Bioimpressão direta de esferoides de mama multicelular 3D em redes endoteliais

Resumo

O objetivo deste protocolo é bioimprimir diretamente as células epiteliais mamárias como esferoides multicelulares em redes endoteliais pré-formadas para criar rapidamente modelos de cocultura 3D de mama endotelial que podem ser usados para estudos de triagem de medicamentos.

Resumo

A bioimpressão está emergindo como uma ferramenta promissora para fabricar modelos de câncer humano 3D que melhor recapitulem marcas críticas da arquitetura de tecidos in vivo. Na bioimpressão atual de extrusão de camada por camada, as células individuais são extrudadas em um bioink juntamente com pistas espaciais e temporais complexas para promover a auto-montagem do tecido hierárquico. No entanto, essa técnica de biofabricação conta com interações complexas entre células, bioinks e sinais bioquímicos e biofísicos. Assim, a automontagem pode levar dias ou até semanas, pode exigir bioinks específicos, e pode nem sempre ocorrer quando há mais de um tipo de célula envolvida. Desenvolvemos, portanto, uma técnica para bioimpressão pré-formada esferoides epiteliais de mama 3D em uma variedade de bioinks. Os esferoides epiteliais de mama 3D pré-formados bioimpressas sustentaram sua viabilidade e arquitetura polarizada após a impressão. Também imprimimos os esferoides 3D em redes de células endoteliais vasculares para criar um modelo de co-cultura. Assim, a nova técnica de bioimpressão cria rapidamente um modelo de mama humano 3D mais fisiologicamente relevante a um custo menor e com maior flexibilidade do que as técnicas tradicionais de bioimpressão. Esta técnica versátil de bioimpressão pode ser extrapolada para criar modelos 3D de outros tecidos em bioinks adicionais.

Introdução

Modelos de tumores vascularizados in vitro 3D são ferramentas essenciais para o estudo mecanicista do crescimento do câncer e da metástase. Para o câncer de mama em particular, as células epiteliais mamárias cultivadas em Matrigel se organizam em esferoides polarizados que se assemelham mais à arquitetura acinus mamária in vivo^{1,2,3,4,5,6,7,8}. A cultura epitelial da mama 3D também impacta a função celula....

Protocolo

1. Crescimento de células epiteliais mamárias e mídia de ensaio

1. Células epiteliais mamárias MCF10A
   NOTA: A linha de células epiteliais de mama imortalizada não tumorigênica é derivada de uma paciente com doença fibrocística⁴³. As células não expressam receptor de estrogênio.
   1. Para preparar 20 μg/mL fator de crescimento epidérmico (EGF), dissolva 100 μg de EGF liofilizado em 500 μL de dH₂O estéril para fazer 200 μg/mL EGF. Adicione 500 μL de 200 μg/mL EGF em 4,5 mL de BSA estéril de 0,1% em dH₂O para fazer uma solução de estoque EGF de 20 μg/mL. Loja preparada 20 μg/mL EGF alíquotas a -20 °C por até 12 m....

Resultados

As células epiteliais mamárias devem se auto-organizar em esferoides 3D após 5-8 dias de cultura sobre solução matricial e em meio de cultura com solução de matriz de 2%. Epitóides epiteliais não tumorigênicos MCF10A devem aparecer redondos e ter um centro oco, com integrin α6 polarizado à borda externa do esferoide(Figura 1, inset mostra centros ocos). Células epiteliais altamente invasivas MDA-MB-231 formam esferoides irregulares. Os esferoides devem ser usados quando tiverem .......

Discussão

Este protocolo é o primeiro de seu tipo a bioimpressão spheroids em sua arquitetura 3D para co-cultura com células endoteliais também em sua arquitetura 3D. As etapas críticas do protocolo incluem a formação inicial de esferoides epiteliais mamários e redes HUVEC. Deve-se ter extrema cautela na alimentação de esferoides epiteliais mamários, pois são facilmente interrompidos da solução matricial. Da mesma forma, os esferoides epiteliais mamários devem ser tratados com cuidado quando são pipetted fora da so.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
37°C incubator, 5% CO2 and 95% humidity	Sanyo	MCO-20AIC	Cell incubation
3D Bio printer	custom-made	None	Used for bioprinting
8-well chamber slides	VWR, Radnor, PA	53106-306	for seeding spheroids
25-gauge needle	Sigma, St. Louis, MO	Z192406-100EA	bioprinting syringe needle
Absolute ethanol (200 proof )	Sigma, St.Louis, MO	E7023-500ML	reconsitution of media components
Affinipure F(ab′)2 fragment goat anti-mouse IgG	Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA	115006020	secondary block - Immunofluorescence
Alexa Fluor 488 (1:200)	Thermo Fisher, Waltham, MA	A-11006	Seconday antibody-Immunofluorescence
Bovine insulin	Sigma, St.Louis, MO	I-035-0.5ML	MCF10A Media additive
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma, St.Louis, MO	A2153-500G	Blocking agent -Immunofluorescence
Falcon 70 µm Cell Strainer	Corning, Corning, NY	352350	Remove large or clustered spheroids
CellTracker™ Red CMTPX Dye	Thermo Fisher, Waltham, MA	C34552	pre-stain for HUVEC tubes
Compact Centrifuge	Hermle- Labnet, Edison ,NJ	Z206A	For cell centrifugations
Cholera Toxin	Sigma, St.Louis, MO	C8052-.5MG	MCF10A Media additive
Conical tubes 15 mL	VWR, Radnor, PA	62406-200	Collecting and resuspending cells
Countess II-FL Cell counter	Thermo Fisher, Waltham, MA	AMQAF1000	counting cells
Glass pipettes (10 mL)	VWR, Radnor, PA	76184-746	cell resuspension
DMEM F:12	Thermo Fisher, Waltham, MA	11320033	MCF10A basal media
DMEM 1X	VWR, Radnor, PA	10-014-CV	MDA-MB-231 basal media
Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2)	Lonza, Durham, NC	CC-3156	HUVEC basal media
Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2)	Lonza, Durham, NC	CC-3162	Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors)
Alexa Fluor™ 488 Phalloidin	Thermo Fisher, Waltham, MA		Labelling MDA-MB-231 spheroids
Fetal Bovine serum	Cytiva, Logan, UT	SH30071.03	HUVEC/MDA-MB-231 media additive
Goat serum	Thermo Fisher, Waltham, MA	16210064	Live and dead cell stain assay for cell viability
Glycine	Sigma, St.Louis, MO	G8898-500G	immunofluorescence buffer component
Hoescht 33342	Thermo Fisher, Waltham, MA	62249	Nuclei stain immunofluorescence
Horse Serum	Thermo Fisher, Waltham, MA	16050130	MCF10A Media additive
Hydrocortisone	Sigma, St.Louis, MO	H0888-5G	MCF10A Media additive
Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs)	Cell applications, San Diego , CA	200-05f	Endothelial cell lines
Integrin α6	Millipore, Billerica, MA	MAB1378	Immunofluorescence spheroid labelling component
Live Dead assay	Thermo Fisher, Waltham, MA	L3224	Live and dead cell stain assay for cell viability
LSM 700 Confocal microscope	Zeiss, Thornwood, NY		Used to visualize cells
Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml	VWR, Radnor, PA	354230	Spheroid formation
MCF10A cells	ATCC	CRL-10317	Breast cell line
MDA-MB-231 cells	ATCC	HTB-26	Breast cell line
Paraformaldehyde	Sigma, St.Louis, MO	158127-500G	cell fixative
Penicillin and streptomycin	Thermo Fisher, Waltham, MA	15140122	MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive
Phosphate Buffered Saline 1X (PBS)	Thermo Fisher, Waltham, MA	7001106	Wash buffer for cells before trypsinization
Phosphate buffer saline 10X	Thermo Fisher, Waltham, MA	AM9625	immunofluorescence buffer component
Prolong gold antifade	Thermo Fisher, Waltham, MA	P36934	immunofluorescence mountant medium
Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF	Peprotech, Rocky Hill, NJ	AF-100-15	MCF10A/ assay media component
Sodium Azide	Sigma, St.Louis, MO	S2002-25G	immunofluorescence buffer component
Sterile syringe (10 mL)	VWR, Radnor, PA	75846-757	bioprinting process
Tissue culture dish (10cm)	VWR, Radnor, PA	25382-166	monolayer cell culture
Triton X-100	Sigma, St.Louis, MO	T8787-250ML	immunofluorescence buffer component
Trypan blue 0.4%	Thermo Fisher, Waltham, MA	15250061	cell counter additive
Trypsin-EDTA 0.05%	Thermo Fisher, Waltham, MA	25300054	cell detachment
Tween -20	Thermo Fisher, Waltham, MA	85113	immunofluorescence buffer component
>Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165)	Peprotech, Rocky Hill, NJ	100-20	HUVEC tube additive
Volocity 6.3 cell imaging software	PerkinElmer, Hopkinton, MA		Z stack compresser