JoVE Logo
Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

El objetivo de este protocolo es bioimprimir directamente las células epiteliales mamarias como esferoides multicelulares en redes endoteliales preformadas para crear rápidamente modelos de co-cultivo endotelial mamario 3D que pueden ser utilizados para estudios de detección de fármacos.

Resumen

La bioimpresión está emergiendo como una herramienta prometedora para fabricar modelos de cáncer humano 3D que recapitulan mejor las señas de identidad críticas de la arquitectura de tejidos in vivo. En la bioimpresión actual de extrusión capa por capa, las células individuales se extruyen en un bioink junto con señales espaciales y temporales complejas para promover el autoensamblaje del tejido jerárquico. Sin embargo, esta técnica de biofabricación se basa en interacciones complejas entre células, bioinks y señales bioquímicas y biofísicas. Por lo tanto, el autoensamblaje puede tomar días o incluso semanas, puede requerir bioinks específicos, y no siempre puede ocurrir cuando hay más de un tipo de célula involucrado. Por lo tanto, desarrollamos una técnica para bioimprimir directamente esferoides epiteliales de mama 3D preformados en una variedad de bioinks. Los esferoides epiteliales 3D preformados bioimpresos mantuvieron su viabilidad y arquitectura polarizada después de la impresión. Además imprimimos los esferoides 3D en redes celulares endoteliales vasculares para crear un modelo de co-cultivo. Por lo tanto, la novedosa técnica de bioimpresión crea rápidamente un modelo mamario humano 3D más fisiológicamente relevante a menor costo y con mayor flexibilidad que las técnicas tradicionales de bioimpresión. Esta versátil técnica de bioimpresión se puede extrapolar para crear modelos 3D de otros tejidos en bioinks adicionales.

Introducción

Los modelos tumorales vascularizados in vitro 3D son herramientas esenciales para el estudio mecanicista del crecimiento del cáncer y la metástasis. Para el cáncer de mama en particular, las células epiteliales mamarias cultivadas en Matrigel se organizan en esferoides polarizados que se asemejan más a la arquitectura in vivo mammary acinus1,2,3,4,5,6,7,8. Cultivo celular epitelial mamario 3D también afecta la función celular, con cultivos 3D que muestran diferencias en la modulación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF)8,9; función de oncogeno, incluyendo ErbB210; crecimiento y apoptosis señalización11,12; y resistencia a la quimioterapia13,14. Las células endoteliales vasculares responden de manera similar a los estímulos ambientales en 3D frente al cultivo tradicional 2D15,16,17,18. Sin embargo, gran parte de la comprensión de las interacciones endoteliales vasculares y epiteliales mamarias proviene del cultivo 2D utilizando insertos medianos o transwell acondicionados, o modelos 3D en los que los dos tipos de células están físicamente separados19,20,21,22,23. Estos modelos de co-cultivo proporcionan una visión fisiológica limitada, ya que tanto el cultivo 3D como el contacto célula-celular son críticos para el endotelial vascular – interacciones celulares epiteliales mamarias24,25,26.

Los modelos oncológicos 3D han sido fabricados utilizando una variedad de técnicas, incluyendo la formación de esferoides colgantes, bioimpresión, montaje magnético y cultivo dentro de hidrogeles o en andamios diseñados5,27,28,29. Más recientemente, se crearon modelos de tumores 3D con múltiples tipos de células dispuestas en sus respectivas estructuras 3D. En un ejemplo de una plataforma tumoral en un chip, el cáncer, las células endoteliales y estromales se mezclaron en una matriz y luego se inyectaron en las tres cámaras del tejido central en un dispositivo de polidimetilesiloxano (PDMS). Las cámaras de tejido estaban bordeadas por dos canales exteriores que representaban una arteria y una venul. Después de 5-7 días de cultivo, las células endoteliales formaron una red microvascular y las células cancerosas proliferaron para formar pequeños tumores cerca de la vasculatura. Esta plataforma se utilizó entonces para examinar drogas y combinaciones de drogas30. Se han creado plataformas adicionales de tumor en un chip para estudiar metástasis y tipos de cáncer con estímulos mecánicos específicos (por ejemplo, tensión mecánica en el pulmón)31,32. Sin embargo, estas plataformas generalmente no incluyen vasculatura y cáncer en sus respectivas estructuras 3D.

La biofabricación muestra una gran promesa en el avance de modelos tumorales vascularizados in vitro en 3D, ya que permite un estricto control espacial sobre la ubicación celular. A pesar del crecimiento de la bioimpresión en la última década, pocos estudios se centran específicamente en tumores33,34. En un ejemplo, la impresión 3D de células HeLa en un hidrogel gelatina/alginato/fibrinógeno se utilizó para crear un modelo de cáncer cervical in vitro. Las células tumorales fueron bioimpresas como células individuales y luego se les permitió formar esferoides, que mostraron una mayor tasa de proliferación, mayor expresión de metaloproteinasa de matriz y mayor quimioterasis que las células en el cultivo2D 35. En estos estudios, como en muchos otros36,37,las suspensiones celulares disociadas fueron bioimpresas, y luego se proporcionaron los cultivos celulares con las señales mecánicas y bioquímicas requeridas para permitir que las células formen una estructura 3D. Sin embargo, el autoensamblaje celular puede tardar días o semanas, puede requerir señales ambientales espaciales y temporales complejas o no puede ocurrir cuando dos tipos de células son co-cultivadas. Por ejemplo, las células epiteliales mamarias indujeron la muerte celular en células endoteliales en el co-cultivo 2D, y las células epiteliales mamarias disociadas no formaron esferoides 3D cuando se bioimprimieron en hidrogeles de alginato/gelatina38. Las células epiteliales o cancerosas de mama disociadas formaron esferoides en bioinks a base de alginato solo cuando se encerraban en moldes circulares de PDMS. En otros casos, los esferoides se formaron utilizando gotas suspendidas en placas circulares de pozos de fijación ultrabaja y luego se mezclaron en bioinks a base de alginato39,40.

Ahora describimos un método alternativo de biomanufacturación de tejidos 3D en este protocolo. En lugar de semillas disociadas y esperar a que estas células formen las estructuras 3D, describimos cómo crear y bioimprimir esferoides tumorales 3D en una red de tubos vasculares para crear un modelo de co-cultivo tumoral que se puede utilizar casi inmediatamente. Los esferoides tumorales pueden cultivarse in vitro o derivarse de tejidos humanos (organoides). Del mismo modo, los tubos vasculares se pueden cultivar o pueden derivarse de fragmentos microvasculares de tejido adiposo. Los bioinks pueden ir desde el alginato biológicamente inactivo hasta el altamente activo Matrigel41. Dado que este modelo de co-cultivo tumoral 3D se puede crear con una variedad de estructuras celulares y bioinks, puede incorporar múltiples tipos de células, matrices extracelulares y gradientes de quimiocina15,42. Mientras que en su formulación actual, las redes endoteliales no pueden ser perfundidas, futuras iteraciones podrían integrar este método con microfluidos o sistemas -on-chip. La bioimpresión de esferoides epiteliales de mamas 3D en redes endoteliales permite una biofabricación rápida de modelos mamarias humanos para pruebas de drogas y medicina de precisión personalizada27.

Protocolo

1. Crecimiento de células epiteliales mamarias y medios de ensayo

  1. Células epiteliales mamarias MCF10A
    NOTA: La línea celular epitelial mamaria inmortalizada no tumorigénica se deriva de una paciente con enfermedad fibroquística43. Las células no expresan el receptor de estrógeno.
    1. Para preparar 20 μg/mL factor de crecimiento epidérmico (EGF), disolver 100 μg de EGF liofilizado en 500 μL de dH estéril2O para hacer 200 μg/mL EGF. Añadir 500 μL de 200 μg/mL de EGF en 4,5 ml de BSA estéril del 0,1% en dH2O para hacer una solución de stock de EGF de 20 μg/mL. Almacene los alíquesas de EGF preparados de 20 μg/ml a -20 °C durante un tiempo de hasta 12 meses.
    2. Para preparar hidrocortisona de 500 μg/ml, diluya 1 mg de hidrocortisona en 1 ml de etanol absoluto (200 a prueba). Añadir 1 ml de DMEM F:12 estéril a esta mezcla para hacer una solución de 500 μg/mL de material hidrocortisona. Almacene los alíquesas de acciones de hidrocortisona a -80 °C durante un tiempo de hasta 12 meses.
    3. Para preparar 10 μg/ml de toxina del cólera, disolver 1 mg de polvo liofilizado de toxina del cólera en 1 ml de dHestéril 2O para hacer una solución de 1 mg/ml de caldo de toxina de cólera. Almacene las alícuotas de material de toxinas de cólera a -80 °C durante un plazo de hasta 12 meses.
    4. Para preparar el medio de crecimiento, añadir 500 μL de FEAG (20 μg/ml), 500 μL de hidrocortisona (500 μg/ml), 5 μL de toxina del cólera (1 mg/ml), 500 μL de insulina bovina (10 mg/ml), 10 ml de penicilina y estreptomicina, y 25 ml de suero de caballo a 500 ml de DMEM F:12 para una concentración final de 20 ng/mL de EGF, hidrocortisona de 500 ng/ml, toxina de cólera de 10 ng/ml, insulina bovina de 10 ng/ml, penicilina v/v 2% y estreptomicina, y 5% v/v de suero de caballo. La concentración de antibióticos se incrementó al 2% para tener en cuenta la disminución de la esterilidad en el proceso de bioimpresión; sin embargo, la concentración de antibióticos se puede reducir al 1%.
    5. Para preparar el medio de ensayo, añadir 500 μL de hidrocortisona (500 μg/ml), 5 μL de toxina del cólera (1 mg/ml), 500 μL de insulina bovina (10 mg/ml), 10 ml de penicilina y estreptomicina, y 25 ml de suero de caballo a 500 ml de DMEM F:12 para una concentración final de hidrocortisona de 500 ng/ml, toxina de cólera de 10 ng/ml, 10 ng/ml de insulina bovina, 2% de penicilina v/v y estreptomicina, y 5% de suero de caballo v/v.
  2. MDA-MB-231
    NOTA: La línea de células epiteliales de cáncer de mama triple negativo (que carece de receptor de estrógeno, receptor de progesterona y receptor de factor de crecimiento epidérmico 2) se crea a partir del derrame pleural de una paciente femenina con adenocarcinoma mamario metastásico44. Las células representan un cáncer de mama agresivo, invasivo y mal diferenciado.
    1. Para preparar el medio de crecimiento y ensayo, añadir 50 ml de suero bovino fetal, 10 ml de penicilina y estreptomicina, y 25 ml de suero de caballo a 500 ml de DMEM para una concentración final 10% v/ v suero bovino fetal, 2% v / v penicilina y estreptomicina, y 5% v / v suero de caballo.

2. Cultivo de células epiteliales mamarias

  1. Semillas 500.000 células MCF10A o MDA-MB-231 en un plato de cultivo de tejidos de 10 cm (P100) con 10 ml de MCF10A o MDA-MB-231. Las células MCF10A y MDA-MB-231 alcanzan >90% de confluencia en 48 horas.
  2. Para pasar las células epiteliales mamarias, primero lave las células con 10 ml de PBS caliente.
  3. Desasociar las células epiteliales mamarias añadiendo 2 ml de 0.05% trypsina-EDTA al plato. Coloque el plato en una incubadora de 37 °C, 5% CO2 durante 20-25 minutos.
  4. Agregue 5 ml de MCF10A o MDA-MB-231 Growth Medium a las células trippsinizadas para neutralizar la trippsina. Pipetear la mezcla de medios celulares hacia arriba y hacia abajo para resuspend células y romper cúmulos celulares.
  5. Añada la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml y a una centrífuga a 1.200 x g durante 3 minutos. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspend el pellet de celda en 5 ml de MCF10A o MDA-MB-231 Medio de crecimiento.
  6. Placa 1 mL de suspensión celular en 5 nuevos platos de cultivo de tejido de 10 cm junto con MCF10A o MDA-MB-231 Medio de crecimiento. Coloque los platos en una incubadora de 37 °C, 5% CO2. Las células estarán listas para ser aprobadas de nuevo en 2-3 días. Las células MCF10A se pueden mantener hasta el paso número 35, después de lo cual muestran cambios morfológicos. Las células MDA-MB-231 se pueden mantener hasta el paso número 24, después de lo cual muestran cambios morfológicos.

3. Formación de esferoides epiteliales mamales

  1. Congele 200 puntas de pipeta de μL durante 30 minutos antes de iniciar el ensayo. Mantenga la solución de matriz reducida del factor de crecimiento (por ejemplo, Matrigel) (10 mg/ml) en hielo durante todo el proceso.
  2. Pipeta lentamente 30 μL de solución de matriz helada utilizando puntas de pipeta heladas de 200 μL en cada pozo de un tobogán de cámara de 8 pozos. Comience por los lados y arrastre la punta de la pipeta a lo largo de las esquinas, añadiendo una gota final al centro del pozo para asegurar el recubrimiento uniforme de cada pozo. Evite burbujas de aire durante este paso para garantizar una capa de solución de matriz uniforme. Utilice nuevas puntas de pipeta para cada pozo.
  3. Incubar diapositivas de cámara en una incubadora de 37 °C, 5% CO2 durante 15-20 minutos para polimerizar la solución de matriz.
  4. Células MCF10A resuspend trypsinizadas en mcf10A assay Medium en 200,000 células/mL o células resuspend trypsinized MDA-MB-231 en MDA-MB-231 Medio de crecimiento a 200,000 células/ml.
  5. Si utiliza células MCF10A, prepare el medio de crecimiento esferoide MCF10A fresco añadiendo 5 μL de EGF (20 μg/ml) y 100 μL de solución matricial a 5 ml de Assay Medium para una concentración final de solución de matriz del 2%.
  6. Retire la diapositiva de cámara precodada con solución de matriz de la incubadora. Agregue 50 μL de suspensión celular MCF10A o MDA-MB-231 (10.000 células) a cada pozo. Si utiliza células MCF10A, agregue 450 μL de MCF10A Spheroid Growth Medium. Si utiliza células MDA-MB-231, agregue 450 μL de MDA-MB-231 Growth Medium premezclado con solución de matriz del 2% (9 μL). Coloque inmediatamente la diapositiva de la cámara en una incubadora de 37 °C, 5% CO2.
  7. Reemplace el medio cada 4 cuatro días. Pipeta cuidadosamente 200 μL de medios antiguos de una esquina de cada pozo utilizando una punta de pipeta de 200 μL. Durante este proceso, incline la diapositiva de la cámara a 45° para asegurarse de que los esferoides no se alteran. Añadir 200 μL de MCF10A Spheroid Growth Medium recién preparado o MDA-MB-231 Growth Medium mezclado previamente con una solución de matriz del 2% a cada pozo en la esquina en gotas para asegurarse de que los esferoides permanezcan unidos a la capa de matriz. Sólo ~ 50% de los medios se reemplazan de modo que todas las citoquinas producidas por los esferoides no están completamente agotados.
    NOTA: Los esferoides epiteliales de mama MCF10A tardan hasta 8 días en polarizar y formar centros huecos. Los esferoides epiteliales mamario MDA-MB-231 tardan hasta 5 días en formarse y no tienen centros huecos.

4. Formación de redes celulares endoteliales

  1. Cultivo de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC)
    1. Añadir el contenido de un único kit de crecimiento endotelial medio-2 que contiene factor de crecimiento de insulina, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento endotelial vascular, ácido ascórbico, factor de crecimiento epidérmico, heparina y gentamicina-anfotericina B, junto con 50 ml de suero bovino fetal, 5 ml de penicilina-estreptomicina y 5 ml de glutamina de 200 mM a 500 ml de basal basal endotelial medio-2 (EBM-2) para crear un medio de crecimiento endotelial completo (EGM-2).
    2. Semillas 500.000 células endoteliales en un plato de cultivo tisular de 10 cm en 10 ml de EGM-2. Coloque las células en una incubadora de 37 °C, 5% CO2 hasta que alcancen >80% de confluencia (alrededor de 48 horas).
    3. A las células de paso, lave las células endoteliales con 10 ml de PBS caliente. Desenganche HUVEC añadiendo 2 ml de 0.05% Trypsin-EDTA al plato de cultivo de tejido de 10 cm. Monitoree de cerca las células por microscopía de contraste de fase. Las células están listas cuando son en bolas, pero permanecen unidas al plato.
    4. Aspirar cuidadosamente la trypsin fuera del plato. Añadir 8 ml de EGM-2 al plato. Lave las células del plato pipeteando el EGM-2 hacia arriba y hacia abajo sobre toda la superficie del plato.
    5. Alternativamente, agregue 5 ml de EGM-2 a las células trippsinizadas para neutralizar la trypsina. Pipetear la mezcla de medios celulares hacia arriba y hacia abajo para resuspend células y romper cúmulos celulares. Añada la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml y a una centrífuga a 1.200 x g durante 3 minutos. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspend el pellet celular en 10 mL de EGM-2.
    6. Añadir 1 ml de suspensión celular a 9 ml de EGM-2 en un plato de cultivo de tejido de 10 cm. Coloque los platos en una incubadora de 37 °C, 5% CO2. Intercambio 2/3 del medio con EGM-2 fresco cada 2 días. Las células estarán listas para pasar en 3-5 días. HUVEC se puede mantener hasta el paso 8 después del cual no pueden formar redes.
  2. Formación de redes de células endoteliales (HUVEC)
  3. Congele 200 puntas de pipeta de μL durante 30 minutos antes de iniciar el ensayo. Mantenga la solución de matriz reducida del factor de crecimiento (10 mg/ml) en hielo durante todo el proceso.
  4. Pipeta lentamente 30 μL de solución de matriz helada utilizando puntas de pipeta heladas de 200 μL en cada pozo de un tobogán de cámara de 8 pozos. Comience por los lados y arrastre la punta de la pipeta a lo largo de las esquinas, añadiendo una gota final al centro del pozo para asegurar el recubrimiento uniforme de cada pozo. Evite burbujas de aire durante este paso para garantizar una capa de solución de matriz uniforme. Utilice nuevas puntas de pipeta para cada pozo.
  5. Incubar portaobjetos de cámara en una incubadora de 37 °C, 5% CO2 durante 15-20 minutos para polimerizar Matrigel.
    1. Pre-manchar un plato de 10 cm de HUVEC con 10 μL de rastreador de células rojas (1:1000) durante 30 minutos en 37 °C, 5% co2 incubadora.
    2. Lave las células endoteliales con 10 ml de PBS caliente. Desenganche HUVEC añadiendo 2 ml de 0.05% Trypsin-EDTA al plato de cultivo de tejido de 10 cm. Coloque el plato en una incubadora de 37 °C, 5% CO2 durante 5 minutos para separar completamente las células.
    3. Añadir 5 ml de EGM-2 al plato para neutralizar la trypsina. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 25 ml. Centrífuga HUVEC a 1.200 x g durante 5 minutos. Aspirar el sobrenadante y resuspend el pellet celular en 5 ml de EBM-2 sin suero.
    4. Cuente celdas usando Trypan blue para determinar celdas viables. Cree una solución de 1 x10 6 celdas/ml.
    5. Añadir 100.000 HUVEC a cada pozo con 200 μL de EBM-2 libre de suero. Si se agregan más celdas, crearán una monocapa de superficie en lugar de una red de tubos.
    6. Incubar HUVEC en una incubadora de 37 °C, 5% CO2. Después de 6 horas, imagen HUVEC redes por microscopía de contraste fase. Las redes ya están listas para la cocultura con esferoides de pecho.

5. Bioimpresión de esferoides epiteliales mamario en redes HUVEC preformadas

NOTA: Se debe utilizar un sistema de biodeposición de boquilla dual para el proceso de biofabricación. En este caso, el sistema tenía tres brazos de movimiento para permitir el control espacial a escala de micron de la deposición de material, así como dos motores accionados por tornillo para depositar bioink de jeringas de 10 ml. El sistema debe funcionalizarse con un sistema de filtración de aire particulado de alta eficiencia, así como capacidades de esterilización UV para mantener un entorno estéril durante la bioimpresión. El bioimpresora está esterilizado uv durante una hora antes del proceso de impresión.

  1. Cree esferoides epiteliales mamarios y redes HUVEC como se describió anteriormente. Calcule el número de esferoides epiteliales mamales en cada pozo contando esferoides en imágenes de microscopía de contraste de fase representativa.
  2. Corte 0,5 cm del extremo de una punta de pipeta de 1000 μL. Utilice la punta de la pipeta cortada para canalizar cuidadosamente todos los esferoides de la tobogán de cámara de 8 pozos y en un tubo de 50 ml. Esferoides resuspend en el bioink seleccionado a 100 esferoides/100 μL.
    NOTA: Concentraciones de esferoides más altas pueden resultar en agrupación esferoide y evitar la visualización de interacciones entre los esferoides y las redes endoteliales.
  3. Pase la mezcla de esferoides a través de un colador de células de 70 μm para eliminar cualquier esferoide grande o agrupado.
  4. Cargue los esferoides agrupados en una jeringa estéril de 10 ml y colóquela con una aguja estéril del calibre 25. Conecte la jeringa al sistema de biodeposición.
  5. Aspirar el medio de las redes HUVEC en el tobogán de cámara de 8 pozos.
  6. Extruya 100 μL de esferoides epiteliales mamales en 6 pozos de redes HUVEC a un caudal de 1 mL/min. Mantenga 2 pozos de redes HUVEC como controles.
  7. Añadir 400 μL de MCF10A Spheroid Growth Medium si utiliza esferoides MCF10A impresos en redes HUVEC o añadir 400 μL MDA-MB-231 Medio de crecimiento mezclado previamente con solución matriz del 2% si utiliza esferoides MDA-MB-231 impresos en redes HUVEC. El medio de crecimiento de esferoides respectivo debe utilizarse en pozos de control HUVEC.
  8. Incubar co-cultivos en una incubadora de 37 °C, 5% CO2 durante 24 – 96 horas sin un cambio de medios. Las coculturas seguirán siendo viables en el medio original hasta por cuatro días.

6. Microscopía confocal

  1. Inmunofluorescencia y preparación del tampón de lavado PBS-Glycine
    1. Preparar inmunofluorescencia (IF) buffer 10x solución de stock mediante la adición de 2,5 g de azide sódico, 5 g de albúmina sérica bovina, 10 ml de Tritón X-100, y 2,05 ml de Tween-20 en 500 ml de 10x PBS. Ajuste el pH a 7,4. Almacene la solución de stock durante un año a 4 °C para evitar la sedimentación.
    2. Cree un búfer IF en funcionamiento diluyendo 50 ml de 10x Tampón IF en 450 ml de agua desionizada estéril. Almacene la solución de trabajo a temperatura ambiente durante un tiempo de hasta una semana.
    3. Prepare 10x solución de almacenamiento en búfer PBS-Glycine añadiendo 37,5 g de glicina a 500 ml de 10x PBS. Ajuste el pH a 7,4. Almacene la solución de stock durante un tiempo de hasta 6 meses a 4 °C para evitar la sedimentación.
    4. Cree una solución PBS-Glycine en funcionamiento diluyendo 50 ml de tampón PBS-Glycine de 10x en 450 ml de agua desionizada estéril. Almacene la solución de trabajo a 4 °C durante una semana.
  2. Etiqueta Muestras bioimpresas e imagen por microscopía confocal
    1. Aspirar medio de co-cultivos 3D bioimpresos y enjuagar 3 veces con PBS caliente. Corrija los co-cultivos 3D bioimpresos con un 4% de paraformaldehído durante 1 h a temperatura ambiente. Enjuague muestras 3 veces durante 20 minutos con 1x PBS-Glycine.
    2. Bloquee muestras con búfer IF mezclado con 10% suero de cabra durante 90 minutos (bloque primario), seguido de 40 minutos con buffer IF más 10% suero de cabra y fragmento Affinipure Fab (1:100, bloque secundario).
    3. Si utiliza esferoides MCF10A, etiquete muestras con un anticuerpo primario para integrina α6 (1:100) en búfer de bloqueo secundario durante la noche a 4 °C, seguido de un anticuerpo secundario Alexa Fluor 488 (1:200) y Hoescht 33342 (1:1000) para 1 h a temperatura ambiente protegido de la luz. Las líneas celulares MCF10A expresan altos niveles de integrina α6, que es esencial para mostrar polarización esferoide y morfología.
    4. Si utiliza esferoides MDA-MB-231, que expresan bajos niveles de integrina α6, etiquete muestras con fhalloidina Alexa Fluor 488 (1:100) y Hoescht 33342 (1:1000) en búfer de bloqueo secundario durante 4 horas a temperatura ambiente protegida de la luz. La faloidina permite la visualización del filamento actin para que se pueda evaluar la morfología amorfa e invasiva esferoide.
    5. Lave muestras con 1X PBS-glicina 3 veces durante 20 minutos.
    6. Prepare muestras para el montaje retirando la diapositiva de la cámara con la herramienta del fabricante. Agregue una pequeña gota de solución antifadios a cada pozo. Coloque una funda de 22 mm x 60 mm en cada tobogán de cámara y selle cuidadosamente los bordes con esmalte de uñas transparente.
    7. Muestras de imagen utilizando un microscopio confocal como pilas Z de ~10 rebanadas en pasos de 5 μm. Si lo desea, comprima planos Z en un solo plano mediante el comando Enfoque extendido en el software de imágenes celulares.
    8. Cuantificar la adhesión esferoide a las redes endoteliales utilizando la imagen J. El número de esferoides adherentes se puede cuantificar utilizando el plugin analyze con el tamaño de partícula y la circularidad adecuados. Normalice el número de esferoides conectados al área de imagen.
    9. Para garantizar la reproducibilidad, cuantifique el número de esferoides adheridos en 4 x 4 imágenes en mosaico de co-culturas. Si el número de esferoides es estadísticamente significativamente menor que otros experimentos, el experimento debe repetirse.

Resultados

Las células epiteliales mamarias deben autoorganización en esferoides 3D después de 5-8 días de cultivo en solución de matriz y en medio de cultivo con 2% solución de matriz. Los esferoides epiteliales de mama MCF10A no tumorigénicos deben aparecer redondos y tener un centro hueco, con integrina α6 polarizada al borde exterior del esferoide(Figura 1,inset muestra centros huecos). Las células epiteliales de cáncer de mama MDA-MB-231 altamente invasivas forman esferoides irregulares....

Discusión

Este protocolo es el primero de su tipo en bioimprimir esferoides en su arquitectura 3D para co-cultivo con células endoteliales también en su arquitectura 3D. Los pasos críticos del protocolo incluyen la formación inicial de esferoides epiteliales mamales y redes HUVEC. Se debe tener extrema precaución en la alimentación de esferoides epiteliales mamarios, ya que se interrumpen fácilmente de la solución de matriz. Del mismo modo, los esferoides epiteliales mamales deben tratarse con cuidado cuando se pipetizan f...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada por NIH 1R01HL140239-01 a AMC. Nos gustaría dar las gracias al Centro de Imágenes Celulares de la Universidad drexel.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
37°C incubator, 5% CO2 and 95% humiditySanyoMCO-20AICCell incubation
3D Bio printercustom-madeNoneUsed for bioprinting
8-well chamber slidesVWR, Radnor, PA53106-306for seeding spheroids
25-gauge needleSigma, St. Louis, MOZ192406-100EAbioprinting syringe needle
Absolute ethanol (200 proof )Sigma, St.Louis, MOE7023-500MLreconsitution of media components
Affinipure F(ab′)2 fragment goat anti-mouse IgGJackson ImmunoResearch, West Grove, PA115006020secondary block - Immunofluorescence
Alexa Fluor 488 (1:200)Thermo Fisher, Waltham, MAA-11006Seconday antibody-Immunofluorescence
Bovine insulinSigma, St.Louis, MOI-035-0.5MLMCF10A Media additive
Bovine serum albumin (BSA)Sigma, St.Louis, MOA2153-500GBlocking agent -Immunofluorescence
Falcon 70 µm Cell StrainerCorning, Corning, NY352350Remove large or clustered spheroids
CellTracker™ Red CMTPX DyeThermo Fisher, Waltham, MAC34552pre-stain for HUVEC tubes
Compact CentrifugeHermle- Labnet, Edison ,NJZ206AFor cell centrifugations
Cholera ToxinSigma, St.Louis, MOC8052-.5MGMCF10A Media additive
Conical tubes 15 mLVWR, Radnor, PA62406-200Collecting and resuspending cells
Countess II-FL Cell counterThermo Fisher, Waltham, MAAMQAF1000counting cells
Glass pipettes (10 mL)VWR, Radnor, PA76184-746cell resuspension
DMEM F:12Thermo Fisher, Waltham, MA11320033MCF10A basal media
DMEM 1XVWR, Radnor, PA10-014-CVMDA-MB-231 basal media
Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2)Lonza, Durham, NCCC-3156HUVEC basal media
Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2)Lonza, Durham, NCCC-3162Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors)
Alexa Fluor™ 488 PhalloidinThermo Fisher, Waltham, MALabelling MDA-MB-231 spheroids
Fetal Bovine serumCytiva, Logan, UTSH30071.03HUVEC/MDA-MB-231 media additive
Goat serumThermo Fisher, Waltham, MA16210064Immunofluorescence labelling component
GlycineSigma, St.Louis, MOG8898-500Gimmunofluorescence buffer component
Hoescht 33342Thermo Fisher, Waltham, MA62249Nuclei stain immunofluorescence
Horse SerumThermo Fisher, Waltham, MA16050130MCF10A Media additive
HydrocortisoneSigma, St.Louis, MOH0888-5GMCF10A Media additive
Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs)Cell applications, San Diego , CA200-05fEndothelial cell lines
Integrin α6Millipore, Billerica, MAMAB1378Immunofluorescence spheroid labelling component
Live Dead assayThermo Fisher, Waltham, MAL3224Live and dead cell stain assay for cell viability
LSM 700 Confocal microscopeZeiss, Thornwood, NYUsed to visualize cells
Matrigel - growth factor reduced 10 mg/mlVWR, Radnor, PA354230Spheroid formation
MCF10A cellsATCCCRL-10317Breast cell line
MDA-MB-231 cellsATCCHTB-26Breast cell line
ParaformaldehydeSigma, St.Louis, MO158127-500Gcell fixative
Penicillin and streptomycinThermo Fisher, Waltham, MA15140122MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive
Phosphate Buffered Saline 1X (PBS)Thermo Fisher, Waltham, MA7001106Wash buffer for cells before trypsinization
Phosphate buffer saline 10XThermo Fisher, Waltham, MAAM9625immunofluorescence buffer component
Prolong gold antifadeThermo Fisher, Waltham, MAP36934immunofluorescence mountant medium
Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGFPeprotech, Rocky Hill, NJAF-100-15MCF10A/ assay media component
Sodium AzideSigma, St.Louis, MOS2002-25Gimmunofluorescence buffer component
Sterile syringe (10 mL)VWR, Radnor, PA75846-757bioprinting process
Tissue culture dish (10cm)VWR, Radnor, PA25382-166monolayer cell culture
Triton X-100Sigma, St.Louis, MOT8787-250MLimmunofluorescence buffer component
Trypan blue 0.4%Thermo Fisher, Waltham, MA15250061cell counter additive
Trypsin-EDTA 0.05%Thermo Fisher, Waltham, MA25300054cell detachment
Tween -20Thermo Fisher, Waltham, MA85113immunofluorescence buffer component
Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165)Peprotech, Rocky Hill, NJ100-20HUVEC tube additive
Volocity 6.3 cell imaging softwarePerkinElmer, Hopkinton, MAZ stack compresser

Referencias

  1. Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
  2. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  3. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  4. Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
  5. Sokol, E. S., et al. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 19 (2016).
  6. Howlett, A. R., Bailey, N., Damsky, C., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Cellular growth and survival are mediated by beta 1 integrins in normal human breast epithelium but not in breast carcinoma. Journal of Cell Science. 108, 1945-1957 (1995).
  7. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  8. Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
  9. Wang, F., et al. Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (25), 14821-14826 (1998).
  10. Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nature Cell Biology. 3 (9), 785-792 (2001).
  11. Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (2), 521-526 (2003).
  12. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111 (1), 29-40 (2002).
  13. Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2 (3), 205-216 (2002).
  14. Yamada, K. M., Clark, K. Cell biology: survival in three dimensions. Nature. 419 (6909), 790-791 (2002).
  15. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116, 2377-2388 (2003).
  16. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
  17. Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 83-101 (2008).
  18. Sacharidou, A., et al. Endothelial lumen signaling complexes control 3D matrix-specific tubulogenesis through interdependent Cdc42- and MT1-MMP-mediated events. Blood. 115 (25), 5259-5269 (2010).
  19. Buchanan, C. F., et al. Cross-talk between endothelial and breast cancer cells regulates reciprocal expression of angiogenic factors in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (4), 1142-1151 (2012).
  20. Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. In vitro angiogenesis induced by tumor-endothelial cell co-culture in bilayered, collagen I hydrogel bioengineered tumors. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (11), 864-874 (2013).
  21. Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Stromal endothelial cells directly influence cancer progression. Science Translational Medicine. 3 (66), 66 (2011).
  22. Franses, J. W., Drosu, N. C., Gibson, W. J., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Dysfunctional endothelial cells directly stimulate cancer inflammation and metastasis. International Journal of Cancer. 133 (6), 1334-1344 (2013).
  23. Phamduy, T. B., et al. Printing cancer cells into intact microvascular networks: a model for investigating cancer cell dynamics during angiogenesis. Integrative Biology. 7 (9), 1068-1078 (2015).
  24. Connor, Y., et al. Physical nanoscale conduit-mediated communication between tumour cells and the endothelium modulates endothelial phenotype. Nature Communications. 6, 8671 (2015).
  25. Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nature Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
  26. Strilic, B., et al. Tumour-cell-induced endothelial cell necroptosis via death receptor 6 promotes metastasis. Nature. 536 (7615), 215-218 (2016).
  27. Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), 539-553 (2015).
  28. Belgodere, J. A., et al. Engineering Breast Cancer Microenvironments and 3D Bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66 (2018).
  29. Jang, J., Yi, H. G., Cho, D. W. 3D Printed Tissue Models: Present and Future. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (10), 1722-1731 (2016).
  30. Sobrino, A., et al. 3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks. Scientific Reports. 6, 31589 (2016).
  31. Chen, M. B., Whisler, J. A., Jeon, J. S., Kamm, R. D. Mechanisms of tumor cell extravasation in an in vitro microvascular network platform. Integrative Biology. 5 (10), 1262-1271 (2013).
  32. Hassell, B. A., et al. Human Organ Chip Models Recapitulate Orthotopic Lung Cancer Growth, Therapeutic Responses, and Tumor Dormancy In vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
  33. Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
  34. Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), 539-553 (2015).
  35. Zhao, Y., et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. 6 (3), 035001 (2014).
  36. Zhang, Y. S., et al. Bioprinting the Cancer Microenvironment. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (10), 1710-1721 (2016).
  37. Ouyang, L., et al. Three-dimensional bioprinting of embryonic stem cells directs highly uniform embryoid body formation. Biofabrication. 7 (4), 044101 (2015).
  38. Swaminathan, S., Ngo, O., Basehore, S., Clyne, A. M. Vascular Endothelial-Breast Epithelial Cell Coculture Model Created from 3D Cell Structures. ACS Biomaterials Science & Engineering. 3 (11), 2999-3006 (2017).
  39. Vorwald, C. E., Ho, S. S., Whitehead, J., Leach, J. K. High-Throughput Formation of Mesenchymal Stem Cell Spheroids and Entrapment in Alginate Hydrogels. Methods in Molecular Biology. 1758, 139-149 (2018).
  40. Chaji, S., Al-Saleh, J., Gomillion, C. T. Bioprinted Three-Dimensional Cell-Laden Hydrogels to Evaluate Adipocyte-Breast Cancer Cell Interactions. Gels. 6 (1), (2020).
  41. Swaminathan, S., Hamid, Q., Sun, W., Clyne, A. M. Bioprinting of 3D breast epithelial spheroids for human cancer models. Biofabrication. 11 (2), 025003 (2019).
  42. Radisky, D., Muschler, J., Bissell, M. J. Order and disorder: the role of extracellular matrix in epithelial cancer. Cancer Investigation. 20 (1), 139-153 (2002).
  43. Qu, Y., et al. Evaluation of MCF10A as a Reliable Model for Normal Human Mammary Epithelial Cells. PLoS One. 10 (7), 0131285 (2015).
  44. Chavez, K. J., Garimella, S. V., Lipkowitz, S. Triple negative breast cancer cell lines: one tool in the search for better treatment of triple negative breast cancer. Breast Disease. 32 (1-2), 35-48 (2010).
  45. Swaminathan, S., Cranston, A. N., Clyne, A. M. A Three-Dimensional In vitro Coculture Model to Quantify Breast Epithelial Cell Adhesion to Endothelial Cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (10), 609-618 (2019).
  46. Lee, J. M., et al. Generation of uniform-sized multicellular tumor spheroids using hydrogel microwells for advanced drug screening. Scientific Reports. 8 (1), 17145 (2018).
  47. Frueh, F. S., Spater, T., Scheuer, C., Menger, M. D., Laschke, M. W. Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering. Journal of Visualized Experiments. (122), e55721 (2017).

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

Bioingenier aN mero 165Bioimpresi nbioinksModelos de co cultivo in vitro 3Desferoides de mamac lulas endotelialesc ncer

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados