Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה ללא תאים לייצור פרוטאוליפוזום באיכות גבוהה בשיטת דו-שכבתית-דיאליזה באמצעות מערכת נטולת תאי חיטה וליפוזומים. שיטה זו מספקת אמצעים מתאימים לניתוח פונקציונלי של חלבוני ממברנה, סינון מטרות תרופות ופיתוח נוגדנים.

Abstract

חלבוני ממברנה ממלאים תפקידים חיוניים במגוון תהליכים תאיים ומבצעים תפקידים חיוניים. חלבוני ממברנה חשובים מבחינה רפואית בגילוי תרופות מכיוון שהם המטרות של יותר ממחצית מכל התרופות. מכשול לביצוע מחקרים ביוכימיים, ביופיזיקליים ומבניים של חלבוני ממברנה, כמו גם פיתוח נוגדנים, היה הקושי לייצר כמויות גדולות של חלבון ממברנה באיכות גבוהה עם קונפורמציה ופעילות נכונה. כאן אנו מתארים "שיטת דיאליזה דו-שכבתית" המשתמשת במערכת נטולת תאי נבט חיטה, ליפוזומים וכוסות דיאליזה כדי לסנתז ביעילות חלבוני ממברנה ולהכין פרוטאוליפוזומים מטוהרים בזמן קצר עם אחוזי הצלחה גבוהים. חלבוני ממברנה יכולים להיות מיוצרים עד כמה מיליגרם, כגון GPCRs, תעלות יונים, טרנספורטרים וטטרספאנינים. שיטה נטולת תאים זו תורמת להפחתת הזמן, העלות והמאמץ להכנת פרוטאוליפוזומים באיכות גבוהה, ומספקת אמצעים מתאימים לניתוח פונקציונלי של חלבוני ממברנה, סינון מטרות תרופות ופיתוח נוגדנים.

Introduction

חלבוני ממברנה הם אחד מיעדי התרופות החשובים ביותר באבחון ובטיפול. ואכן, מחצית מהתרופות המורכבות הקטנות הן חלבוני ממברנה, כגון קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) ותעלות יונים1. במהלך השנים, חוקרים עבדו על מחקרים ביוכימיים, ביופיזיקליים ומבניים של חלבוני ממברנה כדי להבהיר את המבנה והתפקוד שלהם 2,3. פיתוח נוגדנים חד שבטיים כנגד חלבוני ממברנה מתבצע גם הוא באופן פעיל על מנת להאיץ מחקרים תפקודיים ומבניים ולפתח יישומים טיפוליים ואבחוניים 4,5,6,7,8,9. כל המחקרים הללו דורשים כמות גדולה של חלבוני ממברנהבאיכות גבוהה 10. לדוגמה, כמה מיליגרם של חלבוני ממברנה מטוהרים עם קונפורמציה טבעית נדרשים לפיתוח נוגדנים. כמות גדולה בהרבה של חלבוני ממברנה מטוהרים מאוד נדרשת לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן. עם זאת, ייצור המוני של חלבוני ממברנה נותר צוואר בקבוק במחקר חלבוני ממברנה11. לחלבוני ממברנה יש מבנים מורכבים עם הליקיס טרנס-ממברנה אחד או יותר והם ממלאים תפקידים חשובים בהומאוסטזיס של התא. ביטוי יתר הטרולוגי של חלבוני ממברנה מוביל למכשולים מרובים כגון צבירה של חלבוני ממברנה המצטברים בריכוזים מקומיים גבוהים או הפרעה למסלולי האותות התאיים. גם אם ההבעה מוצלחת, גם הצעדים הבאים של הכנת המדגם נתקלים בקושי. לדוגמה, הכנת פרוטאוליפוזום, דורשת מיומנויות ברמה גבוהה וניסיון מקצועי בסולוביליזציה, טיהור וייצוב של חלבוני ממברנה, ועולה הרבה מאמץ וזמן כמו גם12,13.

מצד שני, כמה טכנולוגיות מתקדמות התפתחו בעשורים האחרונים כדי לייצר חלבונים ללא שימוש בתאים חיים 14,15,16,17,18. טכנולוגיית סינתזת חלבונים ללא תאים יוצרת מחדש תגובת תרגום במבחנה. מאחר שאין מגבלות שיש למערכת הביטוי התאית, למערכות נטולות תאים יש פוטנציאל לסנתז מגוון חלבונים שקשה לבטא או להראות רעילות בתאים. תמצית תאים מטוהרים או מכונות תרגום משוחזרות מעורבבות עם mRNA של תבנית, חומצות אמינו ומקורות אנרגיה, וחלבונים רקומביננטיים מסונתזים תוך זמן קצר. לגבי סינתזת חלבון הממברנה, סוגים מסוימים של פיגומים המורכבים מליפידים או אמפיפילים, כגון ליפוזומים, דו-תאים, ננו-דיסקים או קופולימרים מתווספים לתגובה נטולת התאים 19,20,21,22,23,24. חלבוני ממברנה מסונתזים מתקשרים עם הפיגומים וניתן לייצבם במים. חלבוני ממברנה מסונתזים ללא תאים נמצאים בשימוש נרחב במחקרים פונקציונליים ובייצור נוגדנים 25,26,27,28,29,30,31.

בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטה יעילה נטולת תאים לייצור פרוטאוליפוזומים באמצעות מערכת נטולת תאי חיטה וליפוזומים. מערכת סינתזת חלבונים נטולת תאי חיטה היא מערכת תרגום חוץ גופית רבת עוצמה המשתמשת בתמצית מנבט חיטה 15,32,33. נבט חיטה מכיל כמות גדולה של מכונות תרגום ומעט מעכבי תרגום. המנגנון התרגומי בחיטה, חבר באאוקריוטים, מתאים לתרגום חלבונים אאוקריוטים, ויעילות התרגום שלו כמעט ואינה מושפעת משימוש קודון בתבנית mRNA. באמצעות מערכת נטולת תאי חיטה, סינתזנו מגוון חלבונים, כולל חלבונים קינאזות 34,35, יוביקוויטין ליגאזות 36, גורמי שעתוק 37 וחלבוני ממברנה עם אחוזי הצלחה גבוהים. לייצור חלבון ממברנה, אנו מוסיפים ליפוזום שלפוחית שומנים לתערובת התרגום כפיגום19,38. תחומים הידרופוביים של חלבון ממברנה אינטראקציה עם bilayer שומנים והם משולבים באופן ספונטני עם ליפוזום. צנטריפוגה הדרגתית צפיפות משמשת להפרדת פרוטאוליפוזום מחלבוני חיטה אנדוגניים, למרות שצנטריפוגה נפוצה של תערובת תגובת התרגום מספיקה לטיהור פשוט של פרוטאוליפוזום20. סוגים רבים של חלבוני ממברנה אינטגרליים סונתזו באמצעות מערכת נטולת תאי חיטה ויושמו למחקרים ופיתוחים שונים 25,38,39,40,41,42,43,44. יתר על כן, פיתחנו את "שיטת דו-שכבתיות-דיאליזה" לייצור בקנה מידה גדולשל 45,46. בשיטה זו, מכשיר דיאליזה מסוג שקוע במאגר הזנת המצע, ושתי שכבות של תערובת תגובת תרגום ומאגר הזנת מצע נוצרות בכוס כפי שמוצג באיור 1. אספקה רציפה של מצעים והסרה של תוצר הלוואי יכולים להתבצע ביעילות הן בחלק העליון והן בחלק התחתון של תערובת התגובה במשך זמן רב, מה שמוביל ליעילות תרגום מצוינת (איור 2A ואיור 2B)45.

Protocol

1. הכנת פלסמיד ביטוי pEU

הערה: פלסמיד ביטוי pEU צריך לכלול קודון התחלה, מסגרת קריאה פתוחה של חלבון קרום המטרה וקודון עצירה במקטע (ראו איור 1). הוסף רצפי תגי זיהוי/טיהור במיקום המתאים בעת הצורך. עיכול אנזים הגבלה או שיבוט חלק חלים על תת-שבט. כאן אנו מתארים פרוטוקול בשיטת שיבוט חלקה.

  1. הכן להוסיף מקטע DNA.
    1. הגבר את הגן המעניין על ידי PCR באמצעות תבנית cDNA, פריימר 1 ופריימר 2. פריימר 1 ופריימר 2 מכילים חפיפה של 15 bp לשיבוט חלק, בהתאמה (ראו טבלת חומרים).
      הערה: אין לכלול רצפים שיש לעבד ולהסיר מחלבון בוגר בתאים (לדוגמה, רצף אותות). עיבוד של חלבון מסונתז אינו מבוצע במערכת נטולת תאי חיטה. אל תוסיף רצף קוזאק. לווקטור pEU-E01-MCS יש משפר תרגום E01.
    2. הוסף 1/25 נפח של אנזים הגבלת DpnI למוצר PCR כדי להסיר DNA פלסמיד תבניתי. דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
    3. השתמש בערכת טיהור PCR כדי לטהר את מוצר ה-PCR ולהתאים את הריכוז ב-20-50 ננוגרם/מיקרון-ליטר.
  2. וקטור pEU-E01-MCS ליניארי.
    1. בצע PCR הפוך באמצעות pEU-E01-MCS, פריימר 3 ופריימר 4.
    2. הוסף 1/25 נפח של אנזים הגבלת DpnI למוצר PCR ההופכי. דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
    3. השתמש בערכת טיהור PCR כדי לטהר את מוצר ה-PCR בהתאם להמלצת היצרן. כוונן את הריכוז ב-20-50 ננוגרם/מיקרון-ליטר.
  3. מערבבים 2 μL של מקטע DNA מכניס, 2 μL של וקטור ליניארי, ו-4 μL של תערובת אנזימי שיבוט חלקה פי 2.
  4. הפוך את זן Escherichia coli JM109 עם מוצר השיבוט החלק. באמצעות מפזר, מורחים את תרחיף החיידקים על צלחת אגר LB-אמפיצילין.
    הערה: לווקטור pEU יש סמן התנגדות לאמפיצילין.
  5. אשר את רצף הביטוי פלסמיד שנבנה באמצעות פריימר 5 ופריימר 6 מהצד 5' ו- 3' של MCS בפלסמיד pEU, בהתאמה.
  6. להגביר ולטהר את הביטוי פלסמידים.
    1. תרבית את זן E. coli JM109 שעבר טרנספורמציה פלסמידית ב-150 מ"ל של LB-אמפיצילין בינוני בטמפרטורה של 37°C ו-125 פעימות לדקה רעד במהלך הלילה.
    2. חלץ וטהר את הפלסמידים באמצעות ערכת מידי להכנת פלסמידים הזמינה מסחרית. המסת פלסמידים ב-500 μL של מאגר TE.
      אזהרה: אין להשתמש בערכת הכנה קטנה לשאיבת פלסמיד. זה לא מספק מספיק איכות וכמות של פלסמיד.
    3. הוסף 500 μL של פנול/כלורופורם/איזואמיל אלכוהול (25:24:1). מערבבים במרץ במשך 5 דקות, וצנטריפוגה במשך 5 דקות בטמפרטורה של 17,800 x גרם וטמפרטורת החדר. מעבירים את תמיסת הפלסמיד העליונה לצינור חדש.
      אזהרה: יש ללבוש כפפות חד פעמיות כדי להגן על העור מפני פנול וכלורופורם.
      הערה: על מנת להסיר זיהום של RNase מתוך ערכת מיצוי פלסמיד, לטהר את הפלסמידים באמצעות טיהור פנול-כלורופורם.
    4. יש להוסיף 500 μL של כלורופורם כדי להסיר פנול לחלוטין. מערבבים במרץ במשך 5 דקות, וצנטריפוגה במשך 5 דקות בטמפרטורה של 17,800 x גרם וטמפרטורת החדר. מעבירים את תמיסת הפלסמיד העליונה לצינור חדש.
    5. הוסיפו 2.5 נפח של אתנול ו-1/8 נפח של 7.5 M אמוניום אצטט, ואחסנו בטמפרטורה של -30 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
    6. צנטריפוגה ב-17,800 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לשטוף את הכדור עם 500 μL של 70% אתנול. מוציאים את הסופר-נאטנט בזהירות ומשאירים את הכדור למשך 5 דקות לייבוש.
    7. ממיסים את פלסמידי הביטוי ב-100 μL של מים אולטרה-טהורים לחלוטין. למדוד את הריכוז של פלסמידים עם ספיגה ב 260 ננומטר. התאימו את הריכוז ל-1 מ"ג/מ"ל.

2. תמלול במבחנה

אזהרה: השתמש בצינורות וטיפים מפלסטיק ללא נוקלאז ו-DNase בשלבים של תמלול ותרגום. הימנע autoclaving מרכולת פלסטיק כדי למנוע זיהום.

  1. קציר מים אולטרה-טהורים בצינור פלסטיק חדש.
    אזהרה: אין להשתמש במים שטופלו ב-DEPC מכיוון ששאריות DEPC מעכבות מאוד את התגובה. השתמש במים אולטרה-פוריים מטוהרים טריים לתמלול ותרגום.
  2. הכן את תערובת תגובת השעתוק על ידי ערבוב 115.2 μL של מים אולטרה-פוריים, 40 μL של Transcription Buffer LM, 20 μL של תערובת NTP, 2.4 μL של 80 מעכבי U/μL RNase, 2.4 μL של 80 U/μL SP6 פולימראז, ו-20 μL של פלסמידי ביטוי pEU של 1 מ"ג/מ"ל. ערבבו את הריאגנטים בעדינות על ידי היפוך. בצע סיבוב מהיר.
  3. לדגום את תגובת השעתוק ב-37 מעלות צלזיוס למשך 6 שעות.
  4. ערבבו את התגובה בעדינות על ידי היפוך והסתחררו במהירות. השתמש בו מיד לתרגום, אחרת להקפיא ולאחסן ב -80 °C.
  5. אשר את מוצר התמלול על ידי אלקטרופורזה.
    1. מערבבים 100 מ"ל של 1x חיץ TAE ו 1 גרם של agarose. מחממים את המתלה בתנור מיקרוגל להכנת 1% ג'ל TAE agarose.
    2. קח 1 μL של תגובת שעתוק וערבב עם 3 μL של מים ו 4 μL של 2x צבע טעינה.
      הערה: אין צורך בפירוק RNA.
    3. טען 4 μL של התערובת ו 2 μL של סמן סולם DNA לג'ל TAE agarose.
    4. אלקטרופורז ב-100 וולט למשך 20 דקות.
    5. הכתימו את הג'ל באתידיום ברומיד למשך 30 דקות. בדוק את תבנית רצועת הסולם של mRNA באמצעות טרנסילומינטור UV ותמונת ג'ל.
      הערה: כאשר נצפתה רצועה מרוחה של פחות מ-500 bp, קיים חשד לירידה ב-mRNA.

3. הכנת חומרים לתרגום

  1. הכן את מאגר התרגום.
    1. יש לערבב 27 מ"ל של מים אולטרה-פוריים טריים ו-0.75 מ"ל מכל תמיסת מלאי של 40x עבור S1, S2, S3 ו-S4, בהתאמה, בצינור של 50 מ"ל.
      הערה: ווסת את כמויות החומרים בהתאם לכמות הסופית הנדרשת של מאגר תרגום 1x.
      אזהרה: אין לאחסן או להקפיא מחדש את מאגר התרגום העודף של 1x לאחר השימוש.
  2. הכינו תמיסת מלאי קריאטין קינאז. יש להמיס קריאטין קינאז שעבר ליאופיליזציה במים אולטרה-פוריים עד לריכוז סופי של 20 מ"ג/מ"ל. חלק את התמיסה בכמויות קטנות (10 עד 50 מיקרון כל אחת) בצינורות PCR של 0.2 מ"ל עם 8 רצועות. מקפיאים את הצינורות בחנקן נוזלי, ומאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    אזהרה: אין להקפיא מחדש את תמיסת קריאטין קינאז לאחר ההפשרה.
  3. יש לשטוף כוסות דיאליזה (בגודל 0.1 מ"ל) כדי להסיר את הגליצרול מממברנת הדיאליזה.
    הערה: ישנן מספר כוסות דיאליזה בגדלים שונים. כוסות קטנות (0.1 מ"ל) משמשות לבדיקה בקנה מידה קטן (סעיף 5.4), וכוסות גדולות (2 מ"ל) לייצור בקנה מידה גדול (סעיף 5.5), בהתאמה. ניתן להימנע משלב השטיפה של קרום הדיאליזה של כוסות גדולות.
    1. הכניסו 1 מ"ל של מים אולטרה-טהורים לצינור חדש של 1.5 מ"ל. יש להכניס דיאליזה בגודל קטן (0.1 מ"ל) לצינור. הוסיפו 0.5 מ"ל מים אולטרה-טהורים לכוס.
    2. לדגור במשך יותר מ -30 דקות בטמפרטורת החדר.

4. הכנת ליפוזומים

הערה: כאן אנו מתארים שני פרוטוקולים להכנת ליפוזומים. האחד משתמש בליפוזומים ליופיליים מוכנים לשימוש (סעיף 4.1), ואילו השני מייצר ליפוזומים על ידי הידרציה של שכבת שומנים דקה (סעיף 4.2).

  1. הכינו ליפוזומים באמצעות ליפוזומים ליופיליים.
    הערה: דרך קלה יותר לייצר פרוטאוליפוזום היא להשתמש בליפוזום אזולקטין זמין מסחרית. אזולקטין הוא סוג של שומנים טבעיים המופקים מפולי סויה.
    1. פתח את הבקבוקון המכיל 10 מ"ג של ליפוזומי אסולקטין ליופיליים (ראה טבלת חומרים) והוסף 200 μL של מאגר תרגום (סעיף 3.1) לתחתית הבקבוקון. אוטמים את הבקבוקון ודוגרים למשך 10 דקות.
    2. מערבבים במרץ על ידי הנחת הבקבוקון על מערבל המערבולת למשך דקה אחת.
    3. הכנס את הבקבוקון לתוך צינור 50 מ"ל. סובב את הצינור על ידי צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך דקה אחת.
    4. באמצעות פיפטה, העבירו את מתלה הליפוזום של אסולקטין (50 מ"ג ליפיד/מ"ל) לצינור חדש של 1.5 מ"ל. יש להשתמש בליפוזום באופן מיידי לתרגום, אחרת להקפיא בחנקן נוזלי ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  2. הכן ליפוזומים על ידי לחות סרט שומנים דק.
    1. אם השומנים נמכרים בצורת אבקה, יש להמיס בכלורופורם או בממס אורגני מתאים לריכוז של 10-100 מ"ג/מ"ל.
      הערה: ניתן להכין שכבת שומנים דקה באמצעות ליפידים אמפיפיליים מטוהרים ו/או מסונתזים. שיטת הטיהור של אזולקטין מתוארת קודםלכן 38. ניתן להוסיף לליפידים שעברו שינוי פונקציונלי, כגון ליפידים שעברו ביוטינילציה, ליפידים פלואורסצנטיים וליפידים אדג'ובנטיים, כדי לייצר ליפוזומים פונקציונליים.
    2. מעבירים את תמיסת השומנים המכילה 50 מ"ג של שומנים לבקבוק אידוי.
    3. באמצעות מאייד סיבובי, להתאדות ממס באופן שווה לפזר את השומנים על הקיר של תחתית הבקבוק כדי ליצור סרט דק של שומנים.
    4. שים את הבקבוק ב desiccator ואקום ולהשאיר תחת לחץ שלילי לילה כדי להסיר את הממס לחלוטין.
    5. הוסף 1 מ"ל של מאגר תרגום לבקבוק האידוי. סובבו את הבקבוקון כדי לפזר את החיץ על סרט השומנים הדק. דגירה במשך 5 דקות כדי לחות את הסרט.
    6. סוניקטור את הבקבוקון עם הומוגנייזר קולי או מנקה קולי. שנה את זווית הבקבוקון מדי פעם כדי לאפשר לפתרון לגעת היטב בסרט. ודא כי הסרט השומנים הדק הוא מקולף מלמטה ומתחלב לחלוטין הומוגני.
      הערה: מיקרוגרף אלקטרונים של ליפידים שעברו ביוטינילציה המכילים ליפוזומים מוצג באיור 1.
    7. העבירו את מתלי הליפוזום (50 מ"ג ליפידים/מ"ל) לצינור חדש של 1.5 מ"ל. אם אין להשתמש בו מיד, מקפיאים את הליפוזומים בחנקן נוזלי, ומאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

5. תרגום חוץ גופי

  1. הפשירו את תמצית נבט החיטה במהירות על ידי הצפת הצינורות על המים בטמפרטורת החדר למשך מספר דקות. לאחר ההפשרה, יש לערבב מיד בעדינות על ידי היפוך הצינורות, להסתובב ולצנן על קרח עד לשימוש.
    הערה: יש להקפיא את תמצית נבט החיטה בחנקן נוזלי לאחר השימוש, ולאחסן בטמפרטורה של -80°C. הוא עומד במספר מחזורי הקפאה/הפשרה.
  2. הפשרה של 20 מ"ג/מ"ל תמיסת מלאי קריאטין קינאז. יש לערבב 5 μL של תמיסת מלאי ו-45 μL של מאגר תרגום כדי להכין תמיסת עבודה של קריאטין קינאז במינון 2 מ"ג/מ"ל.
    אזהרה: לא מומלץ להקפיא מחדש קריאטין קינאז.
  3. הפשרת ליפוזומים או mRNA בעת הצורך.
  4. בצע תרגום חלבונים בקנה מידה קטן.
    1. יש להוציא מים הן מהצינור והן מכוס הדיאליזה (0.1 מ"ל), כפי שהוכן בשלב 3.3.2.
    2. להזריק 1 מ"ל ו 300 μL של מאגר תרגום בצינור ואת הדיאליזה, בהתאמה.
      אזהרה: במקרה שתחתית הדיאליזה אינה מגיעה לפני השטח של מאגר התרגום בצינור 1.5 מ"ל, יש להזריק חיץ נוסף של 50-100 מיקרון לצינור.
    3. הכינו תערובת תגובת תרגום על ידי ערבוב של 15.6 μL של מאגר תרגום, 2.4 μL של 2 מ"ג/מ"ל קריאטין קינאז, 12 μL של 50 מ"ג/מ"ל ליפוזומים, 15 μL של תמצית נבט חיטה, ו-15 μL של mRNA. מערבבים בעדינות על ידי היפוך הצינורות, ומסתובבים כלפי מטה.
    4. שאפו 60 μL של תערובת תגובת התרגום באמצעות פיפטה של 200 μL.
    5. הכנס את קצה הפיפטה לתוך החלק התחתון של מאגר התרגום בכוס הדיאליזה. לפלוט את תערובת התגובה לאט ובעדינות. מכסים את הדיאליזה במכסה למניעת אידוי.
      הערה: תערובת התגובה שוקעת באופן טבעי לתחתית הכוס ויוצרת דו-שכבתי. אין להפריע לדו-שכבתי על ידי ערבוב או ניעור הכוס.
  5. ערכו תרגום בקנה מידה גדול (איור 1).
    1. יוצקים 22 מ"ל של מאגר תרגום לתוך צינור 25 מ"ל. הכנס דיאליזה גדולה (2 מ"ל) לתוך הצינור והוסף 2 מ"ל של מאגר תרגום בכוס.
    2. הכינו תערובת תגובת תרגום על ידי ערבוב של 130 μL של מאגר תרגום, 20 μL של 2 מ"ג/מ"ל קריאטין קינאז, 100 μL של 50 מ"ג/מ"ל ליפוזום, 125 μL של תמצית נבט חיטה, ו-125 μL של mRNA. מערבבים בעדינות על ידי פיפטציה.
    3. שאפו את כל תערובת תגובת התרגום (500 μL) באמצעות פיפטה של 1,000 μL. להזריק תערובת תגובת תרגום לכוס הדיאליזה באותו אופן כמתואר בשלב 5.4.5. יש לכסות את הדיאליזה במכסה למניעת אידוי.
  6. לדגור את התגובות ב 15 °C במשך 24 שעות.
  7. מערבבים היטב את התגובה בכוס הדיאליזה על ידי פיפטציה. מעבירים את מתלה הפרוטאוליפוזום הגולמי לצינור חדש.
    הערה: מומלץ להשתמש בצינור שטוח של 1.5 מ"ל כדי לאסוף את הפרוטאוליפוזום מהתרגום בקנה מידה קטן. לאחר צנטריפוגה, ליפוזומים יוצרים גלולה קומפקטית וגלויה בקלות בפינה התחתונה של הצינור.

6. טיהור פרוטאוליפוזומים

  1. צנטריפוגה הצינור המכיל מתלה פרוטאוליפוזום גולמי ב 17,800 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
  2. הסר את הסופרנטנט. השהה את כדור הפרוטאוליפוזום ב- PBS (בקנה מידה קטן: 1 מ"ל, בקנה מידה גדול: 10 מ"ל) על ידי פיפט.
  3. חזור על צנטריפוגה ושטיפה של פרוטאוליפוזומים במשך שני עיגולים נוספים.
  4. לאחר הכביסה, להוסיף כמות קטנה של PBS ולהשעות מחדש גלולה פרוטאוליפוזום היטב על ידי פיפטינג. למדוד את נפח ההשעיה באמצעות מיקרו פיפטה. הוסף PBS כדי להתאים את עוצמת הקול ל- 60 μL (קנה מידה קטן) או 500 μL (בקנה מידה גדול). העבר את המתלים לצינור חדש של 1.5 מ"ל.
  5. העבר 10 μL של מתלה פרוטאוליפוזום לצינור PCR חדש עבור SDS-PAGE. חלקו את שאר הדגימות למנות קטנות יותר לשימוש בעת הצורך. מקפיאים בחנקן נוזלי ומאחסנים ב-80°C-.

7. מכתים של עמודי SDS ו-CBB

  1. הוסף 70 μL של מים ו- 40 μL של 3x SDS-PAGE מאגר לדוגמה ל- 10 μL של תרחיף פרוטאוליפוזום.
    אזהרה: אין להרתיח את דגימת ה-SDS-PAGE, כפי שמצטברים חלבוני הממברנה, וכמעט שאינו חודר לג'ל אקרילאמיד באלקטרופורזה. כמו כן, הוסף מספיק חומר מחזר למאגר הדגימה של SDS-PAGE (לדוגמה, 2-mercaptoethanol בריכוז סופי של 3%) כדי למנוע חמצון.
  2. הגדר ג'ל SDS-PAGE הדרגתי של 5%-20% בתא אלקטרופורזה. טען 3 μL, 6 μL, 12 μL של דגימות פרוטאוליפוזומים, 2 μL של סמן גודל חלבון, וסדרות סטנדרטיות BSA גם כן.
  3. אלקטרופורזה ב-52 mA, 400 וולט למשך 30 דקות.
  4. להכתים את הג'ל עם צבע CBB במשך שעה אחת. יש לטשטש צבע במים חמים ולסרוק את תמונת הג'ל.
  5. באמצעות תוכנת NIH Image J (https://imagej.nih.gov/ij/), ניתן לכמת את עוצמת הפסים של חלבון הממברנה בכל נתיב. הערך את כמות חלבוני הממברנה המסונתזים באמצעות סדרות BSA סטנדרטיות.

תוצאות

באמצעות פרוטוקול זה ניתן להשיג פרוטאוליפוזומים מטוהרים חלקית תוך זמן קצר. תוצאות מייצגות מוצגות באיור 2A. עשרים וחמישה GPCRs של Class A, B ו- C סונתזו בהצלחה בשיטת הדיאליזה הדו-שכבתית (בקנה מידה קטן) וטוהרו חלקית על ידי צנטריפוגה ושטיפת חיץ. למרות כמות חלבונים מסונתזים משתנה בהתאם ?...

Discussion

הפרוטוקול המוצג מספק שיטה לייצור חלבוני ממברנה בשיעור הצלחה גבוה. פרוטוקול זה הוא פשוט, ניתן לשחזור מאוד וקל להרחבה. יש לו גם פוטנציאל להפחית את הזמן והעלות של ניסויים הצורכים כמות גדולה של חלבוני ממברנה. שיטת דו-שכבת-דיאליזה משפרת את הפרודוקטיביות פי 4-10 בהשוואה לשיטת דו-שכבתי או שיטת דיאל...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי פרויקט פלטפורמה לתמיכה בגילוי תרופות ומחקר במדעי החיים (בסיס לתמיכה בגילוי תרופות חדשניות ומחקר במדעי החיים (BINDS)) מ- AMED תחת מענק מספר JP20am0101077. עבודה זו נתמכה חלקית גם על ידי JSPS KAKENHI מענק מספר 20K05709.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
×3 SDS-PAGE sample bufferContaining 10% 2-mercaptoethanol
5-20% gradient SDS-PAGE gelATTOE-D520L
70% ethanolDiluted ethanol by ultrapure water.
AgaroseTakara Bio
Ammonium acetateNakalai tesque02406-95As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30°C.
Ampicillin SodiumNakalai tesque02739-74
Asolectin Liposome, lyophilizedCellFree SciencesCFS-PLE-ASLA vial contains 10 mg of lyophilized liposomes.
BSA standard1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 µL ×1 SDS-PAGE sample buffer
CBB gel stain
cDNA clone of interestPlasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment
ChloroformNakalai tesque08402-84
Cooled incubatorTemperature ranging from 0 to 40 °C or wider.
Creatine kinaseRoche Diagnostics04524977190
Dialysis cup (0.1 mL)Thermo Fisher Scientific69570Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL
Dialysis cup (2 mL)Thermo Fisher Scientific88404Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL
DNA ladder markerThermo Fisher ScientificSM0311GeneRuler 1 kb DNA Ladder
DpnIThermo Fisher ScientificFD1703FastDigest DpnI
E. coli strain JM109
Electrophoresis chamberATTO
Ethanol (99.5%)Nakalai tesque14713-95
Ethidium bromide
Evaporation flask, 100 mL
Gel imager
Gel scannerWe use document scanner and LED immuninator as a substitute.
LB broth
Lipids of interestAvanti Polar Lipids
Micro centrifugeTOMYMX-307
NTP mixCellFree SciencesCFS-TSC-NTPMixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each
Nuclease-free 25 mL tubeIWAKI362-025-MYP
Nucrease-free plastic tubesWatson bio labsDo not autoclave. Use them separately from other experiments.
Nucrease-free tipsWatson bio labsDo not autoclave. Use them separately from other experiments.
PBS buffer
PCR purification kitMACHEREY-NAGEL740609NucleoSpin Gel and PCR Clean-up
pEU-E01-MCS vectorCellFree SciencesCFS-11
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)Nippon Gene311-90151
Plasmid prep Midi kitMACHEREY-NAGEL740410NucleoBond Xtra Midi
Primer 1Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthesis5’-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’
Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence.
Primer 2Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthesis5'-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’
Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence.
Primer 3Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthesis5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3'
Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.
Primer 4Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthesis5'-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3'
Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.
Primer 5Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthesis5’-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3’
Sequencing primer, forward
Primer 6Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthesis5’- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3’
Sequencing primer, reverse
Protein size markerBio-Rad1610394Precision Plus Protein Standard
Rotary evaporator
seamless cloning enzyme mixtureNew England BioLabsE2611LGibson Assembly Master Mix
Other seamless cloning reagents are also avairable.
SP6 RNA Polymerase & RNase InhibitorCellFree SciencesCFS-TSC-ENZ
Submarine Electrophoresis system
TAE buffer
Transcription Buffer LMCellFree SciencesCFS-TSC-5TB-LM
Translation bufferCellFree SciencesCFS-SUB-SGCSUB-AMIX SGC (×40) stock solution (S1, S2, S3, S4).
Prepare ×1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water.
Ultrapure waterWe recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave.
We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system.
Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle.
Ultrasonic homogenizerBransonSONIFIER model 450D-AdvancedUltrasonic cleaner can be used as a substitute.
UV transilluminator
Vacuum desiccator
Wheat germ extractCellFree SciencesCFS-WGE-7240WEPRO7240

References

  1. Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
  2. Gusach, A., et al. Beyond structure: emerging approaches to study GPCR dynamics. Current Opinion in Structural Biology. 63, 18-25 (2020).
  3. Congreve, M., de Graaf, C., Swain, N. A., Tate, C. G. Impact of GPCR Structures on Drug Discovery. Cell. 181 (1), 81-91 (2020).
  4. Wilkinson, T. C. I. Discovery of functional monoclonal antibodies targeting G-protein-coupled receptors and ion channels. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 831-837 (2016).
  5. Hino, T., Iwata, S., Murata, T. Generation of functional antibodies for mammalian membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 23 (4), 563-568 (2013).
  6. Webb, D. R., Handel, T. M., Kretz-Rommel, A., Stevens, R. C. Opportunities for functional selectivity in GPCR antibodies. Biochemical Pharmacology. 85 (2), 147-152 (2013).
  7. Douthwaite, J. A., Finch, D. K., Mustelin, T., Wilkinson, T. C. I. Development of therapeutic antibodies to G-protein coupled receptors and ion channels: Opportunities, challenges and their therapeutic potential in respiratory diseases. Pharmacology and Therapeutics. 169, 113-123 (2016).
  8. Hashimoto, Y., Yagi, K., Kondoh, M. Current progress in a second-generation claudin binder, anti-claudin antibody, for clinical applications. Drug Discovery Today. 21 (10), 1711-1718 (2016).
  9. Hutchings, C. J., Colussi, P., Clark, T. G. Ion channels as therapeutic antibody targets. mAbs. 11 (2), 265-296 (2019).
  10. Errey, J. C., Fiez-Vandal, C. Production of membrane proteins in industry: The example of GPCRs. Protein Expression and Purification. 169, 105569 (2020).
  11. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  12. Wiseman, D. N., et al. Expression and purification of recombinant G protein-coupled receptors: a review. Protein Expression and Purification. 167, 105524 (2020).
  13. Jeffery, C. J. Expression, Solubilization, and Purification of Bacterial Membrane Proteins. Current Protocols in Protein Science. 83 (1), 1-15 (2016).
  14. Spirin, A. S., Baranov, V. I., Ryabova, L. A., Ovodov, S. Y., Alakhov, Y. B. A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield. Science. 242 (4882), 1162-1164 (1988).
  15. Takai, K., Sawasaki, T., Endo, Y. Practical cell-free protein synthesis system using purified wheat embryos. Nature Protocols. 5 (2), 227-238 (2010).
  16. Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
  17. Shimizu, Y., Kuruma, Y., Ying, B. W., Umekage, S., Ueda, T. Cell-free translation systems for protein engineering. The FEBS Journal. 273 (18), 4133-4140 (2006).
  18. Klammt, C., et al. Cell-free expression as an emerging technique for the large scale production of integral membrane protein. The FEBS Journal. 273 (18), 4141-4153 (2006).
  19. Nozawa, A., et al. A cell-free translation and proteoliposome reconstitution system for functional analysis of plant solute transporters. Plant and Cell Physiology. 48 (12), 1815-1820 (2007).
  20. Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35-45 (2011).
  21. Henrich, E., Hein, C., Dotsch, V., Bernhard, F. Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates. FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).
  22. Henrich, E., Peetz, O., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife. 6, 243 (2017).
  23. Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins. Frontiers in Pharmacology. 10, 744 (2019).
  24. Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).
  25. Sackin, H., Nanazashvili, M., Makino, S. I. Direct injection of cell-free Kir1.1 protein into Xenopus oocytes replicates single-channel currents derived from Kir1.1 mRNA. Channels. 9 (4), 196-199 (2015).
  26. Zemella, A., Richter, T., Thoring, L., Kubick, S. A combined cell-free protein synthesis and fluorescence-based approach to investigate GPCR binding properties. Methods in Molecular Biology. 1947 (10), 57-77 (2019).
  27. Vaish, A., Guo, S., Murray, R. M., Grandsard, P. J., Chen, Q. On-chip membrane protein cell-free expression enables development of a direct binding assay: A curious case of potassium channel KcsA-Kv1.3. Analytical Biochemistry. 556, 70-77 (2018).
  28. Suzuki, Y., et al. Functional G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) synthesis: the pharmacological analysis of Human Histamine H1 Receptor (HRH1) synthesized by a wheat germ cell-free protein synthesis system combined with asolectin glycerosomes. Frontiers in Pharmacology. 9, 38 (2018).
  29. Cortes, S., Barette, C., Beroud, R., De Waard, M., Schaack, B. Functional characterization of cell-free expressed Kv1.3 channel using a voltage-sensitive fluorescent dye. Protein Expression and Purification. 145, 94-99 (2018).
  30. Woznicka-Misaila, A., Juillan-Binard, C., Baud, D., Pebay-Peyroula, E., Ravaud, S. Cell-free production, purification and characterization of human mitochondrial ADP/ATP carriers. Protein Expression and Purification. 144, 46-54 (2018).
  31. Hashimoto, Y., et al. Engineered membrane protein antigens successfully induce antibodies against extracellular regions of claudin-5. Scientific Reports. 8 (1), 8383 (2018).
  32. Sawasaki, T., et al. A bilayer cell-free protein synthesis system for high-throughput screening of gene products. FEBS Letters. 514 (1), 102-105 (2002).
  33. Goshima, N., et al. Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome. Nature Methods. 5 (12), 1011-1017 (2008).
  34. Nemoto, K., Takemori, N., Seki, M., Shinozaki, K., Sawasaki, T. Members of the plant CRK superfamily are capable of trans- and autophosphorylation of tyrosine residues. The Journal of Biological Chemistry. 290 (27), 16665-16677 (2015).
  35. Takeda, H., et al. Comparative analysis of human src-family kinase substrate specificity in vitro. Journal of Proteome Research. 9 (11), 5982-5993 (2010).
  36. Takahashi, H., et al. Establishment of a wheat cell-free synthesized protein array containing 250 human and mouse E3 ubiquitin ligases to identify novel interaction between E3 ligases and substrate proteins. PLoS One. 11 (6), 0156718 (2016).
  37. Nozawa, A., et al. Construction of a protein library of Arabidopsis transcription factors using a wheat cell-free protein production system and its application for DNA binding analysis. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (7), 1661-1664 (2009).
  38. Goren, M. A., Nozawa, A., Makino, S. I., Wrobel, R. L., Fox, B. G. Cell-free translation of integral membrane proteins into unilamelar liposomes. Methods in Enzymology. 463, 647-673 (2009).
  39. Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35 (2011).
  40. Renauld, S., et al. Functional reconstitution of cell-free synthesized purified Kv channels. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1859 (12), 2373-2380 (2017).
  41. Liu, S., et al. Efficiency and Safety of CRAC Inhibitors in Human Rheumatoid Arthritis Xenograft Models. Journal of Immunology. 199 (5), 1584-1595 (2017).
  42. Jarecki, B. W., Makino, S. I., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into xenopus oocytes. Scientific Reports. 3, 1-7 (2013).
  43. David, G., et al. Phosphorylation and alternative translation on wheat germ cell-free protein synthesis of the DHBV large envelope protein. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 138 (2019).
  44. Jirasko, V., et al. Proton-detected solid-state NMR of the cell-free synthesized α-helical transmembrane protein NS4B from hepatitis C virus. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 21 (10), 1453-1460 (2020).
  45. Takeda, H., et al. Production of monoclonal antibodies against GPCR using cell-free synthesized GPCR antigen and biotinylated liposome-based interaction assay. Scientific Reports. 5, 11333 (2015).
  46. Zhou, W., Takeda, H. Production of immunizing antigen proteoliposome using cell-free protein synthesis system. Methods in Molecular Biology. 1868, 49-67 (2018).
  47. Hutchings, C. J., Koglin, M., Marshall, F. H. Therapeutic antibodies directed at G protein-coupled receptors. mAbs. 2 (6), 594-606 (2010).
  48. Raetz, C. R. H., et al. Discovery of new biosynthetic pathways: the lipid A story. Journal of Lipid Research. 50, 103-108 (2009).
  49. Baldridge, J. R., Crane, R. T. Monophosphoryl lipid A (MPL) formulations for the next generation of vaccines. Methods. 19 (1), 103-107 (1999).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

163GPCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved