Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة خالية من الخلايا لإنتاج بروتيوليبوزوم عالي الجودة عن طريق طريقة غسيل الكلى ثنائية الطبقة باستخدام نظام خال من خلايا القمح والليبوزومات. توفر هذه الطريقة وسيلة مناسبة للتحليل الوظيفي للبروتينات الغشائية ، وفحص أهداف الأدوية ، وتطوير الأجسام المضادة.

Abstract

تلعب البروتينات الغشائية أدوارا أساسية في مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية وتؤدي وظائف حيوية. البروتينات الغشائية مهمة طبيا في اكتشاف الأدوية لأنها أهداف لأكثر من نصف جميع الأدوية. كانت إحدى العقبات التي تحول دون إجراء الدراسات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية والهيكلية للبروتينات الغشائية وكذلك تطوير الأجسام المضادة هي صعوبة إنتاج كميات كبيرة من البروتين الغشائي عالي الجودة مع التشكل والنشاط الصحيحين. هنا نصف "طريقة غسيل الكلى ثنائية الطبقة" باستخدام نظام خال من خلايا جنين القمح ، والجسيمات الشحمية ، وأكواب غسيل الكلى لتصنيع البروتينات الغشائية بكفاءة وإعداد البروتينات البروتينية المنقاة في وقت قصير بمعدل نجاح مرتفع. يمكن إنتاج البروتينات الغشائية بقدر ما تنتج في عدة ملليغرام ، مثل GPCRs ، والقنوات الأيونية ، والناقلات ، و tetraspanins. تساهم هذه الطريقة الخالية من الخلايا في تقليل الوقت والتكلفة والجهد لإعداد البروتينات عالية الجودة ، وتوفر وسائل مناسبة للتحليل الوظيفي للبروتينات الغشائية ، وفحص أهداف الأدوية ، وتطوير الأجسام المضادة.

Introduction

البروتينات الغشائية هي واحدة من أهم أهداف الأدوية في التشخيص والعلاجات. في الواقع ، نصف الأدوية المركبة الصغيرة المستهدفة هي بروتينات غشائية ، مثل المستقبلات المقترنة بالبروتين G (GPCRs) والقنوات الأيونية1. على مر السنين ، كان الباحثون يعملون على دراسات كيميائية حيوية وفيزيائية وهيكلية للبروتينات الغشائية لتوضيح هيكلها ووظيفتها 2,3. كما يتم تطوير الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ضد البروتينات الغشائية بنشاط من أجل تسريع الدراسات الوظيفية والهيكلية وتطوير التطبيقات العلاجية والتشخيصية4،5،6،7،8،9. كل هذه الدراسات تتطلب كمية كبيرة من البروتينات الغشائية عالية الجودة10. على سبيل المثال ، هناك حاجة إلى عدة ملليغرامات من بروتينات الغشاء المنقى ذات التشكل الطبيعي لتطوير الأجسام المضادة. هناك حاجة إلى كمية أكبر بكثير من البروتينات الغشائية عالية النقاء لعلم البلورات بالأشعة السينية. ومع ذلك ، لا يزال الإنتاج الضخم للبروتينات الغشائية يمثل عنق الزجاجة في أبحاث البروتين الغشائي11. تحتوي البروتينات الغشائية على تراكيب معقدة مع حلزونات عبر غشائية واحدة أو أكثر، وتلعب أدوارا مهمة في الاتزان الخلوي. يؤدي الإفراط في التعبير غير المتجانس للبروتينات الغشائية إلى عقبات متعددة مثل تجميع البروتينات الغشائية التي تتراكم بتركيزات محلية عالية أو اضطراب مسارات الإشارات الخلوية. حتى لو كان التعبير ناجحا ، فإن الخطوات اللاحقة لإعداد العينة تواجه صعوبة أيضا. على سبيل المثال ، يتطلب تحضير البروتيوليبوزوم مهارات عالية المستوى وخبرات مهنية في إذابة البروتينات الغشائية وتنقيتها وتثبيتها ، ويكلف الكثير من الجهد والوقت أيضا12,13.

من ناحية أخرى ، ظهرت بعض التقنيات المتقدمة في العقود الأخيرة لإنتاج البروتينات دون استخدام الخلايا الحية14،15،16،17،18. تعيد تقنية تخليق البروتين الخالي من الخلايا تكوين تفاعل الترجمة في أنبوب اختبار. نظرا لعدم وجود قيود على نظام التعبير الخلوي ، فإن الأنظمة الخالية من الخلايا لديها القدرة على تصنيع مجموعة متنوعة من البروتينات التي يصعب التعبير عنها أو إظهار سميتها في الخلايا. يتم خلط مستخلص الخلايا المنقى أو الآلات الانتقالية المعاد تشكيلها مع قالب mRNAs والأحماض الأمينية ومصادر الطاقة ، ويتم تصنيع البروتينات المؤتلفة في وقت قصير. فيما يتعلق بتخليق البروتين الغشائي ، تتم إضافة بعض أنواع السقالات المكونة من الدهون أو البرمائيات ، مثل الجسيمات الشحمية أو البيسيلات أو الأقراص النانوية أو البوليمرات المشتركة إلى التفاعل الخالي من الخلايا19،20،21،22،23،24. تتفاعل بروتينات الغشاء المركبة مع السقالات ويمكن تثبيتها في الماء. تستخدم بروتينات الغشاء المركبة الخالية من الخلايا على نطاق واسع في الدراسات الوظيفية وإنتاج الأجسام المضادة 25،26،27،28،29،30،31.

في هذا البروتوكول ، نصف طريقة فعالة خالية من الخلايا لإنتاج البروتيوليبوزوم باستخدام نظام خال من خلايا القمح والجسيمات الشحمية. نظام تخليق البروتين الخالي من خلايا القمح هو نظام ترجمة قوي في المختبر باستخدام مستخلص من جنين القمح15،32،33. تحتوي جنين القمح على كمية كبيرة من الآلات الانتقالية وعدد قليل من مثبطات الترجمة. الآلية الانتقالية في القمح ، وهي عضو في حقيقيات النوى ، مناسبة لترجمة البروتينات حقيقية النواة ، ولا تتأثر كفاءتها في الترجمة باستخدام الكودون للقالب mRNA. باستخدام نظام خال من خلايا القمح ، قمنا بتجميع مجموعة متنوعة من البروتينات بما في ذلك كينازات البروتين34،35 ، و ubiquitinligases 36 ، وعوامل النسخ37 ، والبروتينات الغشائية ذات معدلات النجاح العالية. لإنتاج البروتين الغشائي ، نضيف ليبوزوم حويصلة دهنية إلى خليط الترجمة مثل سقالة19,38. تتفاعل المجالات الكارهة للماء للبروتين الغشائي مع طبقة ثنائية الدهون ويتم دمجها تلقائيا مع الجسيمات الشحمية. يستخدم الطرد المركزي المتدرج الكثافة لفصل البروتينات البروتينية بدقة عن بروتينات القمح الداخلية ، على الرغم من أن الطرد المركزي المشترك لخليط تفاعل الترجمة يكفي لتنقية بسيطة للبروتين20. تم تصنيع العديد من أنواع البروتينات الغشائية المتكاملة باستخدام نظام خال من خلايا القمح وتطبيقها على مختلف الأبحاث والتطورات25،38،39،40،41،42،43،44. علاوة على ذلك ، قمنا بتطوير "طريقة غسيل الكلى ثنائية الطبقة" للإنتاج على نطاق واسع45،46. في هذه الطريقة ، يتم غمر جهاز غسيل الكلى من نوع الكوب في مخزن تغذية الركيزة ، ويتم تشكيل طبقتين من خليط تفاعل الترجمة ومخزن تغذية الركيزة في الكوب كما هو موضح في الشكل 1. يمكن إجراء الإمداد المستمر للركائز وإزالة المنتج الثانوي بكفاءة في كل من الجزء العلوي والسفلي من خليط التفاعل لفترة طويلة ، مما يؤدي إلى فعالية ترجمة ممتازة (الشكل 2A والشكل 2B)45.

Protocol

1. إعداد بلازميد تعبير pEU

ملاحظة: يجب أن يتضمن بلازميد تعبير pEU كودون البداية ، وإطار قراءة مفتوح لبروتين الغشاء المستهدف ، وكودون الإيقاف في الجزء (انظر الشكل 1). أضف تسلسل (تسلسلات) علامة الكشف / التنقية في الموضع المناسب عند الحاجة. إما هضم إنزيم التقييد أو الاستنساخ غير الملحوم ينطبق على الاستنساخ الفرعي. هنا نصف بروتوكولا باستخدام طريقة استنساخ سلسة.

  1. إعداد إدراج جزء الحمض النووي.
    1. تضخيم الجين محل الاهتمام بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام قالب cDNA والتمهيدي 1 والتمهيدي 2. يحتوي التمهيدي 1 والتمهيدي 2 على تداخلات 15 نقطة أساس للاستنساخ السلس ، على التوالي (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: لا تقم بتضمين التسلسلات المراد معالجتها وإزالتها من البروتين الناضج في الخلايا (على سبيل المثال ، تسلسل الإشارة). لا تتم معالجة البروتين المركب في نظام خال من خلايا القمح. لا تضيف تسلسل كوزاك. يحتوي متجه pEU-E01-MCS على محسن ترجمة E01.
    2. أضف حجم 1/25 من إنزيم تقييد DpnI إلى منتج PCR لإزالة قالب الحمض النووي البلازميدي. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    3. استخدم مجموعة تنقية تفاعل البوليميراز المتسلسل لتنقية منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل وضبط التركيز عند 20-50 نانوغرام / ميكرولتر.
  2. متجه خطي pEU-E01-MCS.
    1. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي باستخدام pEU-E01-MCS والتمهيدي 3 والتمهيدي 4.
    2. أضف حجم 1/25 من إنزيم تقييد DpnI إلى منتج PCR العكسي. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    3. استخدم مجموعة تنقية PCR لتنقية منتج PCR وفقا لتوصية الشركة المصنعة. اضبط التركيز عند 20-50 نانوغرام / ميكرولتر.
  3. امزج 2 ميكرولتر من شظية الحمض النووي المدرجة ، و 2 ميكرولتر من المتجه الخطي ، و 4 ميكرولتر من خليط إنزيم الاستنساخ غير الملحوم.
  4. تحويل سلالة الإشريكية القولونية JM109 مع منتج الاستنساخ سلس. باستخدام مفرشة ، انشر المعلق البكتيري على صفيحة أجار LB-ampicillin.
    ملاحظة: يحتوي ناقل pEU على علامة مقاومة الأمبيسلين.
  5. تأكد من تسلسل تعبير البلازميد الذي تم إنشاؤه باستخدام التمهيدي 5 والتمهيدي 6 من الجانب 5 'و 3' من MCS في بلازميد pEU ، على التوالي.
  6. تضخيم وتنقية التعبير البلازميدات.
    1. استزرع سلالة الإشريكية القولونية المحولة بالبلازميد JM109 في 150 مل من وسط LB-ampicillin عند 37 درجة مئوية و 125 ضربة في الدقيقة تهتز بين عشية وضحاها.
    2. استخراج وتنقية البلازميدات باستخدام مجموعة ميدي الإعدادية البلازميد المتاحة تجاريا. حل البلازميدات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE.
      تنبيه: لا تستخدم مجموعة تحضير صغيرة لاستخراج البلازميد. لا يوفر جودة وكمية كافية من البلازميد.
    3. أضف 500 ميكرولتر من كحول الفينول / الكلوروفورم / الأيزو أميل (25:24:1). تخلط بقوة لمدة 5 دقائق ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 17800 × جم ودرجة حرارة الغرفة. انقل محلول البلازميد العلوي إلى أنبوب جديد.
      تنبيه: ارتد قفازات يمكن التخلص منها لحماية الجلد من الفينول والكلوروفورم.
      ملاحظة: من أجل إزالة تلوث RNase من مجموعة استخراج البلازميد ، قم بتنقية البلازميدات باستخدام تنقية الفينول كلوروفورم.
    4. أضف 500 ميكرولتر من الكلوروفورم لإزالة الفينول تماما. تخلط بقوة لمدة 5 دقائق ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 17800 × جم ودرجة حرارة الغرفة. انقل محلول البلازميد العلوي إلى أنبوب جديد.
    5. أضف 2.5 حجم من الإيثانول و 1/8 حجم 7.5 م أسيتات الأمونيوم ، وخزن في -30 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    6. جهاز طرد مركزي عند 17800 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. اغسل الحبيبات ب 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪. قم بإزالة المادة الطافية بعناية واترك الحبيبات لمدة 5 دقائق حتى تجف.
    7. قم بإذابة بلازميدات التعبير في 100 ميكرولتر من الماء عالي النقاء تماما. قياس تركيز البلازميدات مع الامتصاص عند 260 نانومتر. اضبط التركيز على 1 ملغ / مل.

2. النسخ في المختبر

تنبيه: استخدم أنابيب ونصائح بلاستيكية خالية من DNase والنيوكلياز في خطوات النسخ والترجمة. تجنب تعقيم الأواني البلاستيكية لمنع التلوث.

  1. حصاد المياه فائقة النقاء في أنبوب بلاستيكي جديد.
    تنبيه: لا تستخدم المياه المعالجة ب DEPC لأن DEPC المتبقي يثبط التفاعل بشدة. استخدم المياه فائقة النقاء الطازجة للنسخ والترجمة.
  2. تحضير مزيج تفاعل النسخ عن طريق خلط 115.2 ميكرولتر من الماء عالي النقاء ، و 40 ميكرولتر من محلول النسخ LM ، و 20 ميكرولتر من مزيج NTP ، و 2.4 ميكرولتر من مثبط 80 U / μL RNase ، و 2.4 ميكرولتر من 80 U / μL SP6 polymerase ، و 20 ميكرولتر من 1 ملغ / مل من بلازميدات تعبير pEU. خلط الكواشف بلطف عن طريق قلب. أداء تدور سريع.
  3. احتضان تفاعل النسخ عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات.
  4. امزج التفاعل برفق عن طريق الانقلاب والدوران بسرعة. استخدمه على الفور للترجمة ، وإلا قم بتجميده وتخزينه في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
  5. تأكيد منتج النسخ عن طريق الكهربائي.
    1. امزج 100 مل من 1x TAE buffer و 1 جم من الأغاروز. سخني المعلق في فرن الميكروويف لتحضير 1٪ هلام أغاروز تاي.
    2. خذ 1 ميكرولتر من تفاعل النسخ واخلطه مع 3 ميكرولتر من الماء و 4 ميكرولتر من صبغة التحميل 2x.
      ملاحظة: تغيير طبيعة الحمض النووي الريبي غير مطلوب.
    3. قم بتحميل 4 ميكرولتر من الخليط و 2 ميكرولتر من علامة سلم الحمض النووي إلى هلام agarose TAE.
    4. الكهربائي عند 100 فولت لمدة 20 دقيقة.
    5. وصمة عار الجل في بروميد الإيثيديوم لمدة 30 دقيقة. تحقق من نمط شريط سلم mRNA باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية وتصوير الهلام.
      ملاحظة: عند ملاحظة شريط ملطخ أقل من 500 نقطة أساس ، يشتبه في تدهور mRNA.

3. إعداد المواد للترجمة

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت للترجمة.
    1. امزج 27 مل من الماء عالي النقاء الطازج و 0.75 مل من كل محلول مخزون 40x ل S1 و S2 و S3 و S4 ، على التوالي في أنبوب سعة 50 مل.
      ملاحظة: قم بتعديل كميات المواد وفقا للكمية النهائية المطلوبة من 1x مخزن مؤقت للترجمة.
      تنبيه: لا تقم بتخزين أو إعادة تجميد مخزن الترجمة المؤقت الزائد 1x بعد الاستخدام.
  2. إعداد الكرياتين كيناز حل الأسهم. قم بإذابة الكرياتين كيناز المجفف بالتجميد في ماء عالي النقاء إلى تركيز نهائي قدره 20 مجم / مل. قم بتوزيع المحلول بكميات صغيرة (من 10 إلى 50 ميكرولتر لكل منهما) في أنابيب PCR سعة 0.2 مل ذات 8 أشرطة. تجمد الأنابيب في النيتروجين السائل ، وتخزن في -80 درجة مئوية.
    تنبيه: لا تقم بإعادة تجميد محلول الكرياتين كيناز بعد الذوبان.
  3. اغسل أكواب غسيل الكلى (حجم 0.1 مل) لإزالة الجلسرين من غشاء غسيل الكلى.
    ملاحظة: هناك العديد من أكواب غسيل الكلى مختلفة الحجم. تستخدم الأكواب صغيرة الحجم (0.1 مل) للاختبار على نطاق صغير (القسم 5.4) ، والأكواب كبيرة الحجم (2 مل) للإنتاج على نطاق واسع (القسم 5.5) ، على التوالي. يمكن تجنب خطوة الغسيل لغشاء غسيل الكلى للأكواب كبيرة الحجم.
    1. ضع 1 مل من الماء عالي النقاء في أنبوب جديد سعة 1.5 مل. أدخل كوب غسيل الكلى صغير الحجم (0.1 مل) في الأنبوب. أضف 0.5 مل من الماء عالي النقاء إلى الكوب.
    2. احتضان لأكثر من 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

4. تحضير الجسيمات الشحمية

ملاحظة: هنا نصف بروتوكولين لإعداد الجسيمات الشحمية. يستخدم أحدهما الجسيمات الشحمية المجففة بالتجميد الجاهزة للاستخدام (القسم 4.1) ، بينما ينتج الآخر الجسيمات الشحمية عن طريق ترطيب طبقة دهنية رقيقة (القسم 4.2).

  1. تحضير الجسيمات الشحمية باستخدام الجسيمات الشحمية المجففة بالتجميد.
    ملاحظة: أسهل طريقة لإنتاج البروتيوليبوسوم هي استخدام الليبوزوم الأسولكتين المتاح تجاريا. Asolectin هو نوع من الدهون الطبيعية المستخرجة من فول الصويا.
    1. افتح القارورة التي تحتوي على 10 ملغ من الجسيمات الشحمية Asolectin المجففة بالتجميد (انظر جدول المواد) وأضف 200 ميكرولتر من مخزن الترجمة المؤقت (القسم 3.1) إلى أسفل القارورة. ختم القارورة واحتضانها لمدة 10 دقائق.
    2. تخلط بقوة عن طريق وضع القارورة على خلاط دوامة لمدة 1 دقيقة.
    3. أدخل القارورة في أنبوب سعة 50 مل. قم بتدوير الأنبوب عن طريق الطرد المركزي بمعدل 500 × جم لمدة 1 دقيقة.
    4. باستخدام ماصة ، انقل معلق Asolectin liposome (50 مجم دهون / مل) إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل. استخدم الجسيمات الشحمية على الفور للترجمة ، وإلا قم بتجميدها في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  2. تحضير الجسيمات الشحمية عن طريق ترطيب فيلم دهني رقيق.
    1. إذا تم بيع الدهون في شكل مسحوق ، تذوب في الكلوروفورم أو المذيب العضوي المناسب إلى تركيز 10-100 ملغ / مل.
      ملاحظة: يمكن تحضير طبقة رقيقة من الدهون باستخدام الدهون البرمائية المنقاة و / أو المصنعة. تم وصف طريقة تنقية asolectin سابقا38. يمكن إضافة الليبيدات المعدلة وظيفيا، مثل الليبيدات البيوتينيلات، والليبيدات الفلورية، والليبيدات المساعدة، إلى الليبيدات القاعدية لإنتاج الجسيمات الشحمية الوظيفية.
    2. انقل محلول الليبيدات الذي يحتوي على 50 mg من الليبيدات إلى دورق تبخر.
    3. باستخدام مبخر دوار ، قم بتبخير المذيب ونشر الدهون بالتساوي على جدار قاع القارورة لتشكيل طبقة رقيقة من الدهون.
    4. ضع القارورة في مجفف فراغ واتركها تحت ضغط سلبي طوال الليل لإزالة المذيب تماما.
    5. أضف 1 مل من مخزن الترجمة المؤقت إلى دورق التبخر. قم بتدوير القارورة لنشر المخزن المؤقت فوق طبقة الدهون الرقيقة. احتضان لمدة 5 دقائق لترطيب الفيلم.
    6. سونيك القارورة مع الخالط بالموجات فوق الصوتية أو منظف بالموجات فوق الصوتية. قم بتغيير زاوية القارورة من حين لآخر للسماح للمحلول بلمس الفيلم جيدا. تأكد من تقشير طبقة الدهون الرقيقة من الأسفل واستحلابها تماما ومتجانسا.
      ملاحظة: يوضح الشكل 1 صورة مجهرية إلكترونية للدهون البيوتينيل التي تحتوي على الجسيمات الشحمية.
    7. انقل معلق الجسيمات الشحمية (50 مجم من الدهون / مل) إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل. إذا لم يتم استخدامه على الفور ، فقم بتجميد الجسيمات الشحمية في النيتروجين السائل ، وتخزينها في -80 درجة مئوية.

5. الترجمة في المختبر

  1. قم بإذابة مستخلص جنين القمح بسرعة عن طريق تعويم الأنابيب على الماء في درجة حرارة الغرفة لبضع دقائق. بعد الذوبان ، امزج على الفور برفق عن طريق قلب الأنابيب ، وقم بتدويرها لأسفل ، واتركها تبرد على الثلج حتى الاستخدام.
    ملاحظة: قم بتجميد مستخلص جنين القمح في النيتروجين السائل بعد الاستخدام ، وخزنه في درجة حرارة -80 درجة مئوية. يقاوم عدة دورات تجميد / ذوبان.
  2. ذوبان 20 ملغ / مل محلول مخزون الكرياتين كيناز. امزج 5 ميكرولتر من محلول المخزون و 45 ميكرولتر من محلول الترجمة لتحضير محلول عمل كرياتين كيناز 2 مجم / مل.
    تنبيه: لا ينصح بإعادة تجميد الكرياتين كيناز.
  3. إذابة الجسيمات الشحمية أو الحمض النووي الريبوزي المرسال عند الحاجة.
  4. إجراء ترجمة البروتين على نطاق صغير.
    1. قم بإزالة الماء من كل من الأنبوب وكوب غسيل الكلى (0.1 مل) ، كما هو موضح في الخطوة 3.3.2.
    2. حقن 1 مل و 300 ميكرولتر من مخزن الترجمة المؤقت في الأنبوب وكوب غسيل الكلى ، على التوالي.
      تنبيه: في حالة عدم وصول الجزء السفلي من كوب غسيل الكلى إلى سطح مخزن الترجمة المؤقت في الأنبوب سعة 1.5 مل ، قم بحقن 50-100 ميكرولتر إضافية من المخزن المؤقت في الأنبوب.
    3. تحضير خليط تفاعل الترجمة عن طريق خلط 15.6 ميكرولتر من محلول الترجمة، و2.4 ميكرولتر من 2 ملغم/مل من الكرياتين كيناز، و12 ميكرولتر من 50 ملغم/مل من الجسيمات الشحمية، و15 ميكرولتر من مستخلص جنين القمح، و15 ميكرولتر من الحمض النووي الريبوزي المرسال. تخلط بلطف عن طريق قلب الأنابيب ، وتدور لأسفل.
    4. قم بشفط 60 ميكرولتر من خليط تفاعل الترجمة باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
    5. أدخل طرف الماصة في السطح السفلي لمخزن الترجمة المؤقت في كوب غسيل الكلى. ماصة من خليط التفاعل ببطء ولطف. قم بتغطية كوب غسيل الكلى بغطاء لمنع التبخر.
      ملاحظة: يغوص خليط التفاعل بشكل طبيعي في قاع الكوب ويشكل طبقة مزدوجة. لا تزعج الطبقة المزدوجة عن طريق خلط أو هز الكوب.
  5. إجراء ترجمة واسعة النطاق (الشكل 1).
    1. صب 22 مل من مخزن الترجمة في أنبوب سعة 25 مل. أدخل كوب غسيل الكلى كبير الحجم (2 مل) في الأنبوب وأضف 2 مل من مخزن الترجمة المؤقت في الكوب.
    2. تحضير خليط تفاعل الترجمة عن طريق خلط 130 ميكرولتر من محلول الترجمة، و20 ميكرولتر من 2 ملغم/مل من الكرياتين كيناز، و100 ميكرولتر من 50 ملغم/مل من الجسيمات الشحمية، و125 ميكرولتر من مستخلص جنين القمح، و125 ميكرولتر من الحمض النووي الريبوزي المرسال. تخلط بلطف عن طريق ماصة العين.
    3. استنشاق كل خليط تفاعل الترجمة (500 ميكرولتر) باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر. حقن خليط تفاعل الترجمة في كوب غسيل الكلى بنفس الطريقة الموضحة في الخطوة 5.4.5. قم بتغطية كوب غسيل الكلى بغطاء لمنع التبخر.
  6. احتضان التفاعلات عند 15 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  7. امزج التفاعل جيدا في كوب غسيل الكلى عن طريق سحب العينات. انقل معلق البروتيوليبوزوم الخام إلى أنبوب جديد.
    ملاحظة: يوصى باستخدام أنبوب مسطح القاع سعة 1.5 مل لجمع البروتيوليبوزوم من الترجمة الصغيرة. بعد الطرد المركزي ، تشكل الجسيمات الشحمية حبيبات مدمجة ومرئية بسهولة في الزاوية السفلية من الأنبوب.

6. تنقية البروتيوليبوسومات

  1. جهاز طرد مركزي للأنبوب الذي يحتوي على معلق بروتيوليبوسوم خام عند 17800 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
  2. إزالة طاف . تعليق بيليه بروتيوليبوسوم في PBS (مقياس صغير: 1 مل ، مقياس كبير: 10 مل) عن طريق ماصة العين.
  3. كرر الطرد المركزي وغسل البروتيوليبوسومات لدائرتين أخريين.
  4. بعد الغسيل ، أضف كمية صغيرة من PBS وأعد تعليق حبيبات البروتيليبوسوم جيدا عن طريق سحب العينات. قياس حجم التعليق باستخدام ماصة صغيرة. أضف PBS لضبط مستوى الصوت إلى 60 ميكرولتر (نطاق صغير) أو 500 ميكرولتر (نطاق كبير). انقل التعليق إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل.
  5. انقل 10 ميكرولتر من معلق البروتيوليبوسوم إلى أنبوب PCR جديد ل SDS-PAGE. قسم باقي العينات إلى أجزاء أصغر لاستخدامها عند الضرورة. تجمد في النيتروجين السائل وتخزن في -80 درجة مئوية.

7. تلطيخ SDS-PAGE ومصرف البحرين المركزي

  1. أضف 70 ميكرولتر من الماء و 40 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة SDS-PAGE 3x إلى 10 ميكرولتر من معلق البروتيوليبوسوم.
    تنبيه: لا تغلي عينة SDS-PAGE ، حيث تتجمع البروتينات الغشائية ، وبالكاد تخترق هلام الأكريلاميد في الرحلان الكهربائي. أيضا ، أضف عامل اختزال كاف إلى المخزن المؤقت لعينة SDS-PAGE (على سبيل المثال ، 2-mercaptoethanol بتركيز نهائي 3٪) لمنع الأكسدة.
  2. ضع جل SDS-PAGE متدرج بنسبة 5٪ -20٪ في غرفة الرحلان الكهربائي. قم بتحميل 3 ميكرولتر ، 6 ميكرولتر ، 12 ميكرولتر من عينات بروتيوليبوسوم ، 2 ميكرولتر من علامة حجم البروتين ، وسلسلة BSA القياسية أيضا.
  3. الكهربائي عند 52 مللي أمبير ، 400 فولت لمدة 30 دقيقة.
  4. وصمة عار هلام مع صبغة CBB لمدة 1 ساعة. قم بإزالة اللون في الماء الساخن وامسح صورة الجل.
  5. باستخدام برنامج NIH Image J (https://imagej.nih.gov/ij/) ، حدد شدة نطاق بروتين الغشاء في كل حارة. تقدير كمية البروتينات الغشائية المركبة مع سلسلة BSA القياسية.

النتائج

باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن الحصول على البروتيوليبوسومات المنقاة جزئيا في وقت قصير. النتائج التمثيلية موضحة في الشكل 2 أ. تم تصنيع خمسة وعشرين GPCRs من الفئة A و B و C بنجاح باستخدام طريقة غسيل الكلى ثنائية الطبقة (على نطاق صغير) وتنقيتها جزئيا عن طريق الطرد المركزي والغسيل ا...

Discussion

يوفر البروتوكول المقدم طريقة لإنتاج بروتينات الغشاء بمعدل نجاح مرتفع. هذا البروتوكول بسيط وقابل للتكرار بدرجة كبيرة وسهل التوسع. كما أن لديها القدرة على تقليل وقت وتكلفة التجارب التي تستهلك كمية كبيرة من البروتينات الغشائية. تعمل طريقة غسيل الكلى ثنائية الطبقة على تحسين الإنتاجية بمقدا?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا البحث من قبل مشروع المنصة لدعم اكتشاف الأدوية وأبحاث علوم الحياة (أساس دعم اكتشاف الأدوية المبتكرة وأبحاث علوم الحياة (BINDS)) من AMED تحت رقم المنحة JP20am0101077. كما تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل JSPS KAKENHI رقم المنحة 20K05709.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
×3 SDS-PAGE sample bufferContaining 10% 2-mercaptoethanol
5-20% gradient SDS-PAGE gelATTOE-D520L
70% ethanolDiluted ethanol by ultrapure water.
AgaroseTakara Bio
Ammonium acetateNakalai tesque02406-95As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30°C.
Ampicillin SodiumNakalai tesque02739-74
Asolectin Liposome, lyophilizedCellFree SciencesCFS-PLE-ASLA vial contains 10 mg of lyophilized liposomes.
BSA standard1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 µL ×1 SDS-PAGE sample buffer
CBB gel stain
cDNA clone of interestPlasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment
ChloroformNakalai tesque08402-84
Cooled incubatorTemperature ranging from 0 to 40 °C or wider.
Creatine kinaseRoche Diagnostics04524977190
Dialysis cup (0.1 mL)Thermo Fisher Scientific69570Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL
Dialysis cup (2 mL)Thermo Fisher Scientific88404Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL
DNA ladder markerThermo Fisher ScientificSM0311GeneRuler 1 kb DNA Ladder
DpnIThermo Fisher ScientificFD1703FastDigest DpnI
E. coli strain JM109
Electrophoresis chamberATTO
Ethanol (99.5%)Nakalai tesque14713-95
Ethidium bromide
Evaporation flask, 100 mL
Gel imager
Gel scannerWe use document scanner and LED immuninator as a substitute.
LB broth
Lipids of interestAvanti Polar Lipids
Micro centrifugeTOMYMX-307
NTP mixCellFree SciencesCFS-TSC-NTPMixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each
Nuclease-free 25 mL tubeIWAKI362-025-MYP
Nucrease-free plastic tubesWatson bio labsDo not autoclave. Use them separately from other experiments.
Nucrease-free tipsWatson bio labsDo not autoclave. Use them separately from other experiments.
PBS buffer
PCR purification kitMACHEREY-NAGEL740609NucleoSpin Gel and PCR Clean-up
pEU-E01-MCS vectorCellFree SciencesCFS-11
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)Nippon Gene311-90151
Plasmid prep Midi kitMACHEREY-NAGEL740410NucleoBond Xtra Midi
Primer 1Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthesis5’-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’
Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence.
Primer 2Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthesis5'-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’
Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence.
Primer 3Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthesis5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3'
Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.
Primer 4Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthesis5'-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3'
Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.
Primer 5Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthesis5’-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3’
Sequencing primer, forward
Primer 6Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthesis5’- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3’
Sequencing primer, reverse
Protein size markerBio-Rad1610394Precision Plus Protein Standard
Rotary evaporator
seamless cloning enzyme mixtureNew England BioLabsE2611LGibson Assembly Master Mix
Other seamless cloning reagents are also avairable.
SP6 RNA Polymerase & RNase InhibitorCellFree SciencesCFS-TSC-ENZ
Submarine Electrophoresis system
TAE buffer
Transcription Buffer LMCellFree SciencesCFS-TSC-5TB-LM
Translation bufferCellFree SciencesCFS-SUB-SGCSUB-AMIX SGC (×40) stock solution (S1, S2, S3, S4).
Prepare ×1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water.
Ultrapure waterWe recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave.
We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system.
Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle.
Ultrasonic homogenizerBransonSONIFIER model 450D-AdvancedUltrasonic cleaner can be used as a substitute.
UV transilluminator
Vacuum desiccator
Wheat germ extractCellFree SciencesCFS-WGE-7240WEPRO7240

References

  1. Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
  2. Gusach, A., et al. Beyond structure: emerging approaches to study GPCR dynamics. Current Opinion in Structural Biology. 63, 18-25 (2020).
  3. Congreve, M., de Graaf, C., Swain, N. A., Tate, C. G. Impact of GPCR Structures on Drug Discovery. Cell. 181 (1), 81-91 (2020).
  4. Wilkinson, T. C. I. Discovery of functional monoclonal antibodies targeting G-protein-coupled receptors and ion channels. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 831-837 (2016).
  5. Hino, T., Iwata, S., Murata, T. Generation of functional antibodies for mammalian membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 23 (4), 563-568 (2013).
  6. Webb, D. R., Handel, T. M., Kretz-Rommel, A., Stevens, R. C. Opportunities for functional selectivity in GPCR antibodies. Biochemical Pharmacology. 85 (2), 147-152 (2013).
  7. Douthwaite, J. A., Finch, D. K., Mustelin, T., Wilkinson, T. C. I. Development of therapeutic antibodies to G-protein coupled receptors and ion channels: Opportunities, challenges and their therapeutic potential in respiratory diseases. Pharmacology and Therapeutics. 169, 113-123 (2016).
  8. Hashimoto, Y., Yagi, K., Kondoh, M. Current progress in a second-generation claudin binder, anti-claudin antibody, for clinical applications. Drug Discovery Today. 21 (10), 1711-1718 (2016).
  9. Hutchings, C. J., Colussi, P., Clark, T. G. Ion channels as therapeutic antibody targets. mAbs. 11 (2), 265-296 (2019).
  10. Errey, J. C., Fiez-Vandal, C. Production of membrane proteins in industry: The example of GPCRs. Protein Expression and Purification. 169, 105569 (2020).
  11. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  12. Wiseman, D. N., et al. Expression and purification of recombinant G protein-coupled receptors: a review. Protein Expression and Purification. 167, 105524 (2020).
  13. Jeffery, C. J. Expression, Solubilization, and Purification of Bacterial Membrane Proteins. Current Protocols in Protein Science. 83 (1), 1-15 (2016).
  14. Spirin, A. S., Baranov, V. I., Ryabova, L. A., Ovodov, S. Y., Alakhov, Y. B. A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield. Science. 242 (4882), 1162-1164 (1988).
  15. Takai, K., Sawasaki, T., Endo, Y. Practical cell-free protein synthesis system using purified wheat embryos. Nature Protocols. 5 (2), 227-238 (2010).
  16. Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
  17. Shimizu, Y., Kuruma, Y., Ying, B. W., Umekage, S., Ueda, T. Cell-free translation systems for protein engineering. The FEBS Journal. 273 (18), 4133-4140 (2006).
  18. Klammt, C., et al. Cell-free expression as an emerging technique for the large scale production of integral membrane protein. The FEBS Journal. 273 (18), 4141-4153 (2006).
  19. Nozawa, A., et al. A cell-free translation and proteoliposome reconstitution system for functional analysis of plant solute transporters. Plant and Cell Physiology. 48 (12), 1815-1820 (2007).
  20. Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35-45 (2011).
  21. Henrich, E., Hein, C., Dotsch, V., Bernhard, F. Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates. FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).
  22. Henrich, E., Peetz, O., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife. 6, 243 (2017).
  23. Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins. Frontiers in Pharmacology. 10, 744 (2019).
  24. Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).
  25. Sackin, H., Nanazashvili, M., Makino, S. I. Direct injection of cell-free Kir1.1 protein into Xenopus oocytes replicates single-channel currents derived from Kir1.1 mRNA. Channels. 9 (4), 196-199 (2015).
  26. Zemella, A., Richter, T., Thoring, L., Kubick, S. A combined cell-free protein synthesis and fluorescence-based approach to investigate GPCR binding properties. Methods in Molecular Biology. 1947 (10), 57-77 (2019).
  27. Vaish, A., Guo, S., Murray, R. M., Grandsard, P. J., Chen, Q. On-chip membrane protein cell-free expression enables development of a direct binding assay: A curious case of potassium channel KcsA-Kv1.3. Analytical Biochemistry. 556, 70-77 (2018).
  28. Suzuki, Y., et al. Functional G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) synthesis: the pharmacological analysis of Human Histamine H1 Receptor (HRH1) synthesized by a wheat germ cell-free protein synthesis system combined with asolectin glycerosomes. Frontiers in Pharmacology. 9, 38 (2018).
  29. Cortes, S., Barette, C., Beroud, R., De Waard, M., Schaack, B. Functional characterization of cell-free expressed Kv1.3 channel using a voltage-sensitive fluorescent dye. Protein Expression and Purification. 145, 94-99 (2018).
  30. Woznicka-Misaila, A., Juillan-Binard, C., Baud, D., Pebay-Peyroula, E., Ravaud, S. Cell-free production, purification and characterization of human mitochondrial ADP/ATP carriers. Protein Expression and Purification. 144, 46-54 (2018).
  31. Hashimoto, Y., et al. Engineered membrane protein antigens successfully induce antibodies against extracellular regions of claudin-5. Scientific Reports. 8 (1), 8383 (2018).
  32. Sawasaki, T., et al. A bilayer cell-free protein synthesis system for high-throughput screening of gene products. FEBS Letters. 514 (1), 102-105 (2002).
  33. Goshima, N., et al. Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome. Nature Methods. 5 (12), 1011-1017 (2008).
  34. Nemoto, K., Takemori, N., Seki, M., Shinozaki, K., Sawasaki, T. Members of the plant CRK superfamily are capable of trans- and autophosphorylation of tyrosine residues. The Journal of Biological Chemistry. 290 (27), 16665-16677 (2015).
  35. Takeda, H., et al. Comparative analysis of human src-family kinase substrate specificity in vitro. Journal of Proteome Research. 9 (11), 5982-5993 (2010).
  36. Takahashi, H., et al. Establishment of a wheat cell-free synthesized protein array containing 250 human and mouse E3 ubiquitin ligases to identify novel interaction between E3 ligases and substrate proteins. PLoS One. 11 (6), 0156718 (2016).
  37. Nozawa, A., et al. Construction of a protein library of Arabidopsis transcription factors using a wheat cell-free protein production system and its application for DNA binding analysis. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (7), 1661-1664 (2009).
  38. Goren, M. A., Nozawa, A., Makino, S. I., Wrobel, R. L., Fox, B. G. Cell-free translation of integral membrane proteins into unilamelar liposomes. Methods in Enzymology. 463, 647-673 (2009).
  39. Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35 (2011).
  40. Renauld, S., et al. Functional reconstitution of cell-free synthesized purified Kv channels. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1859 (12), 2373-2380 (2017).
  41. Liu, S., et al. Efficiency and Safety of CRAC Inhibitors in Human Rheumatoid Arthritis Xenograft Models. Journal of Immunology. 199 (5), 1584-1595 (2017).
  42. Jarecki, B. W., Makino, S. I., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into xenopus oocytes. Scientific Reports. 3, 1-7 (2013).
  43. David, G., et al. Phosphorylation and alternative translation on wheat germ cell-free protein synthesis of the DHBV large envelope protein. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 138 (2019).
  44. Jirasko, V., et al. Proton-detected solid-state NMR of the cell-free synthesized α-helical transmembrane protein NS4B from hepatitis C virus. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 21 (10), 1453-1460 (2020).
  45. Takeda, H., et al. Production of monoclonal antibodies against GPCR using cell-free synthesized GPCR antigen and biotinylated liposome-based interaction assay. Scientific Reports. 5, 11333 (2015).
  46. Zhou, W., Takeda, H. Production of immunizing antigen proteoliposome using cell-free protein synthesis system. Methods in Molecular Biology. 1868, 49-67 (2018).
  47. Hutchings, C. J., Koglin, M., Marshall, F. H. Therapeutic antibodies directed at G protein-coupled receptors. mAbs. 2 (6), 594-606 (2010).
  48. Raetz, C. R. H., et al. Discovery of new biosynthetic pathways: the lipid A story. Journal of Lipid Research. 50, 103-108 (2009).
  49. Baldridge, J. R., Crane, R. T. Monophosphoryl lipid A (MPL) formulations for the next generation of vaccines. Methods. 19 (1), 103-107 (1999).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

163 GPCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved