37 °C (77 °F), 5% CO2 חממה במשך 15-20 דקות כדי polymerize Matrigel.
    1. טרום כתם צלחת 10 ס"מ של HUVEC עם 10 μL של גשש תא אדום (1:1000) במשך 30 דקות ב 37 °C (70 °F), 5% CO2 חממה.
    2. לשטוף תאי אנדותל עם 10 מ"ל של PBS חם. נתק HUVEC על ידי הוספת 2 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA לצלחת תרבית רקמות 10 ס"מ. מניחים את המנה באינקובטור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 במשך 5 דקות כדי לנתק את התאים באופן מלא.
    3. מוסיפים 5 מ"ל של EGM-2 למנה כדי לנטרל את טריפסין. העבר את השעיית התא לצינור חרוט 25 מ"ל. צנטריפוגה HUVEC ב 1,200 x g במשך 5 דקות. לשאוף את supernatant ולהשתוב מחדש את גלולת התא ב 5 מ"ל של EBM-2 ללא סרום.
    4. ספירת תאים באמצעות כחול Trypan כדי לקבוע תאים קיימא. צור פתרון של 1 x10 6 תאים/מ"ל.
    5. הוסף 100,000 HUVEC לכל באר עם 200 μL של סרום חינם EBM-2. אם יתווספו תאים נוספים, הם ייצרו מונולייר משטח ולא רשת שפופרת.
    6. דגירה HUVEC ב 37 °C (69 °F), 5% CO2 חממה. לאחר 6 שעות, תמונות HUVEC רשתות על ידי מיקרוסקופיית ניגוד פאזה. הרשתות מוכנות כעת לשיתוף פעולה עם ספירואידים בשד.

5. הדפסה ביולוגית של ספירואידים אפיתל השד על רשתות HUVEC הוקמה מראש

הערה: יש להשתמש במערכת תצהיר ביולוגית עם חרירים כפולים לתהליך ההבריה הביולוגית. במקרה זה, למערכת היו שלוש זרועות תנועה כדי לאפשר שליטה מרחבית בקנה מידה מיקרון של תצהיר חומר, כמו גם שני מנועים מונעי בורג להפקיד bioink מ 10 מזרקים מ"ל. המערכת צריכה להיות פונקציונלית עם מערכת סינון אוויר חלקיקי יעילות גבוהה, כמו גם יכולות עיקור UV כדי לשמור על סביבה סטרילית במהלך ההדפסה הביולוגית. הביופרינט הוא UV מעוקר במשך שעה לפני תהליך ההדפסה.

  1. צור ספירואידים אפיתל השד ורשתות HUVEC כפי שתואר קודם לכן. להעריך את מספר ספירואידים אפיתל השד בכל באר על ידי ספירת ספרואידים בתמונות מיקרוסקופיות ניגוד שלב ייצוגי.
  2. חותכים 0.5 ס"מ מקצה קצה פיפטה 1000 μL. השתמש קצה פיפטה לחתוך בזהירות פיפטה כל spheroids מתוך שקופית תא 8 באר לתוך צינור 50 מ"ל. ספירואידים לקצבה בביוינק שנבחר ב 100 ספרואידים / 100 μL.
    הערה: ריכוזי ספרואידים גבוהים יותר עלולים לגרום לקיבוץ ספרואידים ולמנוע הדמיה של אינטראקציות בין הספרואידים לרשתות האנדותל.
  3. מעבירים את תערובת הספרואידים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי להסיר כל ספרואידים גדולים או מקובצים באשכולות.
  4. לטעון את spheroids בריכה לתוך מזרק סטרילי 10 מ"ל לכסות אותו עם מחט סטרילית 25-מד. חבר את המזרק למערכת התצהיר הביולוגי.
  5. שאפו את המדיום מרשתות HUVEC בשקופית התאית בעלת 8 הבארות.
  6. Extrude 100 μL של ספירואידים אפיתל השד על 6 בארות של רשתות HUVEC בקצב זרימה של 1 מ"ל / דקה. לשמור על 2 בארות של רשתות HUVEC כפקדים.
  7. הוסף 400 μL של בינוני צמיחה כדורית MCF10A אם באמצעות כדורי MCF10A מודפס על רשתות HUVEC או להוסיף 400 μL MDA-MB-231 צמיחה בינוני מעורבב בעבר עם פתרון מטריצה 2% אם באמצעות MDA-MB-231 כדורי מודפס על רשתות HUVEC. יש להשתמש במדיום הצמיחה הספרואידי המתאים בבארות בקרה של HUVEC.
  8. דגירה תרבויות שותף ב 37 °C (77 °F), 5% CO2 חממה במשך 24 - 96 שעות ללא שינוי מדיה. תרבויות משותפות יישארו בנות קיימא במדיום המקורי עד ארבעה ימים.

6. מיקרוסקופיה קונפוקלית

  1. אימונופלואורסצנטיות והכנת מאגר שטיפת PBS-גליצין
    1. הכן Immunofluorescence (IF) מאגר 10x פתרון מלאי על ידי הוספת 2.5 גרם של נתרן אזיד, 5 גרם של אלבומין סרום שור, 10 מ"ל של טריטון X-100, ו 2.05 מ"ל של Tween-20 ב 500 מ"ל של 10x PBS. כוונן את ה-pH ל-7.4. אחסן את פתרון המלאי עד שנה ב- 4 °C (60 °F) כדי למנוע משקעים.
    2. צור מאגר IF פועל על-ידי דילול 50 מ"ל של מאגר IF 10x ב- 450 מ"ל של מים שעברו דה-יון סטריליים. אחסן את פתרון העבודה בטמפרטורת החדר עד שבוע.
    3. הכן פתרון מלאי מאגר PBS-גליצין 10x על-ידי הוספת 37.5 גרם גליצין ל- 500 מ"ל של 10x PBS. כוונן את ה-pH ל-7.4. אחסן את פתרון המלאי עד 6 חודשים ב- 4 °C (6 °F) כדי למנוע משקעים.
    4. צור פתרון PBS-גליצין עובד על ידי דילול 50 מ"ל של 10x PBS-גליצין מאגר ב 450 מ"ל של מים שעברו דה-יון סטרילי. אחסן את פתרון העבודה ב- 4 °C (60 °F) למשך שבוע.
  2. תווית דגימות מודפסות ביולוגית ותמונה לפי מיקרוסקופיה קונפוקלית
    1. שאפו מדיום מתרבויות תלת-ממדיות בעלות הדפסה ביולוגית ושטוף 3 פעמים עם PBS חם. תקן תרביות תלת-ממדיות מודפסות ביולוגית עם 4% paraformaldehyde למשך שעה בטמפרטורת החדר. יש לשטוף דגימות 3 פעמים למשך 20 דקות עם 1x PBS-גליצין.
    2. חסום דגימות עם מאגר IF מעורבב עם סרום עזים 10% במשך 90 דקות (בלוק ראשי), ואחריו 40 דקות עם מאגר IF בתוספת 10% סרום עיזים ושבר Fab Affinipure (1:100, בלוק משני).
    3. אם משתמשים בספרואידים MCF10A, יש לסמן דגימות עם נוגדן ראשוני לאונטגרין α6 (1:100) במאגר חסימה משני בן לילה ב-4 מעלות צלזיוס, ואחריו נוגדן משני Alexa Fluor 488 (1:200) והושט 33342 (1:1000) לשעה אחת בטמפרטורת החדר המוגנת מפני אור. קווי התאים MCF10A מבטאים רמות גבוהות של אונטגרין α6, החיוני להצגת קיטוב ספירואידי ומורפולוגיה.
    4. אם משתמשים במד"א-MB-231 spheroids, המבטאים רמות נמוכות של integrin α6, יש לסמן דגימות עם Alexa Fluor 488 phalloidin (1:100) והושט 33342 (1:1000) במאגר חסימה משני למשך 4 שעות בטמפרטורת החדר המוגנת מפני אור. פאלודין מאפשר הדמיה של חוטי אקטין כך שניתן להעריך מורפולוגיה אמורפית ופולשנית כדורית.
    5. לשטוף דגימות עם 1X PBS-גליצין 3 פעמים במשך 20 דקות.
    6. הכן דוגמאות להרכבה על-ידי הסרת שקופית התא באמצעות כלי היצרן. הוסף טיפה קטנה של פתרון נגד פשתן לכל באר. מניחים כיסוי 22 מ"מ x 60 מ"מ על כל שקופית תא ולאטום בזהירות את הקצוות עם לק ברור.
    7. דגימות תמונה באמצעות מיקרוסקופ confocal כמו ערימות Z של ~ 10 פרוסות ב 5 צעדים מיקרומטר. אם תרצה, דחוס מישורי Z למישור יחיד באמצעות הפקודה Extended Focus בתוכנת דימות תאים.
    8. כימות הידבקות כדורית לרשתות אנדותל באמצעות Image J. מספר spheroids דבק ניתן לכמת באמצעות תוסף לנתח עם גודל החלקיקים המתאים מעגליות. נרמלו את מספר הספרואידים המצורפים לאזור התמונה.
    9. כדי להבטיח יכולת לשחזור, כימת את מספר הכדורים הדבקים ב- 4 x 4 תמונות אריחים של תרבויות משותפות. אם מספר הכדורים נמוך סטטיסטית מניסויים אחרים, יש לחזור על הניסוי.

תוצאות

תאי אפיתל השד צריך להתארגן עצמית לתוך 3D spheroids לאחר 5-8 ימים של תרבות על פתרון מטריצה במדיום תרבות עם 2% פתרון מטריצה. כדורי אפיתל שאינם גידוליים של שד MCF10A צריכים להופיע עגולים ויש להם מרכז חלול, עם אינגרין α6 מקוטב לקצה החיצוני של הספרואיד(איור 1,inset מראה מרכזים חלולים). תאי אפית?...

Discussion

פרוטוקול זה הוא הראשון מסוגו להדפסה ביולוגית של ספרואידים בארכיטקטורת תלת-ממד שלהם לתרבות משותפת עם תאי אנדותל גם בארכיטקטורת תלת-ממד שלהם. צעדי פרוטוקול קריטיים כוללים היווצרות ראשונית של ספירואידים אפיתל השד ורשתות HUVEC. יש לנקוט משנה זהירות בהאכלת ספירואידים אפיתל, שכן הם מופרעים בקלו?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי NIH 1R01HL140239-01 ל- AMC. ברצוננו להודות למרכז להדמיית תאים באוניברסיטת דרקסל.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
37°C incubator, 5% CO2 and 95% humiditySanyoMCO-20AICCell incubation
3D Bio printercustom-madeNoneUsed for bioprinting
8-well chamber slidesVWR, Radnor, PA53106-306for seeding spheroids
25-gauge needleSigma, St. Louis, MOZ192406-100EAbioprinting syringe needle
Absolute ethanol (200 proof )Sigma, St.Louis, MOE7023-500MLreconsitution of media components
Affinipure F(ab′)2 fragment goat anti-mouse IgGJackson ImmunoResearch, West Grove, PA115006020secondary block - Immunofluorescence
Alexa Fluor 488 (1:200)Thermo Fisher, Waltham, MAA-11006Seconday antibody-Immunofluorescence
Bovine insulinSigma, St.Louis, MOI-035-0.5MLMCF10A Media additive
Bovine serum albumin (BSA)Sigma, St.Louis, MOA2153-500GBlocking agent -Immunofluorescence
Falcon 70 µm Cell StrainerCorning, Corning, NY352350Remove large or clustered spheroids
CellTracker™ Red CMTPX DyeThermo Fisher, Waltham, MAC34552pre-stain for HUVEC tubes
Compact CentrifugeHermle- Labnet, Edison ,NJZ206AFor cell centrifugations
Cholera ToxinSigma, St.Louis, MOC8052-.5MGMCF10A Media additive
Conical tubes 15 mLVWR, Radnor, PA62406-200Collecting and resuspending cells
Countess II-FL Cell counterThermo Fisher, Waltham, MAAMQAF1000counting cells
Glass pipettes (10 mL)VWR, Radnor, PA76184-746cell resuspension
DMEM F:12Thermo Fisher, Waltham, MA11320033MCF10A basal media
DMEM 1XVWR, Radnor, PA10-014-CVMDA-MB-231 basal media
Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2)Lonza, Durham, NCCC-3156HUVEC basal media
Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2)Lonza, Durham, NCCC-3162Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors)
Alexa Fluor™ 488 PhalloidinThermo Fisher, Waltham, MALabelling MDA-MB-231 spheroids
Fetal Bovine serumCytiva, Logan, UTSH30071.03HUVEC/MDA-MB-231 media additive
Goat serumThermo Fisher, Waltham, MA16210064Immunofluorescence labelling component
GlycineSigma, St.Louis, MOG8898-500Gimmunofluorescence buffer component
Hoescht 33342Thermo Fisher, Waltham, MA62249Nuclei stain immunofluorescence
Horse SerumThermo Fisher, Waltham, MA16050130MCF10A Media additive
HydrocortisoneSigma, St.Louis, MOH0888-5GMCF10A Media additive
Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs)Cell applications, San Diego , CA200-05fEndothelial cell lines
Integrin α6Millipore, Billerica, MAMAB1378Immunofluorescence spheroid labelling component
Live Dead assayThermo Fisher, Waltham, MAL3224Live and dead cell stain assay for cell viability
LSM 700 Confocal microscopeZeiss, Thornwood, NYUsed to visualize cells
Matrigel - growth factor reduced 10 mg/mlVWR, Radnor, PA354230Spheroid formation
MCF10A cellsATCCCRL-10317Breast cell line
MDA-MB-231 cellsATCCHTB-26Breast cell line
ParaformaldehydeSigma, St.Louis, MO158127-500Gcell fixative
Penicillin and streptomycinThermo Fisher, Waltham, MA15140122MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive
Phosphate Buffered Saline 1X (PBS)Thermo Fisher, Waltham, MA7001106Wash buffer for cells before trypsinization
Phosphate buffer saline 10XThermo Fisher, Waltham, MAAM9625immunofluorescence buffer component
Prolong gold antifadeThermo Fisher, Waltham, MAP36934immunofluorescence mountant medium
Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGFPeprotech, Rocky Hill, NJAF-100-15MCF10A/ assay media component
Sodium AzideSigma, St.Louis, MOS2002-25Gimmunofluorescence buffer component
Sterile syringe (10 mL)VWR, Radnor, PA75846-757bioprinting process
Tissue culture dish (10cm)VWR, Radnor, PA25382-166monolayer cell culture
Triton X-100Sigma, St.Louis, MOT8787-250MLimmunofluorescence buffer component
Trypan blue 0.4%Thermo Fisher, Waltham, MA15250061cell counter additive
Trypsin-EDTA 0.05%Thermo Fisher, Waltham, MA25300054cell detachment
Tween -20Thermo Fisher, Waltham, MA85113immunofluorescence buffer component
Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165)Peprotech, Rocky Hill, NJ100-20HUVEC tube additive
Volocity 6.3 cell imaging softwarePerkinElmer, Hopkinton, MAZ stack compresser

References

  1. Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
  2. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  3. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  4. Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
  5. Sokol, E. S., et al. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 19 (2016).
  6. Howlett, A. R., Bailey, N., Damsky, C., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Cellular growth and survival are mediated by beta 1 integrins in normal human breast epithelium but not in breast carcinoma. Journal of Cell Science. 108, 1945-1957 (1995).
  7. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  8. Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
  9. Wang, F., et al. Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (25), 14821-14826 (1998).
  10. Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nature Cell Biology. 3 (9), 785-792 (2001).
  11. Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (2), 521-526 (2003).
  12. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111 (1), 29-40 (2002).
  13. Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2 (3), 205-216 (2002).
  14. Yamada, K. M., Clark, K. Cell biology: survival in three dimensions. Nature. 419 (6909), 790-791 (2002).
  15. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116, 2377-2388 (2003).
  16. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
  17. Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 83-101 (2008).
  18. Sacharidou, A., et al. Endothelial lumen signaling complexes control 3D matrix-specific tubulogenesis through interdependent Cdc42- and MT1-MMP-mediated events. Blood. 115 (25), 5259-5269 (2010).
  19. Buchanan, C. F., et al. Cross-talk between endothelial and breast cancer cells regulates reciprocal expression of angiogenic factors in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (4), 1142-1151 (2012).
  20. Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. In vitro angiogenesis induced by tumor-endothelial cell co-culture in bilayered, collagen I hydrogel bioengineered tumors. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (11), 864-874 (2013).
  21. Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Stromal endothelial cells directly influence cancer progression. Science Translational Medicine. 3 (66), 66 (2011).
  22. Franses, J. W., Drosu, N. C., Gibson, W. J., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Dysfunctional endothelial cells directly stimulate cancer inflammation and metastasis. International Journal of Cancer. 133 (6), 1334-1344 (2013).
  23. Phamduy, T. B., et al. Printing cancer cells into intact microvascular networks: a model for investigating cancer cell dynamics during angiogenesis. Integrative Biology. 7 (9), 1068-1078 (2015).
  24. Connor, Y., et al. Physical nanoscale conduit-mediated communication between tumour cells and the endothelium modulates endothelial phenotype. Nature Communications. 6, 8671 (2015).
  25. Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nature Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
  26. Strilic, B., et al. Tumour-cell-induced endothelial cell necroptosis via death receptor 6 promotes metastasis. Nature. 536 (7615), 215-218 (2016).
  27. Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), 539-553 (2015).
  28. Belgodere, J. A., et al. Engineering Breast Cancer Microenvironments and 3D Bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66 (2018).
  29. Jang, J., Yi, H. G., Cho, D. W. 3D Printed Tissue Models: Present and Future. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (10), 1722-1731 (2016).
  30. Sobrino, A., et al. 3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks. Scientific Reports. 6, 31589 (2016).
  31. Chen, M. B., Whisler, J. A., Jeon, J. S., Kamm, R. D. Mechanisms of tumor cell extravasation in an in vitro microvascular network platform. Integrative Biology. 5 (10), 1262-1271 (2013).
  32. Hassell, B. A., et al. Human Organ Chip Models Recapitulate Orthotopic Lung Cancer Growth, Therapeutic Responses, and Tumor Dormancy In vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
  33. Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
  34. Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), 539-553 (2015).
  35. Zhao, Y., et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. 6 (3), 035001 (2014).
  36. Zhang, Y. S., et al. Bioprinting the Cancer Microenvironment. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (10), 1710-1721 (2016).
  37. Ouyang, L., et al. Three-dimensional bioprinting of embryonic stem cells directs highly uniform embryoid body formation. Biofabrication. 7 (4), 044101 (2015).
  38. Swaminathan, S., Ngo, O., Basehore, S., Clyne, A. M. Vascular Endothelial-Breast Epithelial Cell Coculture Model Created from 3D Cell Structures. ACS Biomaterials Science & Engineering. 3 (11), 2999-3006 (2017).
  39. Vorwald, C. E., Ho, S. S., Whitehead, J., Leach, J. K. High-Throughput Formation of Mesenchymal Stem Cell Spheroids and Entrapment in Alginate Hydrogels. Methods in Molecular Biology. 1758, 139-149 (2018).
  40. Chaji, S., Al-Saleh, J., Gomillion, C. T. Bioprinted Three-Dimensional Cell-Laden Hydrogels to Evaluate Adipocyte-Breast Cancer Cell Interactions. Gels. 6 (1), (2020).
  41. Swaminathan, S., Hamid, Q., Sun, W., Clyne, A. M. Bioprinting of 3D breast epithelial spheroids for human cancer models. Biofabrication. 11 (2), 025003 (2019).
  42. Radisky, D., Muschler, J., Bissell, M. J. Order and disorder: the role of extracellular matrix in epithelial cancer. Cancer Investigation. 20 (1), 139-153 (2002).
  43. Qu, Y., et al. Evaluation of MCF10A as a Reliable Model for Normal Human Mammary Epithelial Cells. PLoS One. 10 (7), 0131285 (2015).
  44. Chavez, K. J., Garimella, S. V., Lipkowitz, S. Triple negative breast cancer cell lines: one tool in the search for better treatment of triple negative breast cancer. Breast Disease. 32 (1-2), 35-48 (2010).
  45. Swaminathan, S., Cranston, A. N., Clyne, A. M. A Three-Dimensional In vitro Coculture Model to Quantify Breast Epithelial Cell Adhesion to Endothelial Cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (10), 609-618 (2019).
  46. Lee, J. M., et al. Generation of uniform-sized multicellular tumor spheroids using hydrogel microwells for advanced drug screening. Scientific Reports. 8 (1), 17145 (2018).
  47. Frueh, F. S., Spater, T., Scheuer, C., Menger, M. D., Laschke, M. W. Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering. Journal of Visualized Experiments. (122), e55721 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

165

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved