JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokolün amacı, ilaç tarama çalışmaları için kullanılabilecek 3D meme endotelyal ortak kültür modellerini hızla oluşturmak için önceden oluşturulmuş endotel ağlarına çok hücreli sferoidler olarak meme epitel hücrelerini doğrudan biyobaskılamaktır.

Özet

Biyobaskı, in vivo doku mimarisinin kritik özelliklerini daha iyi yeniden toplayan 3D insan kanseri modelleri imal etmek için umut verici bir araç olarak ortaya çıkıyor. Mevcut katman katman ekstrüzyon biyobaskısında, tek tek hücreler hiyerarşik doku kendini birleştirmeyi teşvik etmek için karmaşık mekansal ve zamansal ipuçları ile birlikte bir biyoinkte ekstrüde edilir. Bununla birlikte, bu biyofabrikasyon tekniği hücreler, biyoinksler ve biyokimyasal ve biyofiziksel ipuçları arasındaki karmaşık etkileşimlere dayanır. Bu nedenle, kendi kendine montaj günler hatta haftalar sürebilir, belirli biyoinksler gerektirebilir ve her zaman birden fazla hücre tipi söz konusu olduğunda ortaya çıkmayabilir. Bu nedenle, çeşitli biyoinkslerde önceden oluşturulmuş 3D meme epitel sferoidlerini doğrudan biyobaskılamak için bir teknik geliştirdik. Biyobaskı önceden oluşturulmuş 3D meme epitel sferoidleri baskıdan sonra canlılıklarını ve polarize mimarilerini sürdürdüler. Ayrıca 3D sferoidleri vasküler endotel hücre ağlarına yazdırarak ortak kültür modeli oluşturduk. Böylece, yeni biyobaskı tekniği hızla daha düşük maliyetle ve geleneksel biyobaskı tekniklerinden daha yüksek esneklikle daha fizyolojik olarak ilgili bir 3D insan meme modeli oluşturur. Bu çok yönlü biyobaskı tekniği, ek biyoinkslerde diğer dokuların 3D modellerini oluşturmak için tahmin edilebilir.

Giriş

3D in vitro vasküler tümör modelleri kanser büyümesi ve metastazının mekanistik çalışması için gerekli araçlardır. Özellikle meme kanseri için, Matrigel'de kültürlenen meme epitel hücreleri, in vivo meme acinus mimarisine daha yakından benzeyen polarize sferoidler halinde organize edilir1,2,3 ,4,5,6,7,8. 3D meme epitel hücre kültürü de hücre fonksiyonunu etkiler, 3D kültürler epidermal büyüme faktörü (EGF) reseptör modülasyonunda farklılıklar gösterir8,9; ErbB210dahil onkogen fonksiyonu; büyüme ve apoptoz sinyal11,12; ve kemoterapi direnci13,14. Vasküler endotel hücreleri benzer şekilde 3D ve geleneksel 2D kültür15 , 16 , 17,18'deçevresel uyaranlara farklı yanıt verir. Bununla birlikte, vasküler endotel ve meme epitel etkileşimlerinin anlaşılmasının çoğu, şartlandırılmış orta veya Transwell kesici uçlar kullanılarak 2D kültüründen veya iki hücre tipinin fiziksel olarak ayrıldığı 3D modellerden gelir19,20,21,22,23. Bu ortak kültür modelleri sınırlı fizyolojik içgörü sağlar, çünkü hem 3D kültür hem de hücre-hücre teması vasküler endotel için kritik öneme sahiptir - meme epitel hücre etkileşimleri24,25,26.

3D kanser modelleri, hidrojellerde veya mühendislik iskelelerinde asılı damla küresel oluşumu, biyobaskı, manyetik montaj ve kültür dahil olmak üzere çeşitli teknikler kullanılarak üretilmiştir5,27,28,29. Daha yakın zamanda, kendi 3D yapılarında düzenlenmiş birden fazla hücre tipi ile 3D tümör modelleri oluşturulmuştur. Çip üzerindeki tümör platformunun bir örneğinde, kanser, endotel ve stromal hücreler bir matrise karıştırıldı ve daha sonra polidimetilsiloksiksan (PDMS) cihazındaki üç merkezi doku odasına enjekte edildi. Doku odaları, arter ve venule'yi temsil eden iki dış kanalla sınırlandı. 5-7 günlük kültürden sonra endotel hücreleri bir mikrovasküler ağ oluşturdu ve kanser hücreleri çoğalarak vaskülatın yakınında küçük tümörler oluşturdu. Bu platform daha sonra uyuşturucu ve ilaç kombinasyonlarını taramak için kullanıldı30. Belirli mekanik uyaranlara (örneğin, akciğerdeki mekanik zorlanma) sahip metastaz ve kanser türlerini incelemek için ek çip üzerinde tümör platformları oluşturulmuştur31,32. Bununla birlikte, bu platformlar genellikle ilgili 3D yapılarında hem vaskülat hem de kanser içermez.

Biyofabrikasyon, hücre konumu üzerinde sıkı mekansal kontrol sağladığından, 3D in vitro vasküler tümör modellerinin ilerletmesinde büyük umut vaat ediyor. Son on yılda biyobaskı büyümesine rağmen, çok az çalışma özellikle tümörlere odaklanmaktadır33,34. Bir örnekte, in vitro serviks kanseri modeli oluşturmak için hela hücrelerinin jelatin/aljinat/fibrinojen hidrojelde 3D baskısı kullanılmıştır. Tümör hücreleri tek tek hücreler olarak biyobaskı yapıldı ve daha sonra daha yüksek çoğalma oranı, matris metalloproteinaz ekspresyözü ve 2D kültürdeki hücrelerden daha yüksek chemoresistance gösteren küreseller oluşturmasına izin verildi35. Bu çalışmalarda, diğerlerinde olduğu gibi36,37, ayrışmış hücre süspansiyonları biyobaskı verildi ve daha sonra hücre kültürlerine hücrelerin 3D bir yapı oluşturmasını sağlamak için gerekli mekanik ve biyokimyasal ipuçları sağlandı. Bununla birlikte, hücresel kendi kendine montaj günler veya haftalar sürebilir, karmaşık uzamsal ve zamansal çevresel ipuçları gerektirebilir veya iki hücre tipi birlikte kültürlendiğinde gerçekleşmeyebilir. Örneğin, meme epitel hücreleri 2D ortak kültürde endotel hücrelerinde hücre ölümüne neden oldu ve ayrışmış meme epitel hücreleri aljinat / jelatin hidrojellerinde biyobaskılandığında 3D sferoidler oluşturmadı38. Dissosiyatif meme epitel veya kanser hücreleri aljinat bazlı biyoinkslerde sadece dairesel PDMS kalıplarına yakalandığında sferoidler oluşturdu. Diğer durumlarda, sferoidler ultra düşük bağlanma dairesel kuyu plakalarında askıya alınmış damlacıklar kullanılarak oluşturulmuş ve daha sonra aljinat bazlı biyoinks39,40' a karıştırılmıştır.

Şimdi bu protokolde alternatif bir 3D doku biyomüslüm yöntemini tarif ediyoruz. Tohum ayrışmış hücreler yerine ve bu hücrelerin 3D yapıları oluşturmasını beklemek yerine, hemen kullanılabilecek bir tümör ortak kültür modeli oluşturmak için vasküler bir tüp ağında 3D tümör sferoidlerinin nasıl oluşturulacağını ve biyobaskı yapılacağını açıklıyoruz. Tümör sferoidleri in vitro olarak yetiştirilebilir veya insan dokularından (organoidler) türetilebilir. Benzer şekilde, vasküler tüpler yetiştirilebilir veya yağ dokusu mikrovasküler parçalarından elde edilebilir. Biyoinksler biyolojik olarak aktif olmayan aljinattan son derece biyolojik olarak aktif Matrigel41'ekadar değişebilir. Bu 3D tümör ortak kültür modeli çeşitli hücre yapıları ve biyoinks ile oluşturulabildiğinden, birden fazla hücre tipi, hücre dışı matrisler ve kemokin gradyanları15,42. Mevcut formülasyonunda, endotel ağları perfüzyona maruz kalamasa da, gelecekteki yinelemeler bu yöntemi mikrofluidler veya yonga üzerindeki sistemlerle entegre edebilir. Endotel ağlarına biyobaskı 3D meme epitel sferoidleri, ilaç testi ve kişiselleştirilmiş hassas tıp için insan meme modellerinin hızlı biyofabrikasyonuna olanak sağlar27.

Protokol

1. Meme Epitel Hücre Büyümesi ve Assay Medya

  1. MCF10A meme epitel hücreleri
    NOT: Tümörojenik olmayan ölümsüzleştirilmiş meme epitel hücre hattı fibrokistik hastalığı olan bir hastadan türetilmiştir43. Hücreler östrojen reseptörü ifade etmez.
    1. 20 μg/mL epidermal büyüme faktörü (EGF) hazırlamak için, 200 μg/mL EGF yapmak için 500 μL steril dH2O'da 100 μg lyophilized EGF çözün. 20 μg/mL EGF stok çözeltisi yapmak için dH 2 O'da 4,5 mL steril%0,1 BSA'ya 500 μL 200 μg/mL EGF ekleyin. Mağaza 12 aya kadar -20 °C'de 20 μg/mL EGF aliquots hazırladı.
    2. 500 μg/mL hidrokortizon hazırlamak için, 1 mg hidrokortizon 1 mL mutlak etanol (200 kanıt) seyreltin. 500 μg/mL hidrokortizon stok çözeltisi yapmak için bu karışıma 1 mL steril DMEM F:12 ekleyin. Hydrocortisone stok aliquots'u -80 °C'de 12 aya kadar saklayın.
    3. 10 μg/mL kolera toksini hazırlamak için, 1 mg/mL kolera toksin stok çözeltisi yapmak için 1 mg steril dH 2 O'da1mg kolera toksini lyophilized tozunu çözün. Kolera toksin stok aliquotlarını -80 °C'de 12 aya kadar saklayın.
    4. Growth Medium'u hazırlamak için 500 μL EGF (20 μg/mL), 500 μL hidrokortizon (500 μg/mL), 5 μL kolera toksini (1 mg/mL), 500 μL sığır insülini (10 mg/mL), 10 mL penisilin ve streptomisin ekleyin, ve 20 ng/mL EGF'lik son konsantrasyon için 500 mL DMEM F:12'ye 25 mL at serumu, 500 ng/mL hidrokortizon, 10 ng/mL kolera toksini, 10 ng/mL sığır insülini, %2 v/v penisilin ve streptomisinin ve %5 v/v at serumu. Biyobaskı işleminde sterilitenin azalmasını hesaba katmak için antibiyotik konsantrasyonu% 2'ye yükseltildi; bununla birlikte, antibiyotik konsantrasyonu% 1'e düşürülebilir.
    5. Assay Medium'u hazırlamak için 500 μL hidrokortizon (500 μg/mL), 5 μL kolera toksini (1 mg/mL), 500 μL sığır insülini (10 mg/mL), 10 mL penisilin ve streptomisin ekleyin, ve 500 mL hidrokortizon, 10 ng/mL kolera toksini, 10 ng/mL sığır insülini, %2 v/v penisilin ve streptomisin ve %5 v/v at serumu için 500 mL'ye 25 mL at serumu.
  2. MDA-MB-231
    NOT: Üç negatif (östrojen reseptörü, progesteron reseptörü ve epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 eksikliği) meme kanseri epitel hücre hattı metastatik meme adenokarsinomlu bir kadın hastanın plevral efüzyonundan oluşturulur44. Hücreler agresif, invaziv ve kötü farklılaşmış bir meme kanserini temsil eder.
    1. Growth and Assay Medium'ı hazırlamak için 50 mL fetal sığır serumu, 10 mL penisilin ve streptomisine ve 500 mL DMEM'e 25 mL at serumu ekleyerek son konsantrasyon için %10 v/v fetal sığır serumu, %2 v/v penisilin ve streptomisinin ve %5 v/v at serumu ekleyin.

2. Meme Epitel Hücre Kültürü

  1. 10 mL MCF10A veya MDA-MB-231 büyüme ortamına sahip 10 cm (P100) doku kültürü çanasında tohum 500.000 MCF10A veya MDA-MB-231 hücresi. MCF10A ve MDA-MB-231 hücreleri 48 saat içinde %90 birliğe ulaşır.
  2. Meme epitel hücrelerini geçirmek için, önce 10 mL sıcak PBS ile hücreleri yıkayın.
  3. Meme epitel hücrelerini yemeğe %0,05 Trypsin-EDTA'nın 2 mL'sini ekleyerek ayırın. Yemeği 20-25 dakika boyunca 37 °C,%5 CO 2 inkübatöre yerleştirin.
  4. Trypsin nötralize hücrelerine 5 mL MCF10A veya MDA-MB-231 Growth Medium ekleyin. Hücreleri yeniden gerçekleştirmek ve hücre kümelerini parçalamak için hücre ortamı karışımını yukarı ve aşağı pipetleyin.
  5. Hücre süspansiyonu 15 mL konik tüpe ve 3 dakika boyunca 1.200 x g'da santrifüje ekleyin. Süpernatantı dikkatlice aspire edin ve hücre peletini 5 mL MCF10A veya MDA-MB-231 Growth Medium'da yeniden ıslatın.
  6. MCF10A veya MDA-MB-231 Growth Medium ile birlikte 5 yeni 10 cm doku kültürü yemeklerinde 1 mL hücre süspansiyonu plakası. Bulaşıkları 37 °C, %5 CO2 inkübatöre yerleştirin. Hücreler 2-3 gün içinde tekrar geçişe hazır olacaktır. MCF10A hücreleri 35 numaralı geçişe kadar korunabilir, daha sonra morfolojik değişiklikler gösterirler. MDA-MB-231 hücreleri 24 numaralı geçişe kadar korunabilir, daha sonra morfolojik değişiklikler gösterirler.

3. Meme Epitel Sferoid Oluşumu

  1. Teste başlamadan önce 200 μL pipet uçlarını 30 dakika dondurun. Büyüme faktörü azaltılmış matris çözeltisini (örneğin Matrigel) (10 mg/mL) tüm süreç boyunca buz üzerinde tutun.
  2. Yavaşça pipet 30 μL buz gibi matris çözeltisi, 8 kuyulu bir oda kaydırağının her kuyusuna buz gibi 200 μL pipet uçları kullanarak. Yanlardan başlayın ve pipet ucunu köşeler boyunca sürükleyin, her bir kuyunun eşit şekilde kaplanmasını sağlamak için kuyunun ortasına son bir damla ekleyerek. Düzgün bir matris çözelti katmanı sağlamak için bu adım sırasında hava kabarcıklarından kaçının. Her kuyu için yeni pipet ipuçları kullanın.
  3. Matrix çözeltisini polimerize etmek için 15-20 dakika boyunca 37 °C, %5 CO 2 inkübatörde kuluçka odası slaytları.
  4. 200.000 hücre/mL'de MCF10A Assay Medium'da yeniden 200.000 hücre/mL veya yeniden 200.000 hücre/mL'de MDA-MB-231 Growth Medium'da 1-MB-231 hücrelerini yeniden kullanılabilir.
  5. MCF10A hücrelerini kullanıyorsanız, %2 matris çözeltisinin son konsantrasyonu için 5 mL Assay Medium'a 5 μL EGF (20 μg/mL) ve 100 μL matris çözeltisi ekleyerek taze MCF10A Küresel Büyüme Ortamı hazırlayın.
  6. Matris çözeltisi ile önceden kaplanmış oda slaydını inkübatörden çıkarın. Her kuyuya 50 μL MCF10A veya MDA-MB-231 hücre süspansiyonu (10.000 hücre) ekleyin. MCF10A hücreleri kullanıyorsanız, 450 μL MCF10A Küresel Büyüme Ortamı ekleyin. MDA-MB-231 hücreleri kullanıyorsanız, %2 matris çözeltisi (9 μL) ile önceden karıştırılmış 450 μL MDA-MB-231 Growth Medium ekleyin. Oda kaydıranı derhal 37 °C, %5 CO2 inkübatöre yerleştirin.
  7. Ortamı her 4 günde bir değiştirin. 200 μL pipet ucu kullanarak her kuyunun bir köşesinden dikkatlice pipet 200 μL eski ortam. Bu işlem sırasında, küresellerin bozulmamasını sağlamak için hazne kaydıranı 45 ° 'de eğin. 200 μL taze hazırlanmış MCF10A Küresel Büyüme Ortamı veya MDA-MB-231 Growth Medium daha önce% 2 matris çözeltisi ile karıştırılmış, sferoidlerin matris tabakasına bağlı kalmasını sağlamak için damlalar halinde köşedeki her kuyuya ekleyin. Ortamın sadece ~ % 50'si değiştirilir, böylece küreseller tarafından üretilen tüm sitokinler tamamen tükenmez.
    NOT: MCF10A meme epitel sferoidlerinin polarize ve içi boş merkezler oluşturması 8 güne kadar sürer. MDA-MB-231 meme epitel sferoidlerinin oluşması 5 güne kadar sürer ve içi boş merkezleri yoktur.

4. Endotel Hücre Ağı Oluşumu

  1. İnsan Göbek Damarı Endotel Hücresi (HUVEC) Kültürü
    1. İnsülin büyüme faktörü, fibroblast büyüme faktörü, vasküler endotel büyüme faktörü, askorbik asit, epidermal büyüme faktörü içeren tek bir Endotel Büyüme Orta-2 kitinin içeriğini ekleyin, heparin ve gentamisin-amfoterisin B, 50 mL fetal sığır serumu, 5 mL penisilin-streptomisin ve 5 mL 200 mM glutamin ila 500 mL Endotel Bazal Orta-2 (EBM-2) ile birlikte komple Endotel Büyüme Ortamı (EGM-2) oluşturur.
    2. 10 mL EGM-2'de 10 cm doku kültürü çanasında 500.000 endotel hücresi tohumu. Hücreleri 37 °C, %5 CO2 inkübatöre % 80 izdiliğe ulaşana kadar (yaklaşık 48 saat) yerleştirin.
    3. Hücreleri geçirmek için endotel hücrelerini 10 mL sıcak PBS ile yıkayın. HUVEC'i 10 cm'lik doku kültürü çanağını %0,05 Trypsin-EDTA'nın 2 mL'sini ekleyerek ayırın. Hücreleri faz kontrastı mikroskopisi ile yakından izleyin. Hücreler toplandığında hazırdır, ancak çanağa bağlı kalırlar.
    4. Trypsin'i dikkatlice yemekten çıkar. Yemeğe 8 mL EGM-2 ekleyin. EGM-2'yi tüm bulaşık yüzeyi üzerinde yukarı ve aşağı pipetle yıkayarak bulaşıktan hücreleri yıkayın.
    5. Alternatif olarak, tripsin nötralize hücrelerine 5 mL EGM-2 ekleyin. Hücreleri yeniden gerçekleştirmek ve hücre kümelerini parçalamak için hücre ortamı karışımını yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre süspansiyonu 15 mL konik tüpe ve 3 dakika boyunca 1.200 x g'da santrifüje ekleyin. Süpernatantı dikkatlice emiş ve hücre peletini 10 mL EGM-2'de yeniden kullanın.
    6. 10 cm'lik doku kültürü çanaklarına 9 mL EGM-2'ye 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin. Bulaşıkları 37 °C, %5 CO2 inkübatöre yerleştirin. Ortamın 2/3'ü her 2 günde bir taze EGM-2 ile değiştirin. Hücreler 3-5 gün içinde geçişe hazır olacaktır. HUVEC, 8.
  2. Endotel Hücresi (HUVEC) Ağ Oluşumu
  3. Teste başlamadan önce 200 μL pipet uçlarını 30 dakika dondurun. Büyüme faktörü azaltılmış matris çözeltisini (10 mg/mL) tüm süreç boyunca buz üzerinde tutun.
  4. Yavaşça pipet 30 μL buz gibi matris çözeltisi, 8 kuyulu bir oda kaydırağının her kuyusuna buz gibi 200 μL pipet uçları kullanarak. Yanlardan başlayın ve pipet ucunu köşeler boyunca sürükleyin, her bir kuyunun eşit şekilde kaplanmasını sağlamak için kuyunun ortasına son bir damla ekleyerek. Düzgün bir matris çözelti katmanı sağlamak için bu adım sırasında hava kabarcıklarından kaçının. Her kuyu için yeni pipet ipuçları kullanın.
  5. Kuluçka odası Matrigel'i polimerize etmek için15-20 dakika boyunca 37 °C, %5 CO 2 inkübatörde kayar.
    1. 10 cm'lik bir HUVEC çanağa 10 μL kırmızı hücreli izleyici (1:1000) 37 °C'de 30 dakika, %5 CO2 inkübatör için önceden lekeleyin.
    2. Endotel hücrelerini 10 mL sıcak PBS ile yıkayın. HUVEC'i 10 cm'lik doku kültürü çanağını %0,05 Trypsin-EDTA'nın 2 mL'sini ekleyerek ayırın. Hücreleri tamamen ayırmak için kabı 5 dakika boyunca 37 °C,%5 CO 2 inkübatöre yerleştirin.
    3. Tripsin nötralize etmek için yemeğe 5 mL EGM-2 ekleyin. Hücre süspansiyonu 25 mL konik bir tüpe aktarın. 5 dakika boyunca 1.200 x g'da Santrifüj HUVEC. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini serumsuz EBM-2'nin 5 mL'sinde yeniden boşaltın.
    4. Uygulanabilir hücreleri belirlemek için Trypan mavisini kullanarak hücreleri sayın. 1 x 106 hücre/mL çözümü oluşturun.
    5. 200 μL serumsuz EBM-2 ile her kuyuya 100.000 HUVEC ekleyin. Daha fazla hücre eklenirse, tüp ağı yerine bir yüzey monolayer oluştururlar.
    6. HUVEC'i 37 °C, %5 CO2 inkübatörde kuluçkaya yatır. 6 saat sonra, faz kontrastı mikroskopisi ile HUVEC ağlarını görüntüleyin. Ağlar artık meme sferoidleri ile coculture için hazır.

5. Önceden oluşturulmuş HUVEC Ağlarında Meme epitel sferoidlerinin biyobaskı

NOT: Biyofabrikasyon işlemi için çift nozül biyo-biriktirme sistemi kullanılmalıdır. Bu durumda, sistem, malzeme birikiminin mikron ölçekli uzamsal kontrolüne izin vermek için üç hareket koluna ve 10 mL şırıngadan biyoink biriktirmek için iki vida tahrikli motora sahipti. Sistem, biyobaskı sırasında steril bir ortamı korumak için yüksek verimli partikül hava filtrasyon sisteminin yanı sıra UV sterilizasyon yetenekleri ile işlevselleştirilmelidir. Biyobaskı, baskı işleminden önce bir saat boyunca UV sterilize edilir.

  1. Daha önce açıklandığı gibi meme epitel sferoidleri ve HUVEC ağları oluşturun. Temsili faz kontrastı mikroskopi görüntülerinde sferoidleri sayarak her kuyudaki meme epitel sferoidlerinin sayısını tahmin edin.
  2. 1000 μL pipet ucunun ucundan 0,5 cm kesin. Kesilmiş pipet ucunu kullanarak tüm sferoidleri 8 kuyulu hazneli kaydıramadan 50 mL'lik bir tüpe dikkatlice pipetleyin. Seçilen biyoinkteki sferoidleri 100 sferoid/100 μL'de resuspend.
    NOT: Daha yüksek küresel konsantrasyonlar küresel kümelenme ile sonuçlanabilir ve küresel ağlar ile endotel ağları arasındaki etkileşimlerin görselleştirilmesini önleyebilir.
  3. Büyük veya kümelenmiş küreselleri çıkarmak için küresel karışımı 70 μm hücreli bir süzgeçten geçirin.
  4. Havuzalanmış sferoidleri 10 mL steril bir şırıngaya yükleyin ve 25 kalibrelik steril bir iğne ile kaplayın. Şırınnayı biyo-biriktirme sistemine takın.
  5. Ortamı 8 kuyulu oda kaydırağını HUVEC ağlarının dışına aspire edin.
  6. 100 μL meme epitel sferoidlerini 1 mL/dk akış hızında 6 kuyu huvec ağlarına ekstrüde edin. Huvec ağlarının 2 kuyularını kontrol olarak koruyun.
  7. HUVEC ağlarında basılmış MCF10A küreselleri kullanıyorsanız 400 μL MCF10A Küresel Büyüme Ortamı ekleyin veya HUVEC ağlarında basılmış MDA-MB-231 sferoidleri kullanıyorsanız daha önce % 2 matris çözeltisi ile karıştırılmış 400 μL MDA-MB-231 Growth Medium ekleyin. huvec kontrol kuyularında ilgili küresel büyüme ortamı kullanılmalıdır.
  8. Medya değişikliği olmadan 24 - 96 saat boyunca 37 °C,%5 CO 2 inkübatörde ortak kültürleri kuluçkaya yatırın. Ortak kültürler dört güne kadar orijinal ortamda canlı kalacak.

6. Konfokal Mikroskopi

  1. İmmünofluoresans ve PBS-Glisin Yıkama Tampon Hazırlama
    1. 10x PBS'nin 500 mL'sinde 2,5 g sodyum azid, 5 g sığır serum albümini, 10 mL Triton X-100 ve 2,05 mL Ara-20 ekleyerek Immunofluorescence (IF) tampon 10x stok çözeltisi hazırlayın. pH'ı 7,4'e ayarlayın. Tortulaşmayı önlemek için stok çözeltisini bir yıla kadar 4 °C'de saklayın.
    2. 450 mL steril deiyonize suda 50 mL 10x IF tamponu seyrelterek çalışan bir IF tamponu oluşturun. Çalışma sokmasını oda sıcaklığında bir haftaya kadar saklayın.
    3. 10x PBS'nin 500 mL'sine 37,5 g glisin ekleyerek 10x PBS-Glisin tampon stok çözeltisi hazırlayın. pH'ı 7,4'e ayarlayın. Tortulaşmayı önlemek için stok çözeltisini 4 °C'de 6 aya kadar saklayın.
    4. 450 mL steril deiyonize suda 50 mL 10x PBS-Glisin tamponunu seyrelterek çalışan bir PBS-Glisin çözeltisi oluşturun. Çalışma sokmasını 4 °C'de bir haftaya kadar saklayın.
  2. Konfokal Mikroskopi ile Etiket Biyobaskı Örnekleri ve Görüntü
    1. Biyobaskıda 3D ortak kültürlerden ortapirat yapın ve sıcak PBS ile 3 kez durulayın. Biyobaskıda 3D ortak kültürleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca %4 paraformaldehit ile sabitlayın. Örnekleri 1x PBS-Glisin ile 20 dakika boyunca 3 kez durulayın.
    2. IF tamponu ile 90 dakika boyunca %10 keçi serumu (birincil blok) karıştırılmış örnekleri bloke edin, ardından IF tamponu artı %10 keçi serumu ve Affinipure Fab parçası (1:100, ikincil blok) ile 40 dakika.
    3. MCF10A sferoidleri kullanıyorsanız, örnekleri 4 °C'de bir gecede ikincil blokaj tamponunda integrin α6 (1:100) için birincil antikor ile etiketle, ardından ışıktan korunan oda sıcaklığında 1 saat boyunca Alexa Fluor 488 ikincil antikor (1:200) ve Hoescht 33342 (1:1000). MCF10A hücre hatları, küresel polarizasyon ve morfolojiyi göstermek için gerekli olan yüksek düzeyde integrin α6'yı ifade eder.
    4. Düşük integrin α6 seviyelerini ifade eden MDA-MB-231 sferoidleri kullanıyorsanız, numuneleri ışıktan korunan oda sıcaklığında 4 saat boyunca ikincil blokaj tamponunda Alexa Fluor 488 phalloidin (1:100) ve Hoescht 33342 (1:1000) ile etiketler. Phalloidin, aktüyon filament görselleştirmesini sağlar, böylece küresel amorf ve invaziv morfoloji değerlendirilebilir.
    5. Numuneleri 1X PBS glisin ile 3 kez 20 dakika yıkayın.
    6. Üreticinin aracını kullanarak hazne slaydını çıkararak numuneleri montaj için hazırlayın. Her kuyuya küçük bir damla antifade çözeltisi ekleyin. Her oda kaydırağının üzerine 22 mm x 60 mm'lik bir kapak kılıfı yerleştirin ve kenarları açık oje ile dikkatlice kapatın.
    7. 5 μm adımda ~10 dilimden oluşan Z yığınları olarak konfokal mikroskop kullanan görüntü örnekleri. İsterseniz, hücre görüntüleme yazılımındaki Genişletilmiş Odak komutunu kullanarak Z düzlemlerini tek bir düzleme sıkıştırın.
    8. Görüntü J'yi kullanarak endotel ağlarına küresel yapışkanlığı ölçün. Yapışan küresellerin sayısı, uygun parçacık boyutuna ve daireselliğe sahip analiz eklentisi kullanılarak ölçülebilir. Görüntü alanına bağlı küresellerin sayısını normalleştirin.
    9. Tekrarlanabilirliği sağlamak için, ortak kültürlerin 4 x 4 karo görüntüsünde yapışan küresellerin sayısını ölçün. Küresel sayı istatistiksel olarak diğer deneylerden anlamlı olarak daha düşükse, deney tekrarlanmalıdır.

Sonuçlar

Meme epitel hücreleri matris çözeltisi üzerinde 5-8 günlük kültürden sonra ve % 2 matris çözeltisi ile kültür ortamında 3D sferoidler halinde kendi kendine organize edilmelidir. Tümörijenik olmayan MCF10A meme epitel sferoidleri yuvarlak görünmeli ve entegre α6 sferoidin dış kenarına polarize edilmiş içi boş bir merkeze sahip olmalıdır(Şekil 1, inset içi içi boş merkezleri gösterir). Son derece invaziv MDA-MB-231 meme kanseri epitel hücreleri düzensiz sferoid...

Tartışmalar

Bu protokol, 3D mimarilerinde de endotel hücreleriyle ortak kültür için 3D mimarilerinde sferoidleri biyobaskılamak için türünün ilk örneğidir. Kritik protokol adımları meme epitel sferoidlerinin ve HUVEC ağlarının ilk oluşumunu içerir. Meme epitel sferoidlerinin beslenmesinde çok dikkatli olunmalıdır, çünkü matris çözeltisinden kolayca bozulurlar. Benzer şekilde, meme epitel sferoidleri matris çözeltisi dışında pipetlendiğinde ve ağlara karıştırıldığında dikkatli bir şekilde ted...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu araştırma NIH 1R01HL140239-01 tarafından AMC'ye finanse edildi. Drexel Üniversitesi Hücre Görüntüleme Merkezi'ne teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
37°C incubator, 5% CO2 and 95% humiditySanyoMCO-20AICCell incubation
3D Bio printercustom-madeNoneUsed for bioprinting
8-well chamber slidesVWR, Radnor, PA53106-306for seeding spheroids
25-gauge needleSigma, St. Louis, MOZ192406-100EAbioprinting syringe needle
Absolute ethanol (200 proof )Sigma, St.Louis, MOE7023-500MLreconsitution of media components
Affinipure F(ab′)2 fragment goat anti-mouse IgGJackson ImmunoResearch, West Grove, PA115006020secondary block - Immunofluorescence
Alexa Fluor 488 (1:200)Thermo Fisher, Waltham, MAA-11006Seconday antibody-Immunofluorescence
Bovine insulinSigma, St.Louis, MOI-035-0.5MLMCF10A Media additive
Bovine serum albumin (BSA)Sigma, St.Louis, MOA2153-500GBlocking agent -Immunofluorescence
Falcon 70 µm Cell StrainerCorning, Corning, NY352350Remove large or clustered spheroids
CellTracker™ Red CMTPX DyeThermo Fisher, Waltham, MAC34552pre-stain for HUVEC tubes
Compact CentrifugeHermle- Labnet, Edison ,NJZ206AFor cell centrifugations
Cholera ToxinSigma, St.Louis, MOC8052-.5MGMCF10A Media additive
Conical tubes 15 mLVWR, Radnor, PA62406-200Collecting and resuspending cells
Countess II-FL Cell counterThermo Fisher, Waltham, MAAMQAF1000counting cells
Glass pipettes (10 mL)VWR, Radnor, PA76184-746cell resuspension
DMEM F:12Thermo Fisher, Waltham, MA11320033MCF10A basal media
DMEM 1XVWR, Radnor, PA10-014-CVMDA-MB-231 basal media
Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2)Lonza, Durham, NCCC-3156HUVEC basal media
Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2)Lonza, Durham, NCCC-3162Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors)
Alexa Fluor™ 488 PhalloidinThermo Fisher, Waltham, MALabelling MDA-MB-231 spheroids
Fetal Bovine serumCytiva, Logan, UTSH30071.03HUVEC/MDA-MB-231 media additive
Goat serumThermo Fisher, Waltham, MA16210064Immunofluorescence labelling component
GlycineSigma, St.Louis, MOG8898-500Gimmunofluorescence buffer component
Hoescht 33342Thermo Fisher, Waltham, MA62249Nuclei stain immunofluorescence
Horse SerumThermo Fisher, Waltham, MA16050130MCF10A Media additive
HydrocortisoneSigma, St.Louis, MOH0888-5GMCF10A Media additive
Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs)Cell applications, San Diego , CA200-05fEndothelial cell lines
Integrin α6Millipore, Billerica, MAMAB1378Immunofluorescence spheroid labelling component
Live Dead assayThermo Fisher, Waltham, MAL3224Live and dead cell stain assay for cell viability
LSM 700 Confocal microscopeZeiss, Thornwood, NYUsed to visualize cells
Matrigel - growth factor reduced 10 mg/mlVWR, Radnor, PA354230Spheroid formation
MCF10A cellsATCCCRL-10317Breast cell line
MDA-MB-231 cellsATCCHTB-26Breast cell line
ParaformaldehydeSigma, St.Louis, MO158127-500Gcell fixative
Penicillin and streptomycinThermo Fisher, Waltham, MA15140122MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive
Phosphate Buffered Saline 1X (PBS)Thermo Fisher, Waltham, MA7001106Wash buffer for cells before trypsinization
Phosphate buffer saline 10XThermo Fisher, Waltham, MAAM9625immunofluorescence buffer component
Prolong gold antifadeThermo Fisher, Waltham, MAP36934immunofluorescence mountant medium
Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGFPeprotech, Rocky Hill, NJAF-100-15MCF10A/ assay media component
Sodium AzideSigma, St.Louis, MOS2002-25Gimmunofluorescence buffer component
Sterile syringe (10 mL)VWR, Radnor, PA75846-757bioprinting process
Tissue culture dish (10cm)VWR, Radnor, PA25382-166monolayer cell culture
Triton X-100Sigma, St.Louis, MOT8787-250MLimmunofluorescence buffer component
Trypan blue 0.4%Thermo Fisher, Waltham, MA15250061cell counter additive
Trypsin-EDTA 0.05%Thermo Fisher, Waltham, MA25300054cell detachment
Tween -20Thermo Fisher, Waltham, MA85113immunofluorescence buffer component
Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165)Peprotech, Rocky Hill, NJ100-20HUVEC tube additive
Volocity 6.3 cell imaging softwarePerkinElmer, Hopkinton, MAZ stack compresser

Referanslar

  1. Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
  2. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  3. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  4. Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
  5. Sokol, E. S., et al. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 19 (2016).
  6. Howlett, A. R., Bailey, N., Damsky, C., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Cellular growth and survival are mediated by beta 1 integrins in normal human breast epithelium but not in breast carcinoma. Journal of Cell Science. 108, 1945-1957 (1995).
  7. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  8. Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
  9. Wang, F., et al. Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (25), 14821-14826 (1998).
  10. Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nature Cell Biology. 3 (9), 785-792 (2001).
  11. Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (2), 521-526 (2003).
  12. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111 (1), 29-40 (2002).
  13. Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2 (3), 205-216 (2002).
  14. Yamada, K. M., Clark, K. Cell biology: survival in three dimensions. Nature. 419 (6909), 790-791 (2002).
  15. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116, 2377-2388 (2003).
  16. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
  17. Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 83-101 (2008).
  18. Sacharidou, A., et al. Endothelial lumen signaling complexes control 3D matrix-specific tubulogenesis through interdependent Cdc42- and MT1-MMP-mediated events. Blood. 115 (25), 5259-5269 (2010).
  19. Buchanan, C. F., et al. Cross-talk between endothelial and breast cancer cells regulates reciprocal expression of angiogenic factors in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (4), 1142-1151 (2012).
  20. Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. In vitro angiogenesis induced by tumor-endothelial cell co-culture in bilayered, collagen I hydrogel bioengineered tumors. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (11), 864-874 (2013).
  21. Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Stromal endothelial cells directly influence cancer progression. Science Translational Medicine. 3 (66), 66 (2011).
  22. Franses, J. W., Drosu, N. C., Gibson, W. J., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Dysfunctional endothelial cells directly stimulate cancer inflammation and metastasis. International Journal of Cancer. 133 (6), 1334-1344 (2013).
  23. Phamduy, T. B., et al. Printing cancer cells into intact microvascular networks: a model for investigating cancer cell dynamics during angiogenesis. Integrative Biology. 7 (9), 1068-1078 (2015).
  24. Connor, Y., et al. Physical nanoscale conduit-mediated communication between tumour cells and the endothelium modulates endothelial phenotype. Nature Communications. 6, 8671 (2015).
  25. Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nature Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
  26. Strilic, B., et al. Tumour-cell-induced endothelial cell necroptosis via death receptor 6 promotes metastasis. Nature. 536 (7615), 215-218 (2016).
  27. Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), 539-553 (2015).
  28. Belgodere, J. A., et al. Engineering Breast Cancer Microenvironments and 3D Bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66 (2018).
  29. Jang, J., Yi, H. G., Cho, D. W. 3D Printed Tissue Models: Present and Future. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (10), 1722-1731 (2016).
  30. Sobrino, A., et al. 3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks. Scientific Reports. 6, 31589 (2016).
  31. Chen, M. B., Whisler, J. A., Jeon, J. S., Kamm, R. D. Mechanisms of tumor cell extravasation in an in vitro microvascular network platform. Integrative Biology. 5 (10), 1262-1271 (2013).
  32. Hassell, B. A., et al. Human Organ Chip Models Recapitulate Orthotopic Lung Cancer Growth, Therapeutic Responses, and Tumor Dormancy In vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
  33. Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
  34. Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), 539-553 (2015).
  35. Zhao, Y., et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. 6 (3), 035001 (2014).
  36. Zhang, Y. S., et al. Bioprinting the Cancer Microenvironment. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (10), 1710-1721 (2016).
  37. Ouyang, L., et al. Three-dimensional bioprinting of embryonic stem cells directs highly uniform embryoid body formation. Biofabrication. 7 (4), 044101 (2015).
  38. Swaminathan, S., Ngo, O., Basehore, S., Clyne, A. M. Vascular Endothelial-Breast Epithelial Cell Coculture Model Created from 3D Cell Structures. ACS Biomaterials Science & Engineering. 3 (11), 2999-3006 (2017).
  39. Vorwald, C. E., Ho, S. S., Whitehead, J., Leach, J. K. High-Throughput Formation of Mesenchymal Stem Cell Spheroids and Entrapment in Alginate Hydrogels. Methods in Molecular Biology. 1758, 139-149 (2018).
  40. Chaji, S., Al-Saleh, J., Gomillion, C. T. Bioprinted Three-Dimensional Cell-Laden Hydrogels to Evaluate Adipocyte-Breast Cancer Cell Interactions. Gels. 6 (1), (2020).
  41. Swaminathan, S., Hamid, Q., Sun, W., Clyne, A. M. Bioprinting of 3D breast epithelial spheroids for human cancer models. Biofabrication. 11 (2), 025003 (2019).
  42. Radisky, D., Muschler, J., Bissell, M. J. Order and disorder: the role of extracellular matrix in epithelial cancer. Cancer Investigation. 20 (1), 139-153 (2002).
  43. Qu, Y., et al. Evaluation of MCF10A as a Reliable Model for Normal Human Mammary Epithelial Cells. PLoS One. 10 (7), 0131285 (2015).
  44. Chavez, K. J., Garimella, S. V., Lipkowitz, S. Triple negative breast cancer cell lines: one tool in the search for better treatment of triple negative breast cancer. Breast Disease. 32 (1-2), 35-48 (2010).
  45. Swaminathan, S., Cranston, A. N., Clyne, A. M. A Three-Dimensional In vitro Coculture Model to Quantify Breast Epithelial Cell Adhesion to Endothelial Cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (10), 609-618 (2019).
  46. Lee, J. M., et al. Generation of uniform-sized multicellular tumor spheroids using hydrogel microwells for advanced drug screening. Scientific Reports. 8 (1), 17145 (2018).
  47. Frueh, F. S., Spater, T., Scheuer, C., Menger, M. D., Laschke, M. W. Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering. Journal of Visualized Experiments. (122), e55721 (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 165Biyobaskbiyoinks3D in vitro ortak k lt r modellerimeme sferoidleriendotel h crelerikanser

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır