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Neste Artigo

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  • Protocolo
  • Resultados
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  • Referências
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Resumo

Este protocolo descreve um método eficiente livre de células para a produção de proteolipossomo de alta qualidade pelo método de diálise de duas camadas usando sistema livre de células de trigo e lipossomas. Este método fornece meios adequados para a análise funcional de proteínas de membrana, triagem de alvos de drogas e desenvolvimento de anticorpos.

Resumo

As proteínas de membrana desempenham papéis essenciais em uma variedade de processos celulares e desempenham funções vitais. As proteínas de membrana são clinicamente importantes na descoberta de medicamentos porque são os alvos de mais da metade de todos os medicamentos. Um obstáculo para a realização de estudos bioquímicos, biofísicos e estruturais de proteínas de membrana, bem como o desenvolvimento de anticorpos, tem sido a dificuldade em produzir grandes quantidades de proteína de membrana de alta qualidade com conformação e atividade corretas. Aqui descrevemos um "método de diálise de bicamadas" usando um sistema livre de células germinativas de trigo, lipossomas e copos de diálise para sintetizar eficientemente proteínas de membrana e preparar proteolipossomos purificados em um curto espaço de tempo com uma alta taxa de sucesso. As proteínas de membrana podem ser produzidas tanto quanto em vários miligramas, como GPCRs, canais iônicos, transportadores e tetraspaninas. Este método livre de células contribui para reduzir o tempo, o custo e o esforço para a preparação de proteolipossomas de alta qualidade e fornece meios adequados para a análise funcional de proteínas de membrana, triagem de alvos de drogas e desenvolvimento de anticorpos.

Introdução

As proteínas de membrana são um dos alvos mais importantes da droga no diagnóstico e terapêutica. De fato, metade dos pequenos alvos de drogas compostas são proteínas de membrana, como receptores acoplados à proteína G (GPCRs) e canais iônicos1. Ao longo dos anos, pesquisadores vêm trabalhando em estudos bioquímicos, biofísicos e estruturais de proteínas de membrana para elucidar sua estrutura e função 2,3. O desenvolvimento de anticorpos monoclonais contra proteínas de membrana também é realizado ativamente, a fim de acelerar estudos funcionais e estruturais e desenvolver aplicações

Protocolo

1. Preparação do plasmídeo de expressão pEU

NOTA: o plasmídeo de expressão pEU deve incluir o códon inicial, o quadro de leitura aberto da proteína de membrana alvo e o códon de paragem no fragmento (ver Figura 1). Adicione sequência(s) de etiqueta(s) de detecção/purificação na posição apropriada, quando necessário. A digestão enzimática de restrição ou a clonagem sem costura são aplicáveis à subclonagem. Aqui descrevemos um protocolo usando um método de clonagem contínuo.

  1. Prepare inserir fragmento de DNA.
    1. Amplificar o gene de interesse por PCR usando o modelo de cDNA, primer 1 e primer 2. O pr....

Resultados

Usando este protocolo, proteolipossomas parcialmente purificados podem ser obtidos em um curto espaço de tempo. Os resultados representativos são apresentados na Figura 2A. Vinte e cinco GPCRs de Classe A, B e C foram sintetizados com sucesso usando o método de diálise de bicamádas (pequena escala) e parcialmente purificados por centrifugação e lavagem tampão. Embora a quantidade de proteínas sintetizadas varie de acordo com o tipo de proteína, 50 a 400 μg de proteínas de membran.......

Discussão

O protocolo apresentado fornece um método de produção de proteínas de membrana a uma alta taxa de sucesso. Este protocolo é simples, altamente reprodutível e fácil de ampliar. Também tem o potencial de reduzir o tempo e o custo de experimentos que consomem uma grande quantidade de proteínas de membrana. O método bicamada-diálise melhora a produtividade em 4–10 vezes em comparação com o método bicamada ou método de diálise (Figura 2B)45. Em um caso ex.......

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pelo Projeto de Plataforma para Apoio à Descoberta de Medicamentos e Pesquisa em Ciências da Vida (Base para Apoiar a Descoberta Inovadora de Medicamentos e Pesquisa em Ciências da Vida (BINDS)) da AMED sob o Número de Concessão JP20am0101077. Este trabalho também foi parcialmente apoiado pelo JSPS KAKENHI Grant Number 20K05709.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
×3 SDS-PAGE sample bufferContaining 10% 2-mercaptoethanol
5-20% gradient SDS-PAGE gelATTOE-D520L
70% ethanolDiluted ethanol by ultrapure water.
AgaroseTakara Bio
Ammonium acetateNakalai tesque02406-95As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30°C.
Ampicillin SodiumNakalai tesque02739-74
Asolectin Liposome, lyophilizedCellFree SciencesCFS-PLE-ASLA vial contains 10 mg of lyophilized liposomes.
BSA standard1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 µL ×1 SDS-PAGE sample buffer
CBB gel stain
cDNA clone of interestPlasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment
ChloroformNakalai tesque08402-84
Cooled incubatorTemperature ranging from 0 to 40 °C or wider.
Creatine kinaseRoche Diagnostics04524977190
Dialysis cup (0.1 mL)Thermo Fisher Scientific69570Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL
Dialysis cup (2 mL)Thermo Fisher Scientific88404Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL
DNA ladder markerThermo Fisher ScientificSM0311GeneRuler 1 kb DNA Ladder
DpnIThermo Fisher ScientificFD1703FastDigest DpnI
E. coli strain JM109
Electrophoresis chamberATTO
Ethanol (99.5%)Nakalai tesque14713-95
Ethidium bromide
Evaporation flask, 100 mL
Gel imager
Gel scannerWe use document scanner and LED immuninator as a substitute.
LB broth
Lipids of interestAvanti Polar Lipids
Micro centrifugeTOMYMX-307
NTP mixCellFree SciencesCFS-TSC-NTPMixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each
Nuclease-free 25 mL tubeIWAKI362-025-MYP
Nucrease-free plastic tubesWatson bio labsDo not autoclave. Use them separately from other experiments.
Nucrease-free tipsWatson bio labsDo not autoclave. Use them separately from other experiments.
PBS buffer
PCR purification kitMACHEREY-NAGEL740609NucleoSpin Gel and PCR Clean-up
pEU-E01-MCS vectorCellFree SciencesCFS-11
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)Nippon Gene311-90151
Plasmid prep Midi kitMACHEREY-NAGEL740410NucleoBond Xtra Midi
Primer 1Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthesis5’-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’
Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence.
Primer 2Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthesis5'-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’
Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence.
Primer 3Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthesis5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3'
Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.
Primer 4Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthesis5'-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3'
Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.
Primer 5Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthesis5’-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3’
Sequencing primer, forward
Primer 6Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthesis5’- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3’
Sequencing primer, reverse
Protein size markerBio-Rad1610394Precision Plus Protein Standard
Rotary evaporator
seamless cloning enzyme mixtureNew England BioLabsE2611LGibson Assembly Master Mix
Other seamless cloning reagents are also avairable.
SP6 RNA Polymerase & RNase InhibitorCellFree SciencesCFS-TSC-ENZ
Submarine Electrophoresis system
TAE buffer
Transcription Buffer LMCellFree SciencesCFS-TSC-5TB-LM
Translation bufferCellFree SciencesCFS-SUB-SGCSUB-AMIX SGC (×40) stock solution (S1, S2, S3, S4).
Prepare ×1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water.
Ultrapure waterWe recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave.
We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system.
Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle.
Ultrasonic homogenizerBransonSONIFIER model 450D-AdvancedUltrasonic cleaner can be used as a substitute.
UV transilluminator
Vacuum desiccator
Wheat germ extractCellFree SciencesCFS-WGE-7240WEPRO7240

Referências

  1. Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
  2. Gusach, A., et al. Beyond structure: emerging approaches to study GPCR dynamics. Current Op....

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