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摘要

该协议的目标是将生物打印乳房上皮细胞作为多细胞球体直接印在预先形成的内皮网络上，以快速创建可用于药物筛选研究的3D乳腺内皮共生模型。

摘要

生物打印正在成为制造3D人类癌症模型的有希望的工具，能够更好地回顾体内组织结构的关键特征。在目前的逐层挤压生物打印中，单个细胞与复杂的空间和时间线索一起挤出生物沉淀物，以促进分层组织自我组装。然而，这种生物制药技术依赖于细胞、生物素和生化和生物物理线索之间的复杂相互作用。因此，自组装可能需要数天甚至数周的时间，可能需要特定的生物墨水，并且当涉及多个细胞类型时，可能并不总是发生。因此，我们开发了一种技术，直接生物打印预先形成的3D乳房上皮球体在各种生物墨水。生物打印预形成的3D乳房上皮球体在打印后维持其生存能力和极化结构。此外，我们还将3D球体打印到血管内皮细胞网络上，以创建共培养模型。因此，新的生物打印技术迅速创造了一个与生理相关的3D人体乳房模型，其成本更低，灵活性也比传统生物打印技术高。这种多才多艺的生物打印技术可以推断出来，以创建其他组织的其他生物墨水的3D模型。

引言

3D体外血管化肿瘤模型是癌症生长和转移的机械研究的重要工具。特别是对于乳腺癌，在Matrigel培养的乳房上皮细胞组织成极化球形，更类似于体内乳腺癌结构1，2，3，4，5，6，7，8。3D乳房上皮细胞培养也影响细胞功能，3D培养物在表皮生长因子（EGF）受体调节8、9方面表现出差异:电基因功能，包括 ErbB210:生长和凋亡信号11，12:和化疗耐药性13，14。血管内皮细胞在3D与传统2D文化15、16、17、18中对环境刺激的反应相似。然而，对血管内皮和乳房上皮相互作用的理解大部分来自使用条件介质或Transwell插入物的2D培养，或3D模型，其中两种细胞类型物理分离19，20，21，22，23。这些共同培养模型提供了有限的生理洞察力，因为3D培养和细胞接触对血管内皮-乳房上皮细胞相互作用24，25，26至关重要。

3D癌症模型是使用各种技术制造的，包括悬挂下降球形形成，生物打印，磁性组装，培养在水凝胶或工程脚手架5，27，28，29。最近，3D肿瘤模型被创建，在各自的3D结构中排列了多种细胞类型。在片上肿瘤平台的一个例子中，癌症、内皮细胞和频闪细胞被混合到基质中，然后注射到聚二甲基硅氧烷（PDMS）装置中的三个中央组织室中。组织室由代表动脉和静脉的两个外通道包围。经过5-7天的培养，内皮细胞形成微血管网络，癌细胞增殖，在血管附近形成小肿瘤。然后，该平台用于筛选药物和药物组合30。其他肿瘤片上平台已经创建，以研究转移和癌症类型与特定的机械刺激（例如，在肺部的机械应变）31，32。然而，这些平台通常不包括血管和癌症在其各自的3D结构。

生物合成在推进体外血管化肿瘤模型方面显示出巨大的希望，因为它能够对细胞位置进行严格的空间控制。尽管生物印刷在过去十年中增长，但很少有研究特别侧重于肿瘤33，34。在一个例子中，用明胶/藻酸盐/纤维蛋白原水凝胶对HiLa细胞进行3D打印，以创建体外宫颈癌模型。肿瘤细胞被生物打印为单个细胞，然后允许形成球形，这表明更高的增殖率，增加矩阵金属蛋白酶表达，和更高的化学耐附性比细胞在2D培养35。在这些研究中，像许多其他36，37，分离细胞悬浮物被生物打印，然后细胞培养物被提供所需的机械和生化线索，使细胞形成一个3D结构。然而，细胞自组装可能需要数天或数周的时间，可能需要复杂的空间和时间环境提示，或在两种细胞类型共同培养时可能不会发生。例如，乳腺上皮细胞在2D共生中诱发内皮细胞死亡，分离的乳房上皮细胞在生物印在藻酸盐/明胶水凝胶38中时没有形成3D球形。分离的乳腺上皮或癌细胞只有在包裹在圆形 PDMS 模具中时，才会在藻酸盐生物沉积中形成球形。在其他情况下，球体是使用悬浮液滴在超低附件圆形井板中形成的，然后混合成藻酸盐基生物墨水39，40。

我们现在在此协议中描述了一种替代的3D组织生物制造方法。我们描述的不是种子分离细胞和等待这些细胞形成3D结构，而是描述如何在血管管网络上创建和生物打印3D肿瘤球体，以创建一个肿瘤共生模型，几乎可以立即使用。肿瘤球体可以在体外生长或从人体组织（器官）中提取。同样，血管管可以生长，也可以从脂肪组织微血管片段中提取。生物素的范围从生物不活跃的藻酸盐到高度生物活性的马特里格尔41。由于这种3D肿瘤共生模型可以创建与各种细胞结构和生物素，它可以结合多种细胞类型，细胞外矩阵，和化学基质梯度15，42。虽然在其目前的配方中，内皮网络无法注入，但未来的迭代可以将此方法与微流体或片上系统集成。将3D乳房上皮球体打印到内皮网络上，使人类乳房模型能够快速生物合成，用于药物测试和个性化精密医学27。

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研究方案

1. 乳房上皮细胞生长和检测介质

  1. MCF10A 乳房上皮细胞
    注:非肿瘤不朽的乳房上皮细胞系来自纤维囊病患者43。细胞不表达雌激素受体。
    1. 要准备 20μg/mL 表皮生长因子 （EGF），在 500 μL 的无菌 dH2O 中溶解 100μg 的亲皮 EGF，使 200 μg/mL EGF。在 dH 2 O 中将 200 微克/mL EGF 的 500 微升添加到 4.5 mL 的无菌0.1%BSA 中，以制作 20μg/mL EGF 库存解决方案。商店准备20μg/mL EGF在-20°C的别名长达12个月。
    2. 要准备 500μg/mL 氢皮质松，在 1 mL 绝对乙醇中稀释 1 毫克氢皮质松（200 证明）。将 1 毫升无菌 DMEM F:12 添加到此混合物中，制成 500μg/mL 氢皮质松库存溶液。将氢皮质松库存报价存储在-80°C，最长达12个月。
    3. 要准备 10μg/mL 霍乱毒素，在 1 mL 无菌 dH2O 中溶解 1 毫克霍乱毒素亲血粉，以制作 1 毫克/毫升霍乱毒素储存溶液。将霍乱毒素储存在 -80 °C 下长达 12 个月。
    4. 准备增长介质， 添加 500 μL 的 EGF （20μg/mL）， 500μL 的水皮质松 （500μg/mL）， 5 μL 霍乱毒素 （1 毫克/mL）， 500 μL 牛胰岛素 （10 毫克/mL）， 10 mL 青霉素和链霉素， 和25毫升的马血清到500毫升的DMEM F:12的最终浓度为20 ng/mL EGF， 500克/mL氢皮质松，10克/mL霍乱毒素， 10 ng/mL 牛胰岛素，2% v/v 青霉素和链霉素，5% v/v 马血清。抗生素浓度增加到2%，以减少生物打印过程中的不育性:然而，抗生素浓度可以降低到1%。
    5. 要准备检测介质，添加 500 μL 的水皮质松 （500μg/mL），5 μL 霍乱毒素 （1 毫克/mL）， 500μL 牛胰岛素 （10 毫克/mL）， 10 mL 青霉素和链霉素， 和25毫升的马血清到500毫升的DMEM F:12的最终浓度为500克/毫升氢皮质松，10克/毫升霍乱毒素，10克/毫升牛胰岛素，2%v/v青霉素和链霉素，和5%v/v马血清。
  2. MDA-MB-231
    注:三阴性（缺乏雌激素受体、黄体酮受体和表皮生长因子受体2）乳腺癌上皮细胞系是由转移性乳腺癌44的女性患者的胸膜发泡产生的。细胞代表一种侵略性、侵入性且分化不良的乳腺癌。
    1. 准备生长和检测介质， 添加50 mL的胎儿牛血清，10mL的青霉素和链霉素，和25mL的马血清到500mL的DMEM为最终浓度10%v/v胎儿牛血清，2%v/v青霉素和链霉素，和5%v/v马血清。

2. 乳房上皮细胞培养

  1. 种子 500，000 MCF10A 或 MDA-MB-231 细胞在 10 厘米 （P100） 组织培养皿与 10 mL 的 MCF10A 或 MDA-MB-231 生长介质。MCF10A 和 MDA-MB-231 细胞在 48 小时内达到 +90% 的汇合。
  2. 要 通过乳房上皮细胞， 首先用10 mL的温暖PBS清洗细胞。
  3. 通过在菜中加入 2 mL 的 0.05% 特里普辛 - EDTA 来分离乳房上皮细胞。将菜放入 37 °C、5% CO2 孵化器中 20-25 分钟。
  4. 将5 mL的MCF10A或MDA-MB-231生长介质添加到胰腺素细胞中和胰腺素。上上下下将细胞介质混合物向上和向下移到悬生细胞并分解细胞簇。
  5. 将电池悬架添加到 15 mL 圆锥管和离心机中，1，200 x g， 持续 3 分钟。小心地吸气超纳坦，并在 MCF10A 或 MDA-MB-231 生长介质的 5 mL 中重新悬浮细胞颗粒。
  6. 板 1 mL 的细胞悬浮在 5 个新的 10 厘米组织培养皿以及 MCF10A 或 MDA-MB-231 生长介质。将菜肴放在 37 °C、5% CO2 孵化器中。细胞将在2-3天内再次通过。MCF10A细胞可以维持到35号通道，之后它们显示形态变化。MDA-MB-231细胞可以维持到24号通道，之后它们显示出形态的变化。

3. 乳房上皮球形形成

  1. 在开始检测前冻结 200 μL 移液器提示 30 分钟。在整个过程中将生长因子减少矩阵溶液（例如矩阵）（10 毫克/mL）保留在冰上。
  2. 使用冰冷 200μL 移液器提示将 30 μL 冰冷矩阵溶液缓慢移液到 8 井室滑梯的每口井中。从两侧开始，沿着拐角拖动移液器尖端，在油井中央添加最后一滴水，以确保每个油井均匀涂层。在此步骤中避免气泡，以确保均匀的矩阵溶液层。为每口井使用新的移液器提示。
  3. 孵化室在 37 °C 中滑动，5% CO2 孵化器 15-20 分钟，以聚合矩阵溶液。
  4. MCF10A检测介质中悬垂的尝试性MCF10A细胞在200，000个细胞/mL或在MDA-MB-231生长介质中以200，000个细胞/mL重新悬垂的尝试性MDA-MB-231细胞。
  5. 如果使用 MCF10A 细胞，则通过在 5 mL 的检测介质中添加 5 μL 的 EGF （20 μg/mL） 和 100 μL 矩阵溶液来准备新鲜的 MCF10A 球形生长介质，最终浓度为 2% 矩阵溶液。
  6. 从孵化器中取出预涂有矩阵溶液的腔室滑梯。在每个井中添加 50 μL 的 MCF10A 或 MDA-MB-231 细胞悬架（10，000 个细胞）。如果使用 MCF10A 细胞，添加 450μL 的 MCF10A 球体生长介质。如果使用 MDA-MB-231 细胞，添加 450μL 的 MDA-MB-231 生长介质预混合 2% 矩阵溶液 （9 μL）。立即将腔室滑动放置在 37 °C 中，5% CO2 孵化器中。
  7. 每4天更换一次介质。使用 200μL 移液器尖端从每口井的一角小心地移出 200μL 旧介质。在此过程中，将腔室滑动倾斜至 45°，以确保球体不受干扰。添加 200 μL 的新鲜制备的 MCF10A 球形生长介质或 MDA-MB-231 生长介质，以前与 2% 矩阵溶液混合到每个油井的拐角处，以确保球体保持附着在矩阵层上。仅更换了约 50% 的介质，以便球形产生的所有细胞因子不会完全耗尽。
    注:MCF10A乳房上皮球体需要长达8天的时间两极分化并形成空心中心。MDA-MB-231乳房上皮球体需要长达5天的时间才能形成，并且没有空心中心。

4. 内皮细胞网络形成

  1. 人类脐带静脉内皮细胞（HUVEC）培养
    1. 添加含有胰岛素生长因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、抗坏血酸、表皮生长因子的单一内皮生长中-2套件的内容， 肝素和根霉素-安非他明B，以及50mL的胎儿牛血清，5 mL青霉素-链霉素和5 mL的200m谷氨酰胺到500mL的内皮基础中等2（EBM-2），以创建完整的内皮生长介质（EGM-2）。
    2. 在 EGM-2 的 10 mL 中，在 10 厘米组织培养皿中播种 500，000 个内皮细胞。将细胞放置在 37 °C、5% CO2 孵化器中，直到它们达到 +80% 的汇合度（约 48 小时）。
    3. 通过细胞，用10mL的温暖PBS清洗内皮细胞。通过在 10 厘米组织培养皿中添加 2 mL 的 0.05% 特里普辛 - EDTA 来分离 Huvec 。按相位对比显微镜密切监测细胞。细胞准备好时，他们被球起来，但保持连接到菜。
    4. 小心地从盘子里吸出试食剂。在菜中加入 8 mL 的 EGM-2。通过在整个菜面上上下管道 EGM-2 来洗净盘子中的细胞。
    5. 或者，在试金石细胞中加入5 mL的EGM-2，以中和试金石。上上下下将细胞介质混合物向上和向下移到悬生细胞并分解细胞簇。将电池悬架添加到 15 mL 圆锥管和离心机中，1，200 x g， 持续 3 分钟。小心地吸食超纳坦，并在 10 mL 的 EGM-2 中重新悬浮细胞颗粒。
    6. 在 10 厘米组织培养盘中将 1 mL 的细胞悬浮液添加到 9 mL 的 EGM-2 中。将菜肴放在 37 °C、5% CO2 孵化器中。每2天交换2/3的介质与新鲜的EGM-2。细胞将在3-5天内通过。HUVEC 可以保持到第 8 段，之后它们无法形成网络。
  2. 内皮细胞（HUVEC）网络形成
  3. 在开始检测前冻结 200 μL 移液器提示 30 分钟。在整个过程中将生长因子减少矩阵溶液（10 毫克/mL）保留在冰上。
  4. 使用冰冷 200μL 移液器提示将 30 μL 冰冷矩阵溶液缓慢移液到 8 井室滑梯的每口井中。从两侧开始，沿着拐角拖动移液器尖端，在油井中央添加最后一滴水，以确保每个油井均匀涂层。在此步骤中避免气泡，以确保均匀的矩阵溶液层。为每口井使用新的移液器提示。
  5. 孵化室在37°C、5%CO2 孵化器中滑动15-20分钟，以聚合马特里格尔。
    1. 在 37 °C、5% CO2 孵化器中，用 10 μL 的红细胞跟踪器 （1:1000） 预染色 10 厘米的 HUVEC 盘 30 分钟。
    2. 用10mL的温暖PBS清洗内皮细胞。通过在 10 厘米组织培养皿中添加 2 mL 的 0.05% 特里普辛 - EDTA 来分离 Huvec 。将菜放入 37 °C、5% CO2 孵化器中 5 分钟，以完全分离细胞。
    3. 将 5 mL 的 EGM-2 添加到菜中以中和试金石。将细胞悬架转移到 25 mL 圆锥管中。离心机 HUVEC 在 1，200 x g 5 分钟。吸气超纳坦，并在5mL的无血清EBM-2中重新悬浮细胞颗粒。
    4. 使用Trypan蓝色计数细胞以确定可行的细胞。创建 1 x 106 单元格/mL 解决方案。
    5. 使用 200μL 的无血清 EBM-2 将 100，000 个 HUVEC 添加到每个油井中。如果添加更多的细胞，他们将创建一个表面单层，而不是一个管网络。
    6. 在37°C、5%CO2 孵化器中孵育HUVEC。6 小时后，按相对比显微镜对图像 HUVEC 网络。网络现在已准备好用乳房球形进行培养。

5. 预形成的HUVEC网络上的生物打印乳房上皮球体

注:双喷嘴生物沉积系统应用于生物制剂过程。在这种情况下，该系统有三个运动臂，允许微米规模的空间控制材料沉积，以及两个螺丝驱动电机沉积生物墨水从10 mL注射器。该系统应具有高效颗粒空气过滤系统以及紫外线灭菌功能，以在生物打印过程中保持无菌环境。生物打印机在打印过程前进行一小时的紫外线消毒。

  1. 如前所述，创建乳房上皮球体和 HUVEC 网络。通过在代表性相对比显微镜图像中数球体来估计每口井中乳房上皮球体的数量。
  2. 从 1000μL 移液器尖端切下 0.5 厘米。使用切割移液器尖端小心地将所有球形从 8 井室滑梯中移出并放入 50 mL 管中。在选定的生物墨水中以 100 个球形/100 μL 重新悬生球体。
    注:较高的球形浓度可能导致球形聚类，并防止球形和内皮网络之间的交互可视化。
  3. 通过 70μm 细胞过滤器传递球形混合物，以去除任何大型或聚类球形。
  4. 将池状球体加载到 10 mL 无菌注射器中，并用 25 光量无菌针盖上。将注射器连接到生物沉积系统。
  5. 在 8 井室幻灯片中吸气 HUVEC 网络中的介质。
  6. 以 1 mL/min 的流速将 100μL 的乳房上皮球体挤入 HUVEC 网络的 6 口井中。作为控件维护 2 口 HUVEC 网络井。
  7. 如果使用 HUVEC 网络上打印的 MCF10A 球形生长介质添加 400 μL，或添加 400 μL MDA-MB-231 增长介质，如果使用 HUVEC 网络上打印的 MDA-MB-231 球形，则添加以前与 2% 矩阵解决方案混合的生长介质。应在 HUVEC 控制井中使用相应的球形生长介质。
  8. 在37°C、5%CO2 孵化器中孵育共同培养物24-96小时，无需更换媒体。共同文化将在原来的媒介中保持生存长达四天。

6. 康福科显微镜

  1. 免疫荧光和PBS-甘氨酸洗涤缓冲准备
    1. 通过添加 2.5 克阿齐德钠、5 克牛血清白蛋白、10 mL 的 Triton X-100 和 2.05 mL 的 Tween-20，在 10 倍 PBS 中加入 2.5 克 Azide 钠，从而准备免疫荧光 （IF） 缓冲 10 倍库存溶液。将pH调整为7.4。将库存溶液在 4 °C 下存储长达一年，以避免沉积。
    2. 通过在 450 mL 的无菌去电化水中稀释 50 mL 的 10 倍 IF 缓冲器创建一个工作 IF 缓冲区。将工作解决方案在室温下存储长达一周。
    3. 通过将 37.5 克甘氨酸添加到 10 倍 PBS 的 500 mL 中，准备 10 倍 PBS-甘氨酸缓冲液库存解决方案。将pH调整为7.4。将库存溶液在 4 °C 下存储长达 6 个月，以避免沉积。
    4. 通过在 450 mL 的无菌去电化水中稀释 50 mL 的 10 倍 PBS-甘氨酸缓冲液，创建有效的 PBS-甘氨酸溶液。将工作解决方案存储在 4 °C 下长达一周。
  2. 标签生物打印样品和图像由康福科显微镜
    1. 从生物打印的3D共同培养和冲洗3次与温暖的PBS吸气介质。修复生物打印的3D共培养物与4%的副甲醛1小时在室温下。用 1x PBS-甘氨酸冲洗样品 3 次，20 分钟。
    2. 用IF缓冲器将样品与10%山羊血清混合90分钟（主块），然后用IF缓冲区加10%山羊血清和Affinipure Fab片段（1:100，次要块）块样品。
    3. 如果使用 MCF10A 球体，则在 4 °C 的二次阻塞缓冲区中标记具有集成蛋白 ® 6 （1:100） 的原发抗体的样品，然后是 Alexa Fluor 488 次要抗体 （1:200） 和 Hoescht 33342 （1:1000）， 在室温下防止光线照射 1 小时。MCF10A细胞系表示高水平的集成+6，这是显示球体极化和形态学的关键。
    4. 如果使用MDA-MB-231球形，表示低浓度的集成+6，则用亚历克萨氟488 phalloidin（1:100）和Hoescht 33342（1:1000）在室温下在隔光下标记样品4小时。Phalloidin 支持作用灯丝可视化，因此可以评估球形无定形和侵入性形态。
    5. 用1X PBS-甘氨酸清洗样品3次，20分钟。
    6. 使用制造商的工具移除机舱滑梯，准备安装样品。给每口井添加一小滴防脂溶液。在每个房间滑梯上放置一个 22 mm x 60 mm 的盖片，并小心地用透明指甲油密封边缘。
    7. 使用共分显微镜作为 Z 堆栈的图像样本在 5 μm 步骤中将 +10 切片堆叠在一起。如果需要，使用细胞成像软件中的扩展对焦命令将 Z 平面压缩到单平面上。
    8. 使用图像 J 将球形粘附量化到内皮网络。可使用具有适当粒子大小和圆形的分析插件量化粘附球体的数量。将附加的球形数标准化到图像区域。
    9. 为了确保可重复性，量化共同培养的 4 x 4 瓷砖图像中粘附球体的数量。如果球形数在统计上明显低于其他实验，则应重复该实验。

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结果

乳房上皮细胞应自我组织成3D球形后，5-8天的培养矩阵溶液和文化介质与2%的矩阵溶液。非肿瘤性MCF10A乳房上皮球体应呈圆形，并具有空心中心，与整数+6偏振到球体的外缘（图1，内嵌显示空心中心）。高度侵入性的MDA-MB-231乳腺癌上皮细胞形成不规则球形。当球形直径约为100-300μm时，应使用球形。当球体变得太大，并接近，球体将连接在一起，形成巨型球体。此外，MDA-MB-231...

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讨论

此协议是首次在其 3D 架构中与内皮细胞在其 3D 架构中共同培养的生物打印球体。关键协议步骤包括乳房上皮球体和HUVEC网络的初始形成。在喂养乳房上皮球体时必须格外小心，因为它们很容易被矩阵溶液打乱。同样，乳房上皮球体在从矩阵溶液上移开并混合到网络中时，必须小心对待。HUVEC 网络不应以过高的密度进行镀层，也不应离开超过 16 小时，因为它们将分别形成单层或死亡。最后，所有?...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项研究由NIH 1R01HL140239-01向AMC资助。我们要感谢德雷塞尔大学的细胞成像中心。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
37°C incubator, 5% CO2 and 95% humiditySanyoMCO-20AICCell incubation
3D Bio printercustom-madeNoneUsed for bioprinting
8-well chamber slidesVWR, Radnor, PA53106-306for seeding spheroids
25-gauge needleSigma, St. Louis, MOZ192406-100EAbioprinting syringe needle
Absolute ethanol (200 proof )Sigma, St.Louis, MOE7023-500MLreconsitution of media components
Affinipure F(ab′)2 fragment goat anti-mouse IgGJackson ImmunoResearch, West Grove, PA115006020secondary block - Immunofluorescence
Alexa Fluor 488 (1:200)Thermo Fisher, Waltham, MAA-11006Seconday antibody-Immunofluorescence
Bovine insulinSigma, St.Louis, MOI-035-0.5MLMCF10A Media additive
Bovine serum albumin (BSA)Sigma, St.Louis, MOA2153-500GBlocking agent -Immunofluorescence
Falcon 70 µm Cell StrainerCorning, Corning, NY352350Remove large or clustered spheroids
CellTracker™ Red CMTPX DyeThermo Fisher, Waltham, MAC34552pre-stain for HUVEC tubes
Compact CentrifugeHermle- Labnet, Edison ,NJZ206AFor cell centrifugations
Cholera ToxinSigma, St.Louis, MOC8052-.5MGMCF10A Media additive
Conical tubes 15 mLVWR, Radnor, PA62406-200Collecting and resuspending cells
Countess II-FL Cell counterThermo Fisher, Waltham, MAAMQAF1000counting cells
Glass pipettes (10 mL)VWR, Radnor, PA76184-746cell resuspension
DMEM F:12Thermo Fisher, Waltham, MA11320033MCF10A basal media
DMEM 1XVWR, Radnor, PA10-014-CVMDA-MB-231 basal media
Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2)Lonza, Durham, NCCC-3156HUVEC basal media
Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2)Lonza, Durham, NCCC-3162Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors)
Alexa Fluor™ 488 PhalloidinThermo Fisher, Waltham, MALabelling MDA-MB-231 spheroids
Fetal Bovine serumCytiva, Logan, UTSH30071.03HUVEC/MDA-MB-231 media additive
Goat serumThermo Fisher, Waltham, MA16210064Immunofluorescence labelling component
GlycineSigma, St.Louis, MOG8898-500Gimmunofluorescence buffer component
Hoescht 33342Thermo Fisher, Waltham, MA62249Nuclei stain immunofluorescence
Horse SerumThermo Fisher, Waltham, MA16050130MCF10A Media additive
HydrocortisoneSigma, St.Louis, MOH0888-5GMCF10A Media additive
Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs)Cell applications, San Diego , CA200-05fEndothelial cell lines
Integrin α6Millipore, Billerica, MAMAB1378Immunofluorescence spheroid labelling component
Live Dead assayThermo Fisher, Waltham, MAL3224Live and dead cell stain assay for cell viability
LSM 700 Confocal microscopeZeiss, Thornwood, NYUsed to visualize cells
Matrigel - growth factor reduced 10 mg/mlVWR, Radnor, PA354230Spheroid formation
MCF10A cellsATCCCRL-10317Breast cell line
MDA-MB-231 cellsATCCHTB-26Breast cell line
ParaformaldehydeSigma, St.Louis, MO158127-500Gcell fixative
Penicillin and streptomycinThermo Fisher, Waltham, MA15140122MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive
Phosphate Buffered Saline 1X (PBS)Thermo Fisher, Waltham, MA7001106Wash buffer for cells before trypsinization
Phosphate buffer saline 10XThermo Fisher, Waltham, MAAM9625immunofluorescence buffer component
Prolong gold antifadeThermo Fisher, Waltham, MAP36934immunofluorescence mountant medium
Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGFPeprotech, Rocky Hill, NJAF-100-15MCF10A/ assay media component
Sodium AzideSigma, St.Louis, MOS2002-25Gimmunofluorescence buffer component
Sterile syringe (10 mL)VWR, Radnor, PA75846-757bioprinting process
Tissue culture dish (10cm)VWR, Radnor, PA25382-166monolayer cell culture
Triton X-100Sigma, St.Louis, MOT8787-250MLimmunofluorescence buffer component
Trypan blue 0.4%Thermo Fisher, Waltham, MA15250061cell counter additive
Trypsin-EDTA 0.05%Thermo Fisher, Waltham, MA25300054cell detachment
Tween -20Thermo Fisher, Waltham, MA85113immunofluorescence buffer component
Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165)Peprotech, Rocky Hill, NJ100-20HUVEC tube additive
Volocity 6.3 cell imaging softwarePerkinElmer, Hopkinton, MAZ stack compresser

参考文献

  1. Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
  2. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  3. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  4. Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
  5. Sokol, E. S., et al. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 19(2016).
  6. Howlett, A. R., Bailey, N., Damsky, C., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Cellular growth and survival are mediated by beta 1 integrins in normal human breast epithelium but not in breast carcinoma. Journal of Cell Science. 108, Pt 5 1945-1957 (1995).
  7. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  8. Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
  9. Wang, F., et al. Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (25), 14821-14826 (1998).
  10. Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nature Cell Biology. 3 (9), 785-792 (2001).
  11. Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (2), 521-526 (2003).
  12. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111 (1), 29-40 (2002).
  13. Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2 (3), 205-216 (2002).
  14. Yamada, K. M., Clark, K. Cell biology: survival in three dimensions. Nature. 419 (6909), 790-791 (2002).
  15. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116, Pt 12 2377-2388 (2003).
  16. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
  17. Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 83-101 (2008).
  18. Sacharidou, A., et al. Endothelial lumen signaling complexes control 3D matrix-specific tubulogenesis through interdependent Cdc42- and MT1-MMP-mediated events. Blood. 115 (25), 5259-5269 (2010).
  19. Buchanan, C. F., et al. Cross-talk between endothelial and breast cancer cells regulates reciprocal expression of angiogenic factors in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (4), 1142-1151 (2012).
  20. Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. In vitro angiogenesis induced by tumor-endothelial cell co-culture in bilayered, collagen I hydrogel bioengineered tumors. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (11), 864-874 (2013).
  21. Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Stromal endothelial cells directly influence cancer progression. Science Translational Medicine. 3 (66), 66(2011).
  22. Franses, J. W., Drosu, N. C., Gibson, W. J., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Dysfunctional endothelial cells directly stimulate cancer inflammation and metastasis. International Journal of Cancer. 133 (6), 1334-1344 (2013).
  23. Phamduy, T. B., et al. Printing cancer cells into intact microvascular networks: a model for investigating cancer cell dynamics during angiogenesis. Integrative Biology. 7 (9), Cambridge. 1068-1078 (2015).
  24. Connor, Y., et al. Physical nanoscale conduit-mediated communication between tumour cells and the endothelium modulates endothelial phenotype. Nature Communications. 6, 8671(2015).
  25. Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nature Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
  26. Strilic, B., et al. Tumour-cell-induced endothelial cell necroptosis via death receptor 6 promotes metastasis. Nature. 536 (7615), 215-218 (2016).
  27. Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), Kidlington. 539-553 (2015).
  28. Belgodere, J. A., et al. Engineering Breast Cancer Microenvironments and 3D Bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66(2018).
  29. Jang, J., Yi, H. G., Cho, D. W. 3D Printed Tissue Models: Present and Future. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (10), 1722-1731 (2016).
  30. Sobrino, A., et al. 3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks. Scientific Reports. 6, 31589(2016).
  31. Chen, M. B., Whisler, J. A., Jeon, J. S., Kamm, R. D. Mechanisms of tumor cell extravasation in an in vitro microvascular network platform. Integrative Biology. 5 (10), Cambridge. 1262-1271 (2013).
  32. Hassell, B. A., et al. Human Organ Chip Models Recapitulate Orthotopic Lung Cancer Growth, Therapeutic Responses, and Tumor Dormancy In vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
  33. Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
  34. Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), 539-553 (2015).
  35. Zhao, Y., et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. 6 (3), 035001(2014).
  36. Zhang, Y. S., et al. Bioprinting the Cancer Microenvironment. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (10), 1710-1721 (2016).
  37. Ouyang, L., et al. Three-dimensional bioprinting of embryonic stem cells directs highly uniform embryoid body formation. Biofabrication. 7 (4), 044101(2015).
  38. Swaminathan, S., Ngo, O., Basehore, S., Clyne, A. M. Vascular Endothelial-Breast Epithelial Cell Coculture Model Created from 3D Cell Structures. ACS Biomaterials Science & Engineering. 3 (11), 2999-3006 (2017).
  39. Vorwald, C. E., Ho, S. S., Whitehead, J., Leach, J. K. High-Throughput Formation of Mesenchymal Stem Cell Spheroids and Entrapment in Alginate Hydrogels. Methods in Molecular Biology. 1758, 139-149 (2018).
  40. Chaji, S., Al-Saleh, J., Gomillion, C. T. Bioprinted Three-Dimensional Cell-Laden Hydrogels to Evaluate Adipocyte-Breast Cancer Cell Interactions. Gels. 6 (1), (2020).
  41. Swaminathan, S., Hamid, Q., Sun, W., Clyne, A. M. Bioprinting of 3D breast epithelial spheroids for human cancer models. Biofabrication. 11 (2), 025003(2019).
  42. Radisky, D., Muschler, J., Bissell, M. J. Order and disorder: the role of extracellular matrix in epithelial cancer. Cancer Investigation. 20 (1), 139-153 (2002).
  43. Qu, Y., et al. Evaluation of MCF10A as a Reliable Model for Normal Human Mammary Epithelial Cells. PLoS One. 10 (7), 0131285(2015).
  44. Chavez, K. J., Garimella, S. V., Lipkowitz, S. Triple negative breast cancer cell lines: one tool in the search for better treatment of triple negative breast cancer. Breast Disease. 32 (1-2), 35-48 (2010).
  45. Swaminathan, S., Cranston, A. N., Clyne, A. M. A Three-Dimensional In vitro Coculture Model to Quantify Breast Epithelial Cell Adhesion to Endothelial Cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (10), 609-618 (2019).
  46. Lee, J. M., et al. Generation of uniform-sized multicellular tumor spheroids using hydrogel microwells for advanced drug screening. Scientific Reports. 8 (1), 17145(2018).
  47. Frueh, F. S., Spater, T., Scheuer, C., Menger, M. D., Laschke, M. W. Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering. Journal of Visualized Experiments. (122), e55721(2017).

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