إعادة برمجة مباشرة من الخلايا الليفية البشرية في Myoblasts للتحقيق في العلاجات للاضطرابات العصبية العضلية

Summary

يصف هذا البروتوكول تحويل الخلايا الليفية الجلدية إلى خلايا myoblasts وتمايزها إلى ميوتوب. وتستمد خطوط الخلية من المرضى الذين يعانون من اضطرابات عصبية عضلية ويمكن استخدامها للتحقيق في الآليات المرضية واختبار الاستراتيجيات العلاجية.

Abstract

وقد أعاقت التحقيقات في كل من علم الفيزيولوجيا المرضية والأهداف العلاجية في dystrophies العضلات القدرة التكاثرية المحدودة من myoblasts الإنسان. وقد تم إنشاء عدة نماذج الماوس لكنها إما لا تمثل حقا فيزيولوجيا المرض البشري أو لا تمثل الطيف الواسع من الطفرات الموجودة في البشر. تخليد myoblasts الإنسان الأساسي هو بديل لهذا القيد; ومع ذلك، فإنه لا يزال يعتمد على خزعات العضلات، والتي هي الغازية وليس من السهل المتاحة. في المقابل، خزعات الجلد هي أسهل للحصول على وأقل الغازية للمرضى. يمكن تخليد الخلايا الليفية المشتقة من خزعات الجلد وتمايزها في الخلايا العضلية ، مما يوفر مصدرًا للخلايا ذات الإمكانات الميوجينية الممتازة. هنا ، ونحن وصف سريع وطريقة إعادة برمجة مباشرة من الخلايا الليفية في النسب ميوجيني. يتم نقل الخلايا الليفية مع اثنين من الفيروسات العدسية: hTERT لتخليد الثقافة الأولية و MYODtet-inducible ، والتي عند إضافة doxycycline ، تحفز على تحويل الخلايا الليفية إلى myoblasts ثم تنضج myotubes ، والتي تعبر عن علامات التمايز المتأخر. يمثل هذا البروتوكول السريع للتمايز أداة قوية للتحقيق في الآليات المرضية والتحقيق في العلاجات الحيوية المبتكرة المستندة إلى الجينات أو الأدوية للاضطرابات العصبية العضلية.

Introduction

النماذج الخلوية التي تم الحصول عليها مباشرة من الأنسجة البشرية مفيدة في نمين العديد من الاضطرابات الوراثية البشرية ، مع ميزة وجود السياق الجيني الأصلي ، وفي كثير من الحالات ، استنساخ نفس السمات الجزيئية والخلوية التي لوحظت في المرضى. في مجال الاضطرابات العصبية العضلية ، كانت خزعات العضلات مصدرًا كبيرًا للعضات العضلية البشرية وساعدت في توضيح الآليات المرضية. بالإضافة إلى ذلك، فهي أداة هامة لاختبار في الجسم الحي من الأدوية والعلاجات الجينية. من ناحية ، اشتقاق myoblasts من شظايا العضلات من السهل نسبيا. من ناحية أخرى ، فإن ثقافة وصيانة myoblasts الأولية هي صعبة ، وذلك بسبب معدل انتشارها المحدود وssescence تكرار في المختبر^1. بديل لهذه القيود هو تخليد myoblasts مع إدخال التيلوميراز البشري(hTERT)و / أو كيناز cyclin تعتمد 4(CDK4)الجينات^2,3, مع الحفاظ على ملامح العضلات الهيكل العظمى⁴. ومع ذلك ، فإن منبع myoblasts الأولية لا يزال يعتمد على خزعة العضلات ، وهو إجراء جراحي مع مساوئ للمرضى ، والتي ، في كثير من الحالات ، وعضلاتها في انحطاط المتقدمة. وهكذا، والعضلات من هؤلاء المرضى يتكون من نسبة كبيرة من الأنسجة الدهنية وتليفي و/ أو، وغلة خلايا العضلات أقل، مما يتطلب تنقية الخلايا سابقا إلى تخليد.

على النقيض من خزعات العضلات ، فإن خزعات الجلد أكثر سهولة وأقل ضررًا للمرضى. يمكن أن تستمد الخلايا الليفية الأولية من شظايا الجلد في المختبر. على الرغم من أن الخلايا الليفية لا تتأثر في المقام الأول بالطفرات التي تسبب اضطرابات عصبية عضلية ، إلا أنه يمكن تقسيمها إلى myoblasts. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق إدراج جين Myod، وهو عامل نسخ تنظيمي^5. في هذه المخطوطة، نحن وصف بروتوكول للحصول على myoblasts عبر مختلفة، من إنشاء الثقافات الخلايا الليفية إلى منبرات myotubes مختلفة (يتم وصف ملخص تمثيلي للأسلوب في الشكل 1).

ويعتمد الاختبار السريري قبل السريري للاستراتيجيات العلاجية على النماذج الخلوية والحيوانية التي تحمل طفرات مماثلة للطفرات الموجودة في المرضى البشريين. على الرغم من أن تطوير النماذج الحيوانية أصبح أكثر جدوى مع تقدم تقنيات تحرير الجينات مثل CRISPR/Cas9⁶، إلا أنه لا يزال صعبًا ومكلفًا. وهكذا، فإن خطوط الخلايا المشتقة من المريض هي خيار يمكن الوصول إليه للحصول على نماذج، تغطي الطيف الكبير من طفرات المرض مثل ضمور العضلات دوشين (DMD). إن عنتع وإنشاء نماذج الخلايا أمران حاسمان لتطوير العلاجات الشخصية لمثل هذه الأمراض.

بين العلاجات الشخصية التي تم التحقيق فيها، exon تخطي الاستراتيجيات هي واحدة من تلك الواعدة لdystrophies العضلات المختلفة^7،8. تتكون هذه الاستراتيجية من إنتاج بروتين أقصر ولكن وظيفية. يتم تنفيذ هذا عن طريق إخفاء تعريف exon إلى الجُزَم ، وبالتالي استبعاد إكسون المتحول من الرسول النهائي. هذه هي التكنولوجيا الواعدة جدا التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير لDD. وهكذا، فإننا أيضا وصف في هذا البروتوكول، وأساليب لعابنة الأجهزة myoblasts مع اثنين من خارج مختلفة تخطي التكنولوجيات ذات الصلة: oligonucleotides المضادة للانكارين (AON) و U7snRNA-أدينو المرتبطة بالفيروس (AAV). AON transfection هو أداة جيدة للفحص الأولي لعدة تسلسلات تهدف إلى تعزيز exon تخطي⁹. ومع ذلك، فإن نشاط الـ AONs عابر. للحصول على تعبير مستمر من تسلسل antisenses، ونحن أيضا استكشاف RNAs النووية الصغيرة (snRNAs) جنبا إلى جنب مع AAV، والسماح توطين النووية وإدراجها في آلية الربط¹⁰. U7 هو سنرنا تشارك في معالجة المرنا المرنا الحجر البشري التي يمكن هندستها لربط البروتينات التي سوف تعيد توجيهها إلى spliceosome وتقديم تسلسل antisense¹¹. استخدام تعديل U7 snRNAs في تركيبة مع ناقلات AAV يتغلب على القيود المفروضة على AONs مما أدى إلى استمرار التعبير عن AONs وأفضل نقل الأنسجة ذات الأهمية¹². نحن نستخدم الخلايا المستمدة من مرضى DMD لهذا البروتوكول لتوضيح استراتيجية تخطي exon.

Protocol

100- وأجريت جميع التجارب والخزعات باتباع القواعد الأخلاقية للمؤسسات المعنية بموافقة مجلس الاستعراض المؤسسي لمستشفيات الأطفال على الصعيد الوطني.

1. بدء ثقافة الخلايا الليفية الجلدية

1. إنشاء ثقافة الخلايا الليفية
   1. Aliquot 10 مل من الوسط الليفي(الجدول 1)في 15 مل أنابيب المخروطية. يجب وضع خزعة الجلد ونقلها في هذه الوسيلة. يمكن تخزين الخزعة في 4 درجة مئوية حتى تتم معالجتها ، بشكل تفضيلي في نفس اليوم.
      ملاحظة: استخدم خزعة الجلد في غضون 24-36 ساعة لتجنب النمو المحتمل للتلوث.
   2. استلهمي وسائل الإعلام من الأنبوب وشطف الخزعة بـ 10 مل 1X PBS (درجة حرارة الغرفة) ثلاث مرات. بعد الغسيل الثالث، اترك برنامج تلفزيوني في الأنبوب.
   3. صب خارج برنامج تلفزيوني والجلد على طبق 10 سم^2.
   4. باستخدام مشرط عقيمة، وقطع خزعة إلى أصغر شظايا ممكن.
   5. باستخدام ماصة، نقل جزء الجلد الفردية وإسقاطه في طبق نظيف 10 سم^2. مكان 10 إلى 12 شظايا في الطبق الواحد.
   6. التعرق الزائد من برنامج تلفزيوني من جميع أنحاء كل جزء. كن حذراً لعدم التعرق في الجزء.
   7. غطي الأطباق جزئياً بالغطاء واسمح لشظايا الجلد بالجفاف لمدة 5-20 دقيقة. لا تسمح للشظايا بالجفاف بشكل مفرط.
   8. مرة واحدة في شظايا جافة، إمالة الطبق في 45 درجة، وإضافة ببطء 12 مل من المتوسطة الليفية إلى الزاوية. خفض أسفل الطبق، وتوزيع وسائل الإعلام بعناية حتى لا ترفع شظايا من قبل وسائل الإعلام.
   9. ضع الأطباق في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO₂). استبدال وسائل الإعلام في 5-7 أيام، ومرة واحدة في الأسبوع بعد.
   10. مراقبة الخلايا الليفية الناشئة عن جزء (الشكل 2) و, مرة واحدة التقاء, مرور الخلايا في 75 سم² قارورة. إزالة المتوسطة، وشطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل 0.25 ٪ التربسين. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق أو حتى يتم رفع جميع الخلايا. إضافة 10 مل الليفية المتوسطة النمو لمنع التربسين ونقل الخلايا إلى قارورة جديدة.
       ملاحظة: بالنسبة لعدد الممرات، يتم تأسيس P1 عندما يتم نقل الخلايا الليفية الأولى التي ظهرت من خزعة الجلد إلى قارورة جديدة للانتشار.
2. الحفظ بالتبريد لخطوط الخلايا الليفية الأولية
   1. مرة واحدة في 75 سم² قارورة هو التقاء، شطفه مع 10 مل 1X PBS وpirentate برنامج تلفزيوني.
   2. إضافة 3 مل من 0.25 ٪ التربسين إلى سطح الخلية. ضع القارورة في الحاضنة لمدة 5 دقائق. تحقق من القارورة تحت المجهر لمعرفة ما إذا كانت الخلايا قد تم رفعها. إذا لم يكن كذلك، ضع القارورة مرة أخرى في الحاضنة لمدة 5 دقائق إضافية.
   3. مرة واحدة يتم فصل الخلايا، إضافة 7 مل من الوسائط الليفية إلى القارورة والماصات صعودا وهبوطا لإعادة تعليق الخلايا. جمع الخلايا في أنبوب مخروطي 50 مل.
   4. إعداد 100 ميكروغرام من الأزرق trypan، وإزالة 100 μL من العينة التي يتم cryopreserved، وخلط مع الأزرق trypan. تحميل المزيج على قياس الهيموسيتاتل العد. عد الخلايا في أربعة مجالات مختلفة من مقياس الهيموسيت تحت المجهر. لحساب العدد الإجمالي للخلايا، استخدم الصيغة: (خلايا محسوبة/100) * حجم الثقافة.
   5. تدور أنابيب المخروطية في 300 × ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة أو 4 °C.
   6. التعرق قبالة المتوسطة و resuspend الخلايا في حجم كافية من تجميد المتوسطة: 1 مل لكل 1 مليون خلية / قارورة. الماصات صعودا وهبوطا لتجانس وتوزيع 1 مل على كل كريوفيال المسمى.
   7. ضع القنينات في صندوق التجميد، واسمح للقارورة بالتجميد بمعدل 1 درجة مئوية/دقيقة عند -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
   8. في اليوم التالي نقل قوارير إلى خزان النيتروجين السائل أو -150 درجة مئوية الفريزر.

2. إنشاء خط الخلايا فيبروميابلاستس (FM)

1. بذور الخلايا الليفية الأولية في حوالي 30٪ من التقاء في اثنين من الآبار من لوحة 12-well (2 × 10⁴ خلايا / جيدا) من أجل الحصول على حوالي 50٪ من التقاء في اليوم التالي.
2. بالنسبة إلى تحويل الألياف الليفية، أضف 2 إلى 5 × 10⁹ vg (جزيئات الجينوم الفيروسي) من فيروس العدس hTERT-puromycin في 400 ميكرولتر من الوسط الليفي. إلى البئر الثاني، أضف فقط 400 ميكرولتر من الوسط الليفي. إضافة 1 مل من وسائل الإعلام في اليوم التالي.
   ملاحظة: تم الحصول على Plasmids لإنتاج فيروس العدس من المجموعة التي نشرت Chaouch et al،ورقة 2009. كما أنها وصفت بشكل فردي في أور وآخرون, 2007¹³ لht plasmid و باردي وآخرون ,2006¹⁴ لنظام Tet-on المستخدمة لتصميم ميود بلاسميد. وقد تم الحصول عليها بفضل اتفاقية نقل المواد مع جينثون، فرنسا (يرجى الاتصال الدكتور فنسنت مولي للحصول على هذه البلازميدات - vincent.mouly@upmc.fr). باختصار، يتكون hTERT من البديل hTERT 1 التي يقودها المروج CMV بينما يتم دفع البوسوميسين من قبل المروج PGK. يحتوي MyoD plasmid على متغير ميود 1 مدفوعًا بمروج CMV تحت سيطرة المكبوت rtTA2. هذا البلازميد يحتوي أيضا على اختيار الهيغروميسين أعرب عن الشكر إلى المروج SV40.
   تم إنتاج الفيروسات العدسية باستخدام إنتاج العدسي الفيروسية العادية (انظر بروتوكول وانغ وماكمانوس جوف¹⁵). لفترة وجيزة، MDL-المساعد، القس مساعد، SVS-G-المساعد كانت مصابة عبر كلوريد الكالسيوم هطول الأمطار أيضا من htert أو MyoD plasmids. بعد 48 ساعة، تم جمع المناط، ثم لمدة ثلاثة أيام إضافية. ثم تم تركيز جميع المناذرين عن طريق الطرد المفرط. ثم أعيد تعليق البيليه في مخزن Tris-HCL +NaCl+EDTA. تم تقييم تقدير تيتر من قبل معيار العدس qPCR المقايسة.
3. بعد يوم أو يومين، نقل الخلايا إلى لوحة 6-جيدا وتنمو حتى تصل إلى التقاء 60-70٪.
4. تكملة المتوسطة الليفية مع 1 ميكروغرام / مل من البورومايسين وإضافة 2 مل لكل بئر.
5. إبقاء الخلايا تحت الاختيار حتى جميع الخلايا في السيطرة جيدا ميتة (تصل إلى 12 يوما)، وتغيير وسائل الإعلام كل 2-3 أيام. عبور الخلايا من لوحة 6-جيدا في اثنين من 10 سم² أطباق لمزيد من الانتشار.
6. تجميد قوارير الخلايا الليفية بعد الاختيار. تسمية كـ F (hTer).
7. البذور hTERT التعبير عن الخلايا الليفية (F(hTer)) في حوالي 30٪ التقاء في المتوسطة الليفية، في بئرين من لوحة 12-جيدا، أن يكون حوالي 50٪ التقاء في اليوم التالي.
8. بالنسبة لعملية تحويل الفيروسة العدسية، اخلط 2 إلى 5 × 10⁹ vg من فيروس العدس ميو دي-هيغروميسينب في 400 ميكرولتر من الوسط الليفي وإضافة إلى الآبار المعنية؛ إلى بئر ثالثة يضيف 400 ميكرول فيليبلاست وسط. إضافة 1 مل من المتوسط في اليوم التالي.
9. بعد يوم أو يومين نقل الخلايا إلى لوحة 6-جيدا وتنمو حتى 60-70٪ التقاء.
10. تكملة المتوسطة نمو الخلايا الليفية مع hygromycin B (400 ميكروغرام / مل) وإضافة 2 مل لكل بئر.
11. إبقاء الخلايا تحت الاختيار حتى جميع الخلايا في السيطرة جيدا ميتة (تصل إلى 12 يوما)، وتغيير وسائل الإعلام كل 2-3 أيام.
12. تجميد قوارير الخلايا الليفية بعد الاختيار. تسمية FM متبوعة برقم/اسم تعريف الخلية.

3. بروتوكول التغاير

1. البذور التي تم نقلها FM على 10 سم² أطباق مع التقاء 30-40٪. في لوحة 12-جيدا، بذرة 6 × 10⁴ الخلايا (وهذا يعتمد على خط الخلية الفردية).
   ملاحظة: بالنسبة للمناعة، خلايا البذور على أغطية الزجاج أو شرائح الغرفة المغلفة Matrigel. تميّف Matrigel في الساعة 1:10 في متوسطة DMEM، أضف حجمًا يكفي لتغطية السطح، ودع الشرائح تجلس في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. التعرق قبالة الحق قبل بذر الخلايا.
2. لsyoblasts التعريفي, عندما وصلت الخلايا الليفية 70٪ التقاء(الشكل 3A),شطف سطح الخلية مع برنامج تلفزيوني وإضافة وسائل الاعلام myoblast الطازجة تستكمل مع 8 ميكروغرام / مل doxycline.
   ملاحظة: نجاح التمايز هو للخطر الماضي 80٪ التقاء.
3. بعد يومين إلى ثلاثة أيام في وقت لاحق، والخلايا هي 90-95٪ التقاء وmorphology الخاصة بهم سوف تتغير (الشكل 3B). شطف سطح الخلية مع برنامج تلفزيوني وإضافة وسائل الاعلام تمايز جديدة تستكمل مع 8 ميكروغرام / مل doxycycline.
4. الاستمرار في تغيير وسائل الإعلام كل 2-3 أيام دون passaging حتى يتم تأسيس myotubes (تأكيد عبر مورفولوجيا) (الشكل 3C).
5. سبعة إلى عشرة أيام بعد بدء التمايز myotube، يجب أن تكون الخلايا متمايزة تماما، ويمكن أن تبدأ في فصل أو يموت. قبل أن يحدث هذا، حصاد myotubes لمزيد من التحليل.
   ملاحظة: يعتمد الوقت دورة تشكيل ميوتوب على خط الخلية. قد تتداخل الطفرات في البروتينات المرتبطة بالعضلات في إمكانية الميوجينية. عندما تبدأ myotubes تظهر مشرقة وتبدو بيضاء على الحدود هو إشارة أنها بدأت في فصل (الشكل 4).
6. لحصاد myotubes، وجمع وسائل الإعلام ونقلها إلى أنبوب مخروطي 50 مل. قد تحتوي الوسيطة على شتّى الالوتوب التي تم فصلها.
7. شطف myotubes مع 5 مل PBS ونقل برنامج تلفزيوني إلى أنبوب 50 مل.
8. إضافة 3 مل من 0.25 ٪ التربسين إلى سطح الخلية. ضع الطبق في الحاضنة لمدة 5 دقائق. تحقق من الطبق تحت المجهر لمعرفة ما إذا كانت الخلايا قد رفعت. إذا لم يكن كذلك، وضعه مرة أخرى في الحاضنة لمدة 5 دقائق إضافية.
9. مرة واحدة يتم فصل الخلايا، إضافة 7 مل من الوسائط الليفية إلى الطبق والماصات صعودا وهبوطا لإعادة توزيع الخلايا. جمع الخلايا إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
10. أجهزة الطرد المركزي عند 1200 x ز لمدة 7 دقائق عند 4 درجة مئوية.
11. pirate بعناية قبالة السائل، دون إزعاج بيليه. تخزين الكريات في -80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.

4. المناعة من ميوتيوبات مختلفة

ملاحظة: بالنسبة إلى الكبت المناعي، يمكنك زراعة الخلايا في أغطية الزجاج أو شرائح الحجرة كما هو مذكور أعلاه.

1. مرة واحدة يتم تمييز myotubes تماما، وpirate قبالة وسائل الإعلام وشطف بعناية الشرائح مع برنامج تلفزيوني. الطامح برنامج تلفزيوني قبالة.
2. إضافة 4٪ PFA الطازجة (500 ميكرولتر لكل بئر من لوحة 12-well) واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. التعرق PFA قبالة.
3. شطف مع 1 مل PBS.
4. احتضان مع 0.2 M الجليسين في درجة حرارة الغرفة، لمدة 10 دقيقة. البيربيرات الجليسين قبالة.
5. Permeabilize مع برنامج تلفزيوني 0.5٪ TritonX-100 (300 ميكرولتر / بئر من لوحة 12-well)، لمدة 10 دقيقة مع التحريض لطيف.
6. كتلة مع 300 ميكرولتر /جيدا من حظر الحل، لمدة 10 دقيقة مع التحريض لطيف.
7. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية المخفف 1:50 في 300 ميكرولتر من محلول الحجب، لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة، مع اهتزاز لطيف.
8. شطف ثلاث مرات مع 1 مل / بئر من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، مع اهتزاز لطيف.
9. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المخفف 1:500 في 300 ميكرولتر من محلول الحجب، لمدة ساعة واحدة، في درجة حرارة الغرفة، مع اهتزاز لطيف. تغطية لوحة مع رقائق الألومنيوم.
10. شطف ثلاث مرات مع 1 مل / بئر من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، مع اهتزاز لطيف.
11. احتضان مع DAPI المخفف في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق. شطف ثلاث مرات مع 1 مل / بئر من برنامج تلفزيوني.
12. إضافة قطرة من متوسطة التركيب إلى شريحة زجاجية. إزالة غطاء مع ملقط ووضعها على وجهه إلى أسفل على قطرة من المتوسط المتصاعد.
13. عكس الشريحة على منشفة ورقية واضغط بلطف لإزالة فقاعات والإفراط في تركيب المتوسطة.
14. ختم الشرائح مع طلاء الأظافر وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى التصوير.

5. Antisense oligonucleotide transfection

ملاحظة: البروتوكول أدناه هو لtransfection من لوحة 6-جيدا. قم بضبط وحدات التخزين وفقًا لذلك للوحات أصغر أو أكبر. يتم نقل في 100٪ التقاء myoblasts عندما تكون الخلايا جاهزة لخطوة التمايز.

1. pirate وسائط النمو myoblast وشطف الخلايا مع 1 مل PBS.
2. إضافة 500 ميكرولتر /بئر من وسائل الاعلام OptiMEM واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
3. تخفيف oligonucleotide المضادة للsense (AON) في 100 ميكرولتر من OptiMEM إلى التركيز النهائي المطلوب (أي 50 ن م، 100 NM، 200 NM، 500 nM). احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
   ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول ل 2'omethyl-فوسفوروثيوات AONs.
4. اخلطي الدهون مع OptiMEM (الحجم النهائي 100 ميكرولتر) لإعطاء نسبة نهائية من 1:1 (ميكروغرام الحمض النووي: μL ليبوميكتامين). احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
5. الجمع بين ليبووليكتامين المخفف مع AON المخفف. تخلط بلطف عن طريق الأنابيب واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح تشكيل معقدة. تجنب فقاعات الهواء.
6. أضف 200 ميكرولتر من الدهون والليفية ومزيج AON إلى الآبار المعنية. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5٪ CO₂.
7. في اليوم التالي إزالة مزيج transfection وإضافة 2 مل من وسائل الإعلام التمايز الدافئة تكمل مع doxycycline.
8. جمع الخلايا على الأقل ثلاثة أيام في وقت لاحق لاستخراج الحمض النووي الريبي أو 7-21 يوما في حالة تحليل البروتين.
   ملاحظة: قد تختلف أيام التمايز اللازمة للكشف عن RNA و/أو التعبير البروتيني وفقًا للجين الذي يهمك أو خط الخلية. في حالة DMD، من الممكن الكشف عن مرنا في غضون ثلاثة أيام. اكتشاف بروتين دستروفين يتطلب سبعة أيام على الأقل. هذا سوف تختلف تبعاً لخط الخلية. يمكن أن تؤثر التركيزات العالية من AON ومكشف نقل الملوثات على التفّاثر.

6. AAV1-U7 النقل

ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول للوحات 6-جيداً. اضبط وحدات التخزين بشكل متناسب مع مساحة السطح الثقافي. يتم نقل في 100٪ التقاء myoblasts عندما تكون الخلايا جاهزة لخطوة التمايز. AAV1 هو النمط المصلي AAV مع أفضل قدرة نقل myoblasts المستزرعة.

1. التعرق قبالة متوسطة نمو myoblast وشطف الخلايا مع 1 مل PBS.
2. تمييع 0.5-1 ×^{10 11} جزيئات فيروسية من AAV1-U7 في 700 ميكرولتر من وسائل الإعلام التمايز الدافئة تكمل مع doxycycline.
   ملاحظة: نحن نستخدم qPCR لتحديد التركيز الفيروسي. قد تختلف كمية الفيروس المستخدم وفقًا لطريقة القياس الكمي ويجب تحديدها مسبقًا باستخدام مقايسة المراسل.
3. إضافة مزيج الفيروسية إلى البئر عن طريق إسقاطه متجانس.
4. في اليوم التالي، إضافة 1.3 مل من وسائل الإعلام التمايز الحارة تكمل مع doxycycline.
5. جمع الخلايا على الأقل ثلاثة أيام في وقت لاحق لاستخراج الحمض النووي الريبي أو 7 إلى 21 يوما في حالة تحليل البروتين.

7. RNA استخراج

ملاحظة: يجب أن تكون جميع المواد المستخدمة أثناء هذه الخطوة مجانية RNase.

1. إضافة 500 μL من TRIzol لكل بيليه و pipet صعودا وهبوطا عدة مرات لضمان أن الخلايا متجانسة lysed.
2. نقل الخلية lysate في أنبوب 1.5 مل ومحتضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
3. إضافة 100 μL من الكلوروفورم ويهز يدويا لمدة 15 s. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
4. جهاز طرد مركزي عند 12000 × ز لمدة 15 دقيقة عند 4 درجة مئوية. جمع المرحلة مائي (أعلى واحد) ونقلها إلى أنبوب جديد 1.5 مل.
5. 1 حجم من المرحلة مائي، إضافة 1 حجم الإيثانول 100٪ ومزيج عن طريق الأنابيب.
   ملاحظة: نوصي بتنقية العمود وتركيزه.
6. نقل العينة إلى عمود Zymo-Spin IC في أنبوب جمع وطاردة مركزية عند 12,000 x g لمدة 30 s. تجاهل التدفق من خلال.
7. بالنسبة للديناس DNase I في العمود ، قم بغسل العمود مسبقًا مع 400 ميكرولتر RNA Wash Buffer. جهاز طرد مركزي عند 12,000 x g لمدة 30 s. تجاهل التدفق من خلال.
8. إعداد 40 ميكرولتر من مزيج التفاعل DNase لكل عينة. مزيج 5 μL DNase الأول مع 35 ميكرولتر الحمض النووي الهضم العازلة.
9. إضافة مزيج مباشرة إلى مصفوفة العمود. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
10. إضافة 400 μL RNA الإعدادية العازلة إلى العمود والطرد المركزي في 12000 × ز لمدة 30 s. تجاهل التدفق من خلال.
11. أضف 700 ميكرولتر RNA Wash Buffer إلى العمود والطرد المركزي عند 12000 x g لمدة 30 s. تجاهل التدفق من خلال.
12. أضف 400 ميكرولتر RNA Wash Buffer إلى العمود والطرد المركزي عند 12000 x g لمدة 2 دقيقة لضمان الإزالة الكاملة لمخزن الغسيل. نقل العمود بعناية إلى أنبوب 1.5mL خالية من RNase.
13. إضافة 15 ميكرولتر خالية من النوى المياه مباشرة إلى مصفوفة العمود. احتضان لمدة 5 دقائق والطرد المركزي في 12،000 س ز لمدة 1 دقيقة.
    ملاحظة: جمع الجيش الملكي النيبالي مائل وتطبيقه مرة أخرى إلى العمود لزيادة العائد. جهاز طرد مركزي عند 12,000 x غم لمدة دقيقة واحدة.
14. ضع العينات على الجليد وتحديد العينات في قطرة نانو.
15. تخزين العينات عند -80 درجة مئوية.

8- تحليل RT-PCR

ملاحظة: في هذه الخطوة، نقدم اقتراح الكواشف للكشف عن التعبير من مرنا ديستروفين، ولكن يمكن تكييفها بسهولة إلى الكواشف الأخرى من اختيار.

1. النسخ العكسي
   1. اذيب كل الكواشف و أبقيها على الجليد
   2. إعداد مزيج مع 4 ميكرولتر من 5x التفاعل العازلة, 2 ميكرولتر من dNTP ميكس (10 mM), 1 ميكرولتر من ريبولوك RNase المانع, و 1 ميكرولتر من RevertAid RT.
   3. اخلط الأنبوب بلطف و جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة.
   4. في أنابيب PCR 0.2 مل، إضافة حجم كافية من RNA من أجل الحصول على 1 ميكروغرام لكل رد فعل. أضف الماء الخالي من النوى q.s.p 12 ميكرولتر.
   5. توزيع 8 ميكرولتر من مزيج التفاعل لكل أنبوب. الحجم الإجمالي هو 20 ميكرولتر.
   6. ضع الأنابيب في ثيرموسيسير واحتضان لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية متبوعة بـ 60 دقيقة عند 42 درجة مئوية. وقف رد الفعل عن طريق التدفئة في 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   7. ضع الأنابيب على الجليد أو في -20 درجة مئوية للتخزين لفترة أطول.
2. PCR
   ملاحظة: تصميم التمهيديات في تقاطعات exons يفضل.
   1. فورتيكس الكواشف وتدور إلى أسفل قبل الاستخدام.
   2. إعداد مزيج رئيسي باستخدام 0.5 ميكرولتر إلى الأمام (25 μM)، 0.5 ميكرولتر عكسي (25 μM)، 12.5 μL 2x PCR ماجستير ميكس، و 8.5 ميكرولتر من المياه خالية من النوى لكل عينة.
   3. Aliquot 22 ميكرولتر من مزيج رئيسي في أنبوب لكل عينة.
   4. إضافة 3 ميكرولتر من cDNA (150 نانوغرام) إلى أنبوب PCR لكل منها. إضافة 3 ميكرولتر من المياه خالية من النوى إلى أنبوب التحكم السلبي PCR.
   5. دوامة وتدور أسفل أنابيب PCR.
   6. احتضان الأنابيب في ثيرموستر في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، (Tm-5) درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لـ (1 دقيقة/ك.ب) 34 مرة، 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: يمكن تحديد درجة حرارة التلاهم الأمثل تجريبياً. بالنسبة للمزيج الرئيسي المقترح، اطرح 5 درجة مئوية من درجة حرارة ذوبان التمهيدي.
   7. تحميل 12 ميكرولتر من تفاعل PCR على هلام agarose وتجميد العينات في -20 درجة مئوية.

9. الكشف عن التعبير عن الديستروفين عن طريق النشاف الغربية

ملاحظة: هذا البروتوكول هو الأمثل لdystrophin، وهو بروتين غشاء كبير. قد تكون هناك حاجة إلى شروط محددة للبروتينات المختلفة.

1. استخراج البروتين
   1. بعد 7-21 يوما من التمايز، وجمع الخلايا مع 5 مل من برنامج تلفزيوني مع 100 ميكرولتر 0.5 M EDTA، و 50 ميكرولتر مثبطات البروتياز. احتضان في 37 درجة مئوية حتى تنفصل الخلايا. جهاز طرد مركزي عند 1200 x غ لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. المفاجئة تجميد بيليه عن طريق غمس الأنبوب في النيتروجين السائل. تخزين بيليه في -80 درجة مئوية أو المضي قدما في خطوة تحلل.
   2. إعداد العازلة تحلل بإضافة 1٪ من digitonin، 1٪ مثبطات البروتياز، 10٪ مثبطات الفوسفاتيز، وقاعدة عازلة إلى حجم إجمالي (60 ميكرولتر لكل بيليه الخلية).
   3. إضافة 60 ميكرولتر من العازلة تحلل إلى بيليه الخلية، على الجليد. سونيكات لمدة 5 s. اسمحوا الجلوس على الجليد لمدة 8 ق. كرر صوتنة والراحة الخطوات مرتين.
   4. عينات احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
   5. جهاز طرد مركزي عند 14000 x ز لمدة 20 دقيقة عند 4 درجة مئوية.
   6. نقل المناط إلى أنابيب نظيفة.
   7. كمي العينات من قبل حمض bicinchoninic (BCA) فحص, اتباع تعليمات الشركة المصنعة.
   8. خلط محلول البروتين مع حجم مناسب من عازلة Laemmli. جعل aliquots من 100 ميكروغرام. إذا لزم الأمر، ضبط مستوى الصوت إلى 25 ميكرولتر مع عازلة تحلل قاعدة. تخزين العينات عند -80 درجة مئوية.
2. النشاف الغربي
   1. عينات ذوبان على الجليد.
   2. denature العينات في 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم تبريدها في الجليد، وتدور أسفل.
   3. تخفيف 20X تريس خلات SDS تشغيل المخزن المؤقت في 200 مل dH₂س وإضافة 500 ميكرولتر المضادة للأكسدة.
   4. إعداد 3-8٪ تريس-خلات هلام بولياكريلاميد عن طريق إزالة المشط والشطف مع dH₂O. تجميع الجل في الجهاز الكهربائي. تعبئة الغرفة الداخلية مع المخزن المؤقت قيد التشغيل.
   5. تحميل 5 ميكرولتر من سلم البروتين و 25 ميكرولتر من العينة في الجل. تعبئة الغرفة الخارجية مع المخزن المؤقت قيد التشغيل.
   6. تشغيل في 80 V ل 1 ساعة في 4 درجة مئوية. ثم، عند 120 فولت مقابل 2 ساعة عند 4 درجات مئوية.
   7. إعداد 3 لتر من 1X العازلة نقل مع 150 مل من الميثانول 20X، 150 مل من 20X العازلة نقل، و 2700 مل من dH₂O. تبريده وصولا الى 4 درجة مئوية.
   8. قطع 4 قطع من ورقة تصفية وقطعة واحدة من غشاء نيتروسيلولوز. انقع فلتر الورق والغشاء في صينية مع مخزن نقل مؤقت.
   9. إزالة بلطف هلام من القضية وتجميعه في جهاز نقل مع ورقة فلتر، والغشاء والإسفنج. يتم وضع الجل على الجانب السلبي والغشاء على الجانب الإيجابي.
   10. تشغيل نقل في 300 mA، واثارة، في 4 °C،بين عشية وضحاها.
   11. كتلة الغشاء في 10 مل من العازلة منع لمدة 1 ساعة مع التحريض لطيف، في درجة حرارة الغرفة.
   12. إعداد حل الأجسام المضادة الأولية مع 10 مل من العازلة منع و 50 ميكرولتر من جسم ديستروفين المضاد (1:200).
   13. تجاهل المخزن المؤقت للحظر وإضافة حل الأجسام المضادة الأساسية. احتضان مع التحريض لطيف لمدة 2 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
   14. شطف الغشاء ثلاث مرات مع 0.1٪ Tween برنامج تلفزيوني، لمدة 5 دقائق مع التحريض لطيف.
   15. إعداد حل الأجسام المضادة الثانوية باستخدام 10 مل من محلول الحجب، 2 ميكرولتر من الأجسام المضادة المضادة للأرنب (1:5000)، و 20 ميكرولتر من 0.2٪ توين.
   16. إضافة حل الأجسام المضادة الثانوية إلى الغشاء. احتضان لمدة 1 ساعة مع التحريض لطيف، مغطاة رقائق الألومنيوم لحماية من الضوء.
   17. تخلص من محلول الأجسام المضادة وشطف الغشاء 3 مرات مع 0.1٪ Tween PBS ، لمدة 5 دقائق مع التحريض اللطيف ، ومحمي من الضوء.
   18. التعرض وصورة الغشاء على جهاز التصوير.
   19. وصمة عار الغشاء للبروتين الكلي مع عودة 700 مجموع وصمة عار البروتين، اتباع تعليمات الشركة المصنعة.
       ملاحظة: الكشف عن الديستروفين بواسطة النشاف الغربية يعتمد على عمر / طفرة المريض وقدرة الخلية على الصمامات والبقاء تعلق ما يكفي من الوقت لتتراكم ما يكفي من الديستروفين.

النتائج

يوضح هذا البروتوكول كيفية إنشاء ثقافات الخلايا الليفية المشتقة من الجلد البشري وتحويلها إلى myoblasts ثم إلى ميوتوب متمايزة. هذا النوع من خط الخلية مفيد للغاية لدراسة الاضطرابات العصبية العضلية والاختبارات المختبرية للعلاجات المحتملة.

يظهر تمثيل تخطيطي لتحويل الخلايا ا?...

Discussion

للحصول على خطوط خلايا FM ذات نوعية جيدة، تكون بعض الخطوات حاسمة. وكلما أسرعت عملية خزعة الجلد، كلما كانت فرص الحصول على الخلايا الليفية الصحية أكبر. عدد مرور الثقافات الخلايا الليفية مهم أيضا. الخلايا الأولية لديها قدرة انتشارية محدودة وبعد العديد من الممرات ، تدخل في شيخوخة تكرارية. وبالت...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm dish	Corning	430167
0.25% Trypsin-EDTA, phenol red	Thermo Fisher	2500056
10X Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP3994
12-well plate	Corning	3513
20X Transfer buffer	Thermo Fisher	NP00061
20X Tris-acetate SDS running buffer	Thermo Fisher	LA0041
3-8% Tris-Acetate gel	Thermo Fisher	EA0378BOX
75 cm2 flask	Corning	430641U
Antibiotic-Antimicotic 100X	Thermo Fisher	15240062
Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody	Developmental Studies Hybridome Bank	MF20 supernatant	Dilution 1:50
Antioxidant	Thermo Fisher	NP0005
BCA Protein Assay	Thermo Fisher	23227
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
DAPI	Thermo Fisher	D3571	Dilution 1:1000
Digitonin	Millipore Sigma	300410250MG
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate	Thermo Fisher	10569044
DNAse I set (250U)	Zymo Research Corporation	E1010
Doxycycline Hydrochloride	Fisher Scientific	BP2653-5
Dup2 human primers	Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3'	Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3'
Dystrophin antibody	Abcam	ab15277	Dilution 1:200
Fetal bovine serum	Thermo Fisher	16000
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A11001	Dilution 1:1000
Halt Protease inhibitor cocktail 100X	Thermo Fisher	78430
Hemocytometer	Hausser Scientific	3100
Hygromycin B	Thermo Fisher	10687010
IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Li-Cor	926-68071	Dilution 1:5000
Lab-Tek II CC2 chamber slide system	Thermo Fisher	15852
Laemmli	Bioworld	105700201
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher	L3000008
Matrigel GFR membrane matrix	Corning	354230
Methanol	Fisher Scientific	A412P-4
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher	51000001
Nitrocellulose membrane 0.45 µm	GE Healthcare Life Sciences	10600002
Normal Goat serum control	Thermo Fisher	10000C
Odyssey Blocking Buffer (PBS)	Li-Cor	927-40003	Blocking buffer for Western blot
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher	11058021
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PCR master mix	Thermo Fisher	K0172
Phosphatase inhibitor	Thermo Fisher	A32957
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio Rad	1610374
Puromycin	Thermo Fisher	A1113803
Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization	Li-Cor	926-11021
RevertAid kit	Thermo Fisher	K1691
RNA Clean & Concentrator-25	Zymo Research Corporation	R1018
Scalpels	Aspen Surgical	372611
Skeletal Muscle Cell Differentiation medium	Promocell	C23061
Skeletal Muscle Cell Growth medium	Promocell	C23060
Triton X-100	Acros Organics	215682500
TRIzol reagent	Thermo Fisher	15596026
Tween 20	Fisher Scientific	BP337500
Ultra low temperature freezer	Thermo Scientific	7402
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher	15575020
Vectashield antifade mounting medium	Vector Labs	H1000