Produção Livre de Células de Proteolipossomas para Análise Funcional e Desenvolvimento de Anticorpos Visando Proteínas de Membrana

Resumo

Este protocolo descreve um método eficiente livre de células para a produção de proteolipossomo de alta qualidade pelo método de diálise de duas camadas usando sistema livre de células de trigo e lipossomas. Este método fornece meios adequados para a análise funcional de proteínas de membrana, triagem de alvos de drogas e desenvolvimento de anticorpos.

Resumo

As proteínas de membrana desempenham papéis essenciais em uma variedade de processos celulares e desempenham funções vitais. As proteínas de membrana são clinicamente importantes na descoberta de medicamentos porque são os alvos de mais da metade de todos os medicamentos. Um obstáculo para a realização de estudos bioquímicos, biofísicos e estruturais de proteínas de membrana, bem como o desenvolvimento de anticorpos, tem sido a dificuldade em produzir grandes quantidades de proteína de membrana de alta qualidade com conformação e atividade corretas. Aqui descrevemos um "método de diálise de bicamadas" usando um sistema livre de células germinativas de trigo, lipossomas e copos de diálise para sintetizar eficientemente proteínas de membrana e preparar proteolipossomos purificados em um curto espaço de tempo com uma alta taxa de sucesso. As proteínas de membrana podem ser produzidas tanto quanto em vários miligramas, como GPCRs, canais iônicos, transportadores e tetraspaninas. Este método livre de células contribui para reduzir o tempo, o custo e o esforço para a preparação de proteolipossomas de alta qualidade e fornece meios adequados para a análise funcional de proteínas de membrana, triagem de alvos de drogas e desenvolvimento de anticorpos.

Introdução

As proteínas de membrana são um dos alvos mais importantes da droga no diagnóstico e terapêutica. De fato, metade dos pequenos alvos de drogas compostas são proteínas de membrana, como receptores acoplados à proteína G (GPCRs) e canais iônicos¹. Ao longo dos anos, pesquisadores vêm trabalhando em estudos bioquímicos, biofísicos e estruturais de proteínas de membrana para elucidar sua estrutura e função ^2,3. O desenvolvimento de anticorpos monoclonais contra proteínas de membrana também é realizado ativamente, a fim de acelerar estudos funcionais e estruturais e desenvolver aplicações

Protocolo

1. Preparação do plasmídeo de expressão pEU

NOTA: o plasmídeo de expressão pEU deve incluir o códon inicial, o quadro de leitura aberto da proteína de membrana alvo e o códon de paragem no fragmento (ver Figura 1). Adicione sequência(s) de etiqueta(s) de detecção/purificação na posição apropriada, quando necessário. A digestão enzimática de restrição ou a clonagem sem costura são aplicáveis à subclonagem. Aqui descrevemos um protocolo usando um método de clonagem contínuo.

1. Prepare inserir fragmento de DNA.
   1. Amplificar o gene de interesse por PCR usando o modelo de cDNA, primer 1 e primer 2. O pr....

Resultados

Usando este protocolo, proteolipossomas parcialmente purificados podem ser obtidos em um curto espaço de tempo. Os resultados representativos são apresentados na Figura 2A. Vinte e cinco GPCRs de Classe A, B e C foram sintetizados com sucesso usando o método de diálise de bicamádas (pequena escala) e parcialmente purificados por centrifugação e lavagem tampão. Embora a quantidade de proteínas sintetizadas varie de acordo com o tipo de proteína, 50 a 400 μg de proteínas de membran.......

Discussão

O protocolo apresentado fornece um método de produção de proteínas de membrana a uma alta taxa de sucesso. Este protocolo é simples, altamente reprodutível e fácil de ampliar. Também tem o potencial de reduzir o tempo e o custo de experimentos que consomem uma grande quantidade de proteínas de membrana. O método bicamada-diálise melhora a produtividade em 4–10 vezes em comparação com o método bicamada ou método de diálise (Figura 2B)⁴⁵. Em um caso ex.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
×3 SDS-PAGE sample buffer			Containing 10% 2-mercaptoethanol
5-20% gradient SDS-PAGE gel	ATTO	E-D520L
70% ethanol			Diluted ethanol by ultrapure water.
Agarose	Takara Bio
Ammonium acetate	Nakalai tesque	02406-95	As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30°C.
Ampicillin Sodium	Nakalai tesque	02739-74
Asolectin Liposome, lyophilized	CellFree Sciences	CFS-PLE-ASL	A vial contains 10 mg of lyophilized liposomes.
BSA standard			1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 µL ×1 SDS-PAGE sample buffer
CBB gel stain
cDNA clone of interest			Plasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment
Chloroform	Nakalai tesque	08402-84
Cooled incubator			Temperature ranging from 0 to 40 °C or wider.
Creatine kinase	Roche Diagnostics	04524977190
Dialysis cup (0.1 mL)	Thermo Fisher Scientific	69570	Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL
Dialysis cup (2 mL)	Thermo Fisher Scientific	88404	Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL
DNA ladder marker	Thermo Fisher Scientific	SM0311	GeneRuler 1 kb DNA Ladder
DpnI	Thermo Fisher Scientific	FD1703	FastDigest DpnI
E. coli strain JM109
Electrophoresis chamber	ATTO
Ethanol (99.5%)	Nakalai tesque	14713-95
Ethidium bromide
Evaporation flask, 100 mL
Gel imager
Gel scanner			We use document scanner and LED immuninator as a substitute.
LB broth
Lipids of interest	Avanti Polar Lipids
Micro centrifuge	TOMY	MX-307
NTP mix	CellFree Sciences	CFS-TSC-NTP	Mixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each
Nuclease-free 25 mL tube	IWAKI	362-025-MYP
Nucrease-free plastic tubes	Watson bio labs		Do not autoclave. Use them separately from other experiments.
Nucrease-free tips	Watson bio labs		Do not autoclave. Use them separately from other experiments.
PBS buffer
PCR purification kit	MACHEREY-NAGEL	740609	NucleoSpin Gel and PCR Clean-up
pEU-E01-MCS vector	CellFree Sciences	CFS-11
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)	Nippon Gene	311-90151
Plasmid prep Midi kit	MACHEREY-NAGEL	740410	NucleoBond Xtra Midi
Primer 1	Thermo Fisher Scientific	Custom oligo synthesis	5’-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’ Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence.
Primer 2	Thermo Fisher Scientific	Custom oligo synthesis	5'-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’ Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence.
Primer 3	Thermo Fisher Scientific	Custom oligo synthesis	5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3' Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.
Primer 4	Thermo Fisher Scientific	Custom oligo synthesis	5'-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3' Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.
Primer 5	Thermo Fisher Scientific	Custom oligo synthesis	5’-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3’ Sequencing primer, forward
Primer 6	Thermo Fisher Scientific	Custom oligo synthesis	5’- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3’ Sequencing primer, reverse
Protein size marker	Bio-Rad	1610394	Precision Plus Protein Standard
Rotary evaporator
seamless cloning enzyme mixture	New England BioLabs	E2611L	Gibson Assembly Master Mix Other seamless cloning reagents are also avairable.
SP6 RNA Polymerase & RNase Inhibitor	CellFree Sciences	CFS-TSC-ENZ
Submarine Electrophoresis system
TAE buffer
Transcription Buffer LM	CellFree Sciences	CFS-TSC-5TB-LM
Translation buffer	CellFree Sciences	CFS-SUB-SGC	SUB-AMIX SGC (×40) stock solution (S1, S2, S3, S4). Prepare ×1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water.
Ultrapure water			We recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave. We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system. Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle.
Ultrasonic homogenizer	Branson	SONIFIER model 450D-Advanced	Ultrasonic cleaner can be used as a substitute.
UV transilluminator
Vacuum desiccator
Wheat germ extract	CellFree Sciences	CFS-WGE-7240	WEPRO7240