Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, buğday hücresiz sistem ve lipozomlar kullanılarak çift katmanlı diyaliz yöntemiyle yüksek kaliteli proteolipozom üretimi için etkili bir hücresiz yöntemi tanımlamaktadır. Bu yöntem, membran proteinlerinin fonksiyonel analizi, ilaç hedeflerinin taranması ve antikor gelişimi için uygun araçlar sağlar.

Özet

Membran proteinleri çeşitli hücresel süreçlerde önemli roller oynar ve hayati işlevleri yerine getirir. Membran proteinleri, ilaç keşfinde tıbbi olarak önemlidir, çünkü tüm ilaçların yarısından fazlasının hedefidirler. Membran proteinlerinin biyokimyasal, biyofiziksel ve yapısal çalışmalarının yanı sıra antikor gelişiminin önündeki bir engel, doğru konformasyon ve aktiviteye sahip büyük miktarlarda yüksek kaliteli membran proteini üretmenin zorluğu olmuştur. Burada, membran proteinlerini verimli bir şekilde sentezlemek ve saflaştırılmış proteolipozomları kısa sürede yüksek bir başarı oranıyla hazırlamak için buğday tohumu hücresiz bir sistem, lipozomlar ve diyaliz kapları kullanan bir "çift katmanlı diyaliz yöntemi" ni tanımlamaktayız. Membran proteinleri, GPCR'ler, iyon kanalları, taşıyıcılar ve tetraspaninler gibi birkaç miligramda olduğu kadar üretilebilir. Bu hücresiz yöntem, yüksek kaliteli proteolipozomların hazırlanması için zamanın, maliyetin ve çabanın azaltılmasına katkıda bulunur ve membran proteinlerinin fonksiyonel analizi, ilaç hedeflerinin taranması ve antikor gelişimi için uygun araçlar sağlar.

Giriş

Membran proteinleri tanı ve terapötiklerde en önemli ilaç hedeflerinden biridir. Gerçekten de, küçük bileşik ilaçların yarısı, G-proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) ve iyon kanalları1 gibi membran proteinleridir. Yıllar geçtikçe, araştırmacılar membran proteinlerinin yapılarını ve işlevlerini aydınlatmak için biyokimyasal, biyofiziksel ve yapısal çalışmalar üzerinde çalışıyorlar 2,3. Membran proteinlerine karşı monoklonal antikorların geliştirilmesi, fonksiyonel ve yapısal çalışmaların hızlandırılması, tedavi ve tanısal uygulamaların geliştirilmesi amacıyla da aktif olarak yapılmaktadır 4,5,6,7,8,9. Tüm bu çalışmalar çok miktarda yüksek kaliteli membran proteini gerektirir10. Örneğin, antikor gelişimi için doğal konformasyona sahip birkaç miligram saflaştırılmış membran proteinine ihtiyaç vardır. X-ışını kristalografisi için çok daha fazla miktarda yüksek saflaştırılmış membran proteini gereklidir. Bununla birlikte, membran proteinlerinin seri üretimi, membran proteini araştırmasında bir darboğaz olmaya devam etmektedir11. Membran proteinleri bir veya daha fazla transmembran helis ile karmaşık yapılara sahiptir ve hücre homeostazında önemli roller oynarlar. Membran proteinlerinin heterolog aşırı ekspresyonu, yüksek lokal konsantrasyonlarda biriken membran proteinlerinin toplanması veya hücresel sinyal yollarının bozulması gibi çoklu engellere yol açar. İfade başarılı olsa bile, numune hazırlamanın sonraki adımları da zorlukla karşı karşıyadır. Örneğin, proteolipozomun hazırlanması, membran proteinlerinin çözündürülmesi, saflaştırılması ve stabilizasyonunda üst düzey beceriler ve mesleki deneyimler gerektirir ve ayrıca çok fazla çaba ve zamana mal olur12,13.

Öte yandan, son yıllarda canlı hücreler kullanılmadan protein üretmek için bazı ileri teknolojiler ortaya çıkmıştır 14,15,16,17,18. Hücresiz protein sentez teknolojisi, bir test tüpünde translasyon reaksiyonunu yeniden oluşturur. Hücresel ekspresyon sisteminin sahip olduğu herhangi bir sınırlama olmadığından, hücresiz sistemler, hücrelerde toksisiteyi ifade etmesi veya göstermesi zor olan çeşitli proteinleri sentezleme potansiyeline sahiptir. Saflaştırılmış hücre ekstresi veya yeniden yapılandırılmış translasyonel makine, şablon mRNA'lar, amino asitler ve enerji kaynakları ile karıştırılır ve rekombinant proteinler kısa sürede sentezlenir. Membran protein sentezi ile ilgili olarak, lipozomlar, biseller, nanodiskler veya kopolimerler gibi lipitlerden veya amfifillerden oluşan bazı iskeleler hücresiz reaksiyonaeklenir 19,20,21,22,23,24. Sentezlenmiş membran proteinleri iskelelerle etkileşime girer ve suda stabilize edilebilir. Hücresiz sentezlenmiş membran proteinleri fonksiyonel çalışmalarda ve antikor üretiminde yaygın olarak kullanılmaktadır 25,26,27,28,29,30,31.

Bu protokolde, buğday hücresiz sistem ve lipozomlar kullanılarak etkili bir hücresiz proteolipozom üretim yöntemi tarif ediyoruz. Buğday hücresi içermeyen protein sentez sistemi, buğday tohumu15,32,33'ten ekstrakt kullanan güçlü bir in vitro çeviri sistemidir. Buğday tohumu çok miktarda translasyonel makine ve az sayıda çeviri inhibitörü içerir. Ökaryotların bir üyesi olan buğdaydaki translasyonel makine, ökaryotik proteinleri çevirmek için uygundur ve çeviri verimliliği, mRNA şablonunun kodon kullanımından pek etkilenmez. Buğday hücresiz sistemi kullanarak, protein kinazları 34,35, ubikitin ligazlar 36, transkripsiyon faktörleri37 ve membran proteinleri dahil olmak üzere yüksek başarı oranlarına sahip çeşitli proteinleri sentezledik. Membran protein üretimi için translasyon karışımına lipid vezikül lipozomu iskele19,38 olarak ekliyoruz. Membran proteininin hidrofobik alanları lipid çift katmanlı ile etkileşime girer ve kendiliğinden lipozom ile bütünleşir. Yoğunluk gradyanı santrifüjlemesi, proteolipozomun endojen buğday proteinlerinden kesinlikle ayrılması için kullanılır, ancak translasyon reaksiyonu karışımının ortak bir santrifüjlenmesi, proteolipozom20'nin basit bir saflaştırılması için yeterlidir. Birçok çeşit integral membran proteini buğday hücresiz sistem kullanılarak sentezlenmiş veçeşitli araştırma ve geliştirmeler için uygulanmıştır 25,38,39,40,41,42,43,44. Ayrıca, büyük ölçekli üretim45,46 için "çift katmanlı diyaliz yöntemini" geliştirdik. Bu yöntemde fincan tipi diyaliz cihazı substrat besleme tamponuna daldırılır ve fincan içerisinde Şekil 1'de gösterildiği gibi iki kat translasyon reaksiyonu karışımı ve substrat besleme tamponu oluşturulur. Substratların sürekli temini ve yan ürünün uzaklaştırılması, reaksiyon karışımının hem üstünde hem de altında uzun süre verimli bir şekilde gerçekleştirilebilir, bu da mükemmel çeviri etkinliğine yol açar (Şekil 2A ve Şekil 2B)45.

Protokol

1. pEU ekspresyon plazmidinin hazırlanması

NOT: pEU ekspresyon plazmidi başlangıç kodonunu, hedef membran proteininin açık okuma çerçevesini ve fragmandaki durdurma kodonunu içermelidir (bkz. Şekil 1). Gerektiğinde algılama/saflaştırma etiketi dizilerini uygun konuma ekleyin. Subklonlama için ya restriksiyon enzim sindirimi ya da dikişsiz klonlama uygulanabilir. Burada kesintisiz klonlama yöntemi kullanan bir protokolü açıklıyoruz.

  1. DNA parçasını ekleyin.
    1. cDNA şablonunu, primer 1 ve primer 2'yi kullanarak PCR ile ilgilenilen geni güçlendirin. Astar 1 ve primer 2, dikişsiz klonlama için sırasıyla 15 bp örtüşme içerir ( bkz.
      NOT: Hücrelerdeki olgun proteinden işlenecek ve çıkarılacak dizileri (örneğin, sinyal dizisi) dahil etmeyin. Sentezlenmiş proteinin işlenmesi buğday hücresiz sistemde yapılmaz. Kozak dizisi eklemeyin. pEU-E01-MCS vektörü E01 çeviri geliştiricisine sahiptir.
    2. Şablon plazmid DNA'sını çıkarmak için PCR ürününe 1/25 hacim DpnI kısıtlama enzimi ekleyin. 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. PCR ürününü saflaştırmak ve konsantrasyonu 20-50 ng / μL'de ayarlamak için bir PCR saflaştırma kiti kullanın.
  2. pEU-E01-MCS vektörünü doğrusallaştırın.
    1. pEU-E01-MCS, primer 3 ve primer 4 kullanarak ters PCR uygulayın.
    2. Ters PCR ürününe 1/25 hacim DpnI restriksiyon enzimi ekleyin. 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. PCR ürününü üreticinin tavsiyesine göre saflaştırmak için bir PCR saflaştırma kiti kullanın. Konsantrasyonu 20–50 ng/μL'de ayarlayın.
  3. 2 μL ekleme DNA fragmanı, 2 μL doğrusallaştırılmış vektör ve 4 μL 2x dikişsiz klonlama enzim karışımı karıştırın.
  4. Escherichia coli suşu JM109'u dikişsiz klonlama ürünü ile dönüştürün. Bir yayıcı kullanarak, bakteriyel süspansiyonu bir LB-ampisilin agar plakasına yayın.
    NOT: pEU vektörünün ampisilin direnç işaretleyicisi vardır.
  5. pEU plazmidinde MCS'nin 5' ve 3' tarafından sırasıyla primer 5 ve primer 6 kullanılarak oluşturulan ekspresyon plazmidinin sırasını onaylayın.
  6. Plazmidler ekspresyonunu güçlendirin ve saflaştırın.
    1. Plazmid-dönüştürülmüş E. coli suşu JM109'u 37 ° C'de 150 mL LB-ampisilin ortamında ve gece boyunca sallanan dakikada 125 vuruşta kültürleyin.
    2. Ticari olarak temin edilebilen plazmid hazırlık midi kitini kullanarak plazmidleri çıkarın ve saflaştırın. Plazmidleri 500 μL TE tamponunda çözün.
      DİKKAT: Plazmid ekstraksiyonu için mini hazırlık kiti kullanmayın. Plazmidin yeterli nitelik ve miktarını sağlamaz.
    3. 500 μL fenol/kloroform/izoamil alkol ekleyin (25:24:1). 5 dakika boyunca kuvvetlice karıştırın ve 17.800 x g ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Üst plazmid çözeltisini yeni bir tüpe aktarın.
      DİKKAT: Cildi fenol ve kloroformdan korumak için tek kullanımlık eldiven giyin.
      NOT: RNaz'ın plazmid ekstraksiyon kitinden kontaminasyonunu gidermek için, fenol-kloroform saflaştırma kullanarak plazmidleri saflaştırın.
    4. Fenolün tamamen çıkarılması için 500 μL kloroform ekleyin. 5 dakika boyunca kuvvetlice karıştırın ve 17.800 x g ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Üst plazmid çözeltisini yeni bir tüpe aktarın.
    5. 2,5 hacim etanol ve 1/8 hacim 7,5 M amonyum asetat ekleyin ve 1 saat boyunca -30 °C'de saklayın.
    6. 10 dakika boyunca 4 °C'de 17.800 x g'de santrifüj. Peleti 500 μL% 70 etanol ile yıkayın. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve kuruması için peleti 5 dakika bekletin.
    7. İfade plazmidlerini 100 μL ultra saf suda tamamen çözün. Plazmidlerin konsantrasyonunu 260 nm'de absorbans ile ölçün. Konsantrasyonu 1 mg / mL'ye ayarlayın.

2. In vitro transkripsiyon

DİKKAT: Transkripsiyon ve çeviri adımlarında DNaz ve nükleaz içermeyen plastik tüpler ve uçlar kullanın. Kontaminasyonu önlemek için plastik eşyaların otoklavlanmasından kaçının.

  1. Yeni bir plastik tüpte ultra saf su toplayın.
    DİKKAT: DEPC ile arıtılmış su kullanmayın, çünkü artık DEPC reaksiyonu güçlü bir şekilde engeller. Transkripsiyon ve çeviri için taze saflaştırılmış ultra saf su kullanın.
  2. 115.2 μL ultra saf su, 40 μL Transkripsiyon Tamponu LM, 20 μL NTP karışımı, 2.4 μL 80 U/μL RNaz inhibitörü, 2.4 μL 80 U/μL SP6 polimeraz ve 20 μL 1 mg/mL pEU ekspresyon plazmidleri karıştırarak transkripsiyon reaksiyonu karışımını hazırlayın. Reaktifleri ters çevirerek yavaşça karıştırın. Hızlı bir dönüş yapın.
  3. Transkripsiyon reaksiyonunu 6 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  4. Ters çevirerek reaksiyonu nazikçe karıştırın ve hızla aşağı doğru döndürün. Çeviri için hemen kullanın, aksi takdirde dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
  5. Transkripsiyon ürününü elektroforez ile onaylayın.
    1. 100 mL 1x TAE tamponu ve 1 g agarozu karıştırın. % 1 agaroz TAE jeli hazırlamak için süspansiyonu mikrodalga fırında ısıtın.
    2. 1 μL transkripsiyon reaksiyonu alın ve 3 μL su ve 4 μL 2x yükleme boyası ile karıştırın.
      NOT: RNA'nın denatüre edilmesi gerekli değildir.
    3. Agaroz TAE jeline 4 μL karışım ve 2 μL DNA merdiven belirteci yükleyin.
    4. 20 dakika boyunca 100 V'ta elektrofor.
    5. Jeli ethidium bromür içinde 30 dakika bekletin. UV transilluminatör ve jel görüntüleyici kullanarak mRNA'nın merdiven bandı modelini kontrol edin.
      NOT: 500 bp'den daha az bulaşmış bir bant gözlendiğinde, mRNA bozunmasından şüphelenilir.

3. Çeviri için materyallerin hazırlanması

  1. Çeviri arabelleğini hazırlayın.
    1. 50 mL'lik bir tüpte sırasıyla 27 mL taze hazırlanmış ultra saf su ve S1, S2, S3 ve S4 için her 40x stok çözeltisinin 0,75 mL'sini karıştırın.
      NOT: Malzeme miktarlarını, gerekli olan son 1x çeviri tamponu miktarına göre ayarlayın.
      DİKKAT: Fazla 1x çeviri arabelleğini kullandıktan sonra saklamayın veya yeniden dondurmayın.
  2. Kreatin kinaz stok çözeltisi hazırlayın. Liyofilize kreatin kinaz, ultra saf suda 20 mg / mL'lik son bir konsantrasyona kadar çözülür. Çözeltiyi 0,2 mL 8 şeritli PCR tüplerinde küçük miktarlarda (her biri 10 ila 50 μL) dağıtın. Tüpleri sıvı azotta dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
    DİKKAT: Çözüldükten sonra kreatin kinaz solüsyonunu tekrar dondurmayın.
  3. Gliserolü diyaliz zarından çıkarmak için diyaliz kaplarını (0.1 mL boyutunda) yıkayın.
    NOT: Birkaç farklı boyutta diyaliz kabı vardır. Küçük ölçekli bardaklar (0.1 mL) sırasıyla küçük ölçekli test için (bölüm 5.4) ve büyük ölçekli üretim için büyük boyutlu bardaklar (2 mL) (bölüm 5.5) kullanılır. Büyük boy bardakların diyaliz zarının yıkanma adımı önlenebilir.
    1. Yeni bir 1,5 mL tüpe 1 mL ultra saf su koyun. Tüpe küçük boyutlu diyaliz kabı (0,1 mL) yerleştirin. Bardağa 0,5 mL ultra saf su ekleyin.
    2. Oda sıcaklığında 30 dakikadan fazla inkübe edin.

4. Lipozomların hazırlanması

NOT: Burada lipozomların hazırlanması için iki protokol açıklanmaktadır. Biri kullanıma hazır liyofilize lipozomlar (bölüm 4.1) kullanırken, diğeri ince bir lipit filmi nemlendirerek lipozomlar üretir (bölüm 4.2).

  1. Liyofilize lipozomlar kullanarak lipozomlar hazırlayın.
    NOT: Proteolipozom üretmenin daha kolay bir yolu, ticari olarak temin edilebilen Asolectin lipozomu kullanmaktır. Aderektin, soya fasulyesinden elde edilen bir tür doğal lipittir.
    1. 10 mg liyofilize Asolectin lipozomları içeren şişeyi açın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve şişenin altına 200 μL çeviri tamponu (bölüm 3.1) ekleyin. Şişeyi kapatın ve 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
    2. Şişeyi vorteks karıştırıcısına 1 dakika boyunca koyarak kuvvetlice karıştırın.
    3. Şişeyi 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin. 1 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yaparak tüpü aşağı doğru döndürün.
    4. Bir pipet kullanarak, Asolectin lipozom süspansiyonunu (50 mg lipit / mL) yeni bir 1.5 mL tüpe aktarın. Çeviri için hemen lipozom kullanın, aksi takdirde sıvı azotta dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
  2. İnce bir lipit filmi nemlendirerek lipozomlar hazırlayın.
    1. Bir lipit toz halinde satılırsa, kloroform veya uygun organik çözücü içinde 10-100 mg / mL konsantrasyonuna kadar çözün.
      NOT: İnce bir lipit filmi, saflaştırılmış ve/veya sentezlenmiş amfifilik lipitler kullanılarak hazırlanabilir. Asolectin'in saflaştırma yöntemi daha önce tarif edilmiştir38. Biyotinile lipidler, floresan lipitler ve adjuvan lipitler gibi fonksiyonel olarak modifiye lipidler, fonksiyonel lipozomlar üretmek için bazal lipitlere eklenebilir.
    2. 50 mg lipit (ler) içeren lipit çözeltisini bir buharlaşma şişesine aktarın.
    3. Döner bir evaporatör kullanarak, çözücüyü buharlaştırın ve ince bir lipit filmi oluşturmak için lipidi şişe tabanının duvarına eşit şekilde yayın.
    4. Şişeyi vakumlu bir kurutucuya koyun ve çözücüyü tamamen çıkarmak için gece boyunca negatif basınç altında bırakın.
    5. Evaporasyon şişesine 1 mL translasyon tamponu ekleyin. Tamponu ince lipit filmi üzerine yaymak için şişeyi döndürün. Filmi nemlendirmek için 5 dakika boyunca inkübe edin.
    6. Şişeyi ultrasonik homojenleştirici veya ultrasonik temizleyici ile sonikleştirin. Solüsyonun filme iyice dokunmasına izin vermek için şişenin açısını ara sıra değiştirin. İnce lipit filmin alttan soyulduğundan ve tamamen ve homojen bir şekilde emülsifiye edildiğinden emin olun.
      NOT: Lipozomlar içeren biyotinile lipidlerin elektron mikrografisi Şekil 1'de gösterilmiştir.
    7. Lipozom süspansiyonunu (50 mg lipitler / mL) yeni bir 1.5 mL tüpe aktarın. Hemen kullanılmayacaksa, lipozomları sıvı azotta dondurun ve -80 ° C'de saklayın.

5. In vitro çeviri

  1. Tüpleri oda sıcaklığında birkaç dakika boyunca su üzerinde yüzdürerek buğday tohumu ekstraktını hızlı bir şekilde çözün. Çözdükten sonra, tüpleri ters çevirerek hemen hafifçe karıştırın, aşağı doğru çevirin ve kullanana kadar buz üzerinde soğutun.
    NOT: Buğday tohumu ekstraktını kullandıktan sonra sıvı azotta dondurun ve -80 °C'de saklayın. Birkaç donma/çözülme döngüsüne dayanır.
  2. 20 mg/mL kreatin kinaz stok çözeltisini çözün. 2 mg / mL kreatin kinaz çalışma çözeltisi hazırlamak için 5 μL stok çözeltisi ve 45 μL translasyon tamponunu karıştırın.
    DİKKAT: Kreatin kinazın yeniden dondurulması önerilmez.
  3. Gerektiğinde lipozomları veya mRNA'ları çözün.
  4. Küçük ölçekli bir protein translasyonu yapın.
    1. Adım 3.3.2'de hazırlandığı gibi hem tüpten hem de diyaliz kabından (0,1 mL) suyu çıkarın.
    2. Tüp ve diyaliz kabına sırasıyla 1 mL ve 300 μL translasyon tamponu enjekte edin.
      DİKKAT: Diyaliz kabının tabanının 1,5 mL tüpteki translasyon tamponunun yüzeyine ulaşmaması durumunda, tüpe ilave 50-100 μL tampon enjekte edin.
    3. 15.6 μL translasyon tamponu, 2.4 μL 2 mg/mL kreatin kinaz, 12 μL 50 mg/mL lipozom, 15 μL buğday tohumu ekstresi ve 15 μL mRNA karıştırarak translasyon reaksiyonu karışımı hazırlayın. Tüpleri ters çevirerek yavaşça karıştırın ve aşağı doğru çevirin.
    4. 200 μL'lik bir pipet kullanarak translasyon reaksiyonu karışımının 60 μL'sini aspire edin.
    5. Pipet ucunu diyaliz kabındaki translasyon tamponunun alt yüzeyine yerleştirin. Reaksiyon karışımını yavaşça ve nazikçe pipetle çıkarın. Buharlaşmayı önlemek için diyaliz kabını bir kapakla örtün.
      NOT: Reaksiyon karışımı doğal olarak kabın dibine batar ve bir çift katman oluşturur. Bardağı karıştırarak veya sallayarak çift katmanı rahatsız etmeyin.
  5. Büyük ölçekli bir çeviri yapın (Şekil 1).
    1. 22 mL çeviri tamponunu 25 mL'lik bir tüpe dökün. Tüpe büyük boyutlu bir diyaliz kabı (2 mL) yerleştirin ve bardağa 2 mL çeviri tamponu ekleyin.
    2. 130 μL translasyon tamponu, 20 μL 2 mg/mL kreatin kinaz, 100 μL 50 mg/mL lipozom, 125 μL buğday tohumu ekstresi ve 125 μL mRNA karıştırarak bir translasyon reaksiyonu karışımı hazırlayın. Pipetleme yaparak nazikçe karıştırın.
    3. 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak tüm translasyon reaksiyonu karışımını (500 μL) aspire edin. Translasyon reaksiyonu karışımını diyaliz kabına adım 5.4.5'te açıklandığı şekilde enjekte edin. Buharlaşmayı önlemek için diyaliz kabını kapakla örtün.
  6. Reaksiyonları 24 saat boyunca 15 ° C'de inkübe edin.
  7. Reaksiyonu diyaliz kabında pipetle iyice karıştırın. Ham proteolipozom süspansiyonunu yeni bir tüpe aktarın.
    NOT: Proteolipozomu küçük ölçekli çeviriden toplamak için düz tabanlı 1.5 mL'lik bir tüp önerilir. Santrifüjlemeden sonra, lipozomlar tüpün alt köşesinde kompakt ve kolayca görülebilen pelet oluşturur.

6. Proteolipozomların saflaştırılması

  1. Ham proteolipozom süspansiyonu içeren tüpü 4 ° C'de 17.800 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj edin.
  2. Süper natantı çıkarın. Proteolipozom peletini pipetle pipetleme ile PBS'de (küçük ölçekli: 1 mL, büyük ölçekli: 10 mL) askıya alın.
  3. Proteolipozomların santrifüjlenmesini ve yıkanmasını iki daire daha tekrarlayın.
  4. Yıkadıktan sonra, az miktarda PBS ekleyin ve pipetleme ile proteolipozom peletini iyice askıya alın. Mikro pipet kullanarak süspansiyonun hacmini ölçün. Ses seviyesini 60 μL (küçük ölçekli) veya 500 μL (büyük ölçekli) olarak ayarlamak için PBS ekleyin. Süspansiyonu yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.
  5. 10 μL proteolipozom süspansiyonunu SDS-PAGE için yeni bir PCR tüpüne aktarın. Numunelerin geri kalanını gerektiğinde kullanmak üzere daha küçük porsiyonlara bölün. Sıvı azotta dondurun ve -80 °C'de saklayın.

7. SDS-PAGE ve CBB boyama

  1. 10 μL proteolipozom süspansiyonuna 70 μL su ve 40 μL 3x SDS-PAGE numune tamponu ekleyin.
    DİKKAT: SDS-PAGE numunesini kaynatmayın, çünkü membran proteinleri toplanır ve elektroforezde akrilamid jele neredeyse hiç nüfuz etmez. Ayrıca, oksidasyonu önlemek için SDS-PAGE numune tamponuna yeterli indirgeyici madde ekleyin (örneğin,% 3 nihai konsantrasyonda 2-merkaptoetanol).
  2. Bir elektroforez odasına% 5-20 gradyan SDS-PAGE jeli ayarlayın. 3 μL, 6 μL, 12 μL proteolipozom numunesi, 2 μL protein boyutu belirteci ve BSA standart serisini de yükleyin.
  3. 52 mA'da elektrofor, 30 dakika boyunca 400 V.
  4. Jeli 1 saat boyunca CBB boyası ile lekeleyin. Sıcak suda rengi çözün ve jel görüntüsünü tarayın.
  5. NIH Image J yazılımını (https://imagej.nih.gov/ij/) kullanarak, her şeritteki membran proteininin bant yoğunluğunu ölçün. BSA standart serisi ile sentezlenmiş membran proteinlerinin miktarını tahmin edin.

Sonuçlar

Bu protokol kullanılarak kısa sürede kısmen saflaştırılmış proteolipozomlar elde edilebilir. Temsili sonuçlar Şekil 2A'da gösterilmiştir. Sınıf A, B ve C'nin yirmi beş GPCR'si, çift katmanlı diyaliz yöntemi (küçük ölçekli) kullanılarak başarıyla sentezlendi ve santrifüjleme ve tampon yıkama ile kısmen saflaştırıldı. Sentezlenen proteinlerin miktarı protein türüne göre değişmekle birlikte, büyük diyaliz kapları kullanıldığında reaksiyon başına ...

Tartışmalar

Sunulan protokol, membran proteinlerini yüksek başarı oranında üretmek için bir yöntem sağlar. Bu protokol basittir, yüksek oranda yeniden üretilebilir ve ölçeği artırılabilir. Ayrıca, büyük miktarda membran proteini tüketen deneylerin süresini ve maliyetini azaltma potansiyeline sahiptir. Çift katmanlı diyaliz yöntemi, iki katmanlı yönteme veya diyaliz yöntemine kıyasla üretkenliği 4-10 kat artırır (Şekil 2B)45. Aşırı bir durumda, b...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Bu araştırma, AMED'den JP20am0101077 Hibe Numarası altında İlaç Keşfi ve Yaşam Bilimleri Araştırmalarını Destekleme Platform Projesi (Yenilikçi İlaç Keşfi ve Yaşam Bilimleri Araştırmalarını Destekleme Temeli (BINDS)) tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma kısmen JSPS KAKENHI Hibe Numarası 20K05709 tarafından da desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
×3 SDS-PAGE sample bufferContaining 10% 2-mercaptoethanol
5-20% gradient SDS-PAGE gelATTOE-D520L
70% ethanolDiluted ethanol by ultrapure water.
AgaroseTakara Bio
Ammonium acetateNakalai tesque02406-95As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30°C.
Ampicillin SodiumNakalai tesque02739-74
Asolectin Liposome, lyophilizedCellFree SciencesCFS-PLE-ASLA vial contains 10 mg of lyophilized liposomes.
BSA standard1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 µL ×1 SDS-PAGE sample buffer
CBB gel stain
cDNA clone of interestPlasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment
ChloroformNakalai tesque08402-84
Cooled incubatorTemperature ranging from 0 to 40 °C or wider.
Creatine kinaseRoche Diagnostics04524977190
Dialysis cup (0.1 mL)Thermo Fisher Scientific69570Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL
Dialysis cup (2 mL)Thermo Fisher Scientific88404Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL
DNA ladder markerThermo Fisher ScientificSM0311GeneRuler 1 kb DNA Ladder
DpnIThermo Fisher ScientificFD1703FastDigest DpnI
E. coli strain JM109
Electrophoresis chamberATTO
Ethanol (99.5%)Nakalai tesque14713-95
Ethidium bromide
Evaporation flask, 100 mL
Gel imager
Gel scannerWe use document scanner and LED immuninator as a substitute.
LB broth
Lipids of interestAvanti Polar Lipids
Micro centrifugeTOMYMX-307
NTP mixCellFree SciencesCFS-TSC-NTPMixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each
Nuclease-free 25 mL tubeIWAKI362-025-MYP
Nucrease-free plastic tubesWatson bio labsDo not autoclave. Use them separately from other experiments.
Nucrease-free tipsWatson bio labsDo not autoclave. Use them separately from other experiments.
PBS buffer
PCR purification kitMACHEREY-NAGEL740609NucleoSpin Gel and PCR Clean-up
pEU-E01-MCS vectorCellFree SciencesCFS-11
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)Nippon Gene311-90151
Plasmid prep Midi kitMACHEREY-NAGEL740410NucleoBond Xtra Midi
Primer 1Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthesis5’-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’
Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence.
Primer 2Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthesis5'-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’
Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence.
Primer 3Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthesis5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3'
Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.
Primer 4Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthesis5'-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3'
Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.
Primer 5Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthesis5’-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3’
Sequencing primer, forward
Primer 6Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthesis5’- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3’
Sequencing primer, reverse
Protein size markerBio-Rad1610394Precision Plus Protein Standard
Rotary evaporator
seamless cloning enzyme mixtureNew England BioLabsE2611LGibson Assembly Master Mix
Other seamless cloning reagents are also avairable.
SP6 RNA Polymerase & RNase InhibitorCellFree SciencesCFS-TSC-ENZ
Submarine Electrophoresis system
TAE buffer
Transcription Buffer LMCellFree SciencesCFS-TSC-5TB-LM
Translation bufferCellFree SciencesCFS-SUB-SGCSUB-AMIX SGC (×40) stock solution (S1, S2, S3, S4).
Prepare ×1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water.
Ultrapure waterWe recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave.
We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system.
Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle.
Ultrasonic homogenizerBransonSONIFIER model 450D-AdvancedUltrasonic cleaner can be used as a substitute.
UV transilluminator
Vacuum desiccator
Wheat germ extractCellFree SciencesCFS-WGE-7240WEPRO7240

Referanslar

  1. Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
  2. Gusach, A., et al. Beyond structure: emerging approaches to study GPCR dynamics. Current Opinion in Structural Biology. 63, 18-25 (2020).
  3. Congreve, M., de Graaf, C., Swain, N. A., Tate, C. G. Impact of GPCR Structures on Drug Discovery. Cell. 181 (1), 81-91 (2020).
  4. Wilkinson, T. C. I. Discovery of functional monoclonal antibodies targeting G-protein-coupled receptors and ion channels. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 831-837 (2016).
  5. Hino, T., Iwata, S., Murata, T. Generation of functional antibodies for mammalian membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 23 (4), 563-568 (2013).
  6. Webb, D. R., Handel, T. M., Kretz-Rommel, A., Stevens, R. C. Opportunities for functional selectivity in GPCR antibodies. Biochemical Pharmacology. 85 (2), 147-152 (2013).
  7. Douthwaite, J. A., Finch, D. K., Mustelin, T., Wilkinson, T. C. I. Development of therapeutic antibodies to G-protein coupled receptors and ion channels: Opportunities, challenges and their therapeutic potential in respiratory diseases. Pharmacology and Therapeutics. 169, 113-123 (2016).
  8. Hashimoto, Y., Yagi, K., Kondoh, M. Current progress in a second-generation claudin binder, anti-claudin antibody, for clinical applications. Drug Discovery Today. 21 (10), 1711-1718 (2016).
  9. Hutchings, C. J., Colussi, P., Clark, T. G. Ion channels as therapeutic antibody targets. mAbs. 11 (2), 265-296 (2019).
  10. Errey, J. C., Fiez-Vandal, C. Production of membrane proteins in industry: The example of GPCRs. Protein Expression and Purification. 169, 105569 (2020).
  11. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  12. Wiseman, D. N., et al. Expression and purification of recombinant G protein-coupled receptors: a review. Protein Expression and Purification. 167, 105524 (2020).
  13. Jeffery, C. J. Expression, Solubilization, and Purification of Bacterial Membrane Proteins. Current Protocols in Protein Science. 83 (1), 1-15 (2016).
  14. Spirin, A. S., Baranov, V. I., Ryabova, L. A., Ovodov, S. Y., Alakhov, Y. B. A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield. Science. 242 (4882), 1162-1164 (1988).
  15. Takai, K., Sawasaki, T., Endo, Y. Practical cell-free protein synthesis system using purified wheat embryos. Nature Protocols. 5 (2), 227-238 (2010).
  16. Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
  17. Shimizu, Y., Kuruma, Y., Ying, B. W., Umekage, S., Ueda, T. Cell-free translation systems for protein engineering. The FEBS Journal. 273 (18), 4133-4140 (2006).
  18. Klammt, C., et al. Cell-free expression as an emerging technique for the large scale production of integral membrane protein. The FEBS Journal. 273 (18), 4141-4153 (2006).
  19. Nozawa, A., et al. A cell-free translation and proteoliposome reconstitution system for functional analysis of plant solute transporters. Plant and Cell Physiology. 48 (12), 1815-1820 (2007).
  20. Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35-45 (2011).
  21. Henrich, E., Hein, C., Dotsch, V., Bernhard, F. Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates. FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).
  22. Henrich, E., Peetz, O., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife. 6, 243 (2017).
  23. Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins. Frontiers in Pharmacology. 10, 744 (2019).
  24. Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).
  25. Sackin, H., Nanazashvili, M., Makino, S. I. Direct injection of cell-free Kir1.1 protein into Xenopus oocytes replicates single-channel currents derived from Kir1.1 mRNA. Channels. 9 (4), 196-199 (2015).
  26. Zemella, A., Richter, T., Thoring, L., Kubick, S. A combined cell-free protein synthesis and fluorescence-based approach to investigate GPCR binding properties. Methods in Molecular Biology. 1947 (10), 57-77 (2019).
  27. Vaish, A., Guo, S., Murray, R. M., Grandsard, P. J., Chen, Q. On-chip membrane protein cell-free expression enables development of a direct binding assay: A curious case of potassium channel KcsA-Kv1.3. Analytical Biochemistry. 556, 70-77 (2018).
  28. Suzuki, Y., et al. Functional G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) synthesis: the pharmacological analysis of Human Histamine H1 Receptor (HRH1) synthesized by a wheat germ cell-free protein synthesis system combined with asolectin glycerosomes. Frontiers in Pharmacology. 9, 38 (2018).
  29. Cortes, S., Barette, C., Beroud, R., De Waard, M., Schaack, B. Functional characterization of cell-free expressed Kv1.3 channel using a voltage-sensitive fluorescent dye. Protein Expression and Purification. 145, 94-99 (2018).
  30. Woznicka-Misaila, A., Juillan-Binard, C., Baud, D., Pebay-Peyroula, E., Ravaud, S. Cell-free production, purification and characterization of human mitochondrial ADP/ATP carriers. Protein Expression and Purification. 144, 46-54 (2018).
  31. Hashimoto, Y., et al. Engineered membrane protein antigens successfully induce antibodies against extracellular regions of claudin-5. Scientific Reports. 8 (1), 8383 (2018).
  32. Sawasaki, T., et al. A bilayer cell-free protein synthesis system for high-throughput screening of gene products. FEBS Letters. 514 (1), 102-105 (2002).
  33. Goshima, N., et al. Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome. Nature Methods. 5 (12), 1011-1017 (2008).
  34. Nemoto, K., Takemori, N., Seki, M., Shinozaki, K., Sawasaki, T. Members of the plant CRK superfamily are capable of trans- and autophosphorylation of tyrosine residues. The Journal of Biological Chemistry. 290 (27), 16665-16677 (2015).
  35. Takeda, H., et al. Comparative analysis of human src-family kinase substrate specificity in vitro. Journal of Proteome Research. 9 (11), 5982-5993 (2010).
  36. Takahashi, H., et al. Establishment of a wheat cell-free synthesized protein array containing 250 human and mouse E3 ubiquitin ligases to identify novel interaction between E3 ligases and substrate proteins. PLoS One. 11 (6), 0156718 (2016).
  37. Nozawa, A., et al. Construction of a protein library of Arabidopsis transcription factors using a wheat cell-free protein production system and its application for DNA binding analysis. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (7), 1661-1664 (2009).
  38. Goren, M. A., Nozawa, A., Makino, S. I., Wrobel, R. L., Fox, B. G. Cell-free translation of integral membrane proteins into unilamelar liposomes. Methods in Enzymology. 463, 647-673 (2009).
  39. Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35 (2011).
  40. Renauld, S., et al. Functional reconstitution of cell-free synthesized purified Kv channels. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1859 (12), 2373-2380 (2017).
  41. Liu, S., et al. Efficiency and Safety of CRAC Inhibitors in Human Rheumatoid Arthritis Xenograft Models. Journal of Immunology. 199 (5), 1584-1595 (2017).
  42. Jarecki, B. W., Makino, S. I., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into xenopus oocytes. Scientific Reports. 3, 1-7 (2013).
  43. David, G., et al. Phosphorylation and alternative translation on wheat germ cell-free protein synthesis of the DHBV large envelope protein. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 138 (2019).
  44. Jirasko, V., et al. Proton-detected solid-state NMR of the cell-free synthesized α-helical transmembrane protein NS4B from hepatitis C virus. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 21 (10), 1453-1460 (2020).
  45. Takeda, H., et al. Production of monoclonal antibodies against GPCR using cell-free synthesized GPCR antigen and biotinylated liposome-based interaction assay. Scientific Reports. 5, 11333 (2015).
  46. Zhou, W., Takeda, H. Production of immunizing antigen proteoliposome using cell-free protein synthesis system. Methods in Molecular Biology. 1868, 49-67 (2018).
  47. Hutchings, C. J., Koglin, M., Marshall, F. H. Therapeutic antibodies directed at G protein-coupled receptors. mAbs. 2 (6), 594-606 (2010).
  48. Raetz, C. R. H., et al. Discovery of new biosynthetic pathways: the lipid A story. Journal of Lipid Research. 50, 103-108 (2009).
  49. Baldridge, J. R., Crane, R. T. Monophosphoryl lipid A (MPL) formulations for the next generation of vaccines. Methods. 19 (1), 103-107 (1999).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyokimyaSay 163membran proteiniproteolipozomh cresiz protein sentezibu day tohumu ekstresiantikor geli imiGPCRiyon kanalta y c

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır