将人类成纤维细胞直接重新编程到肌细胞中，以研究神经肌肉疾病的治疗方法

摘要

此协议描述了皮肤成纤维细胞转化为肌细胞及其分化成肌管。细胞系来自神经肌肉疾病患者，可用于研究病理机制和测试治疗策略。

摘要

对肌肉营养不良症的病理生理学和治疗靶点的调查都因人类肌细胞的增殖能力有限而受阻。已经创建了几个小鼠模型，但它们要么不能真正代表人类对这种疾病的生理病理学，要么不能代表人类中发现的广泛突变。人类原发性肌瘤的永生是这一局限性的一种替代：然而，它仍然依赖于肌肉活检，这是侵入性的，不容易获得。相比之下，皮肤活检更容易获得，对患者的侵入性更小。从皮肤活检中提取的纤维细胞可以永生并转导成肌细胞，提供具有极高肌原潜力的细胞来源。在这里，我们描述了一个快速和直接的重新编程方法的成纤维细胞成致远的血统。纤维细胞被两种扁豆病毒所传递 ：hTERT 使原始文化永生，以及一种可诱导的 MYOD，在添加多氧环素后，诱导成纤维细胞转化为肌细胞，然后成熟肌管，表达后期分化标记。这种快速的异位治疗方案是研究病理机制和研究神经肌肉疾病的创新基因或药理生物疗法的有力工具。

引言

直接从人体组织获得的细胞模型有助于模拟许多人类遗传性疾病，其优点是具有原始的基因组背景，并在许多情况下复制患者观察到的相同分子和细胞特征。在神经肌肉疾病领域，肌肉活检一直是人类肌细胞的一大来源，有助于阐明病理机制。此外，它们是药物和基因疗法体内测试的重要工具。一方面，从肌肉碎片中提取肌细胞相对容易。另一方面，原发性肌细胞的培养和维持是具有挑战性的，因为它们的增殖率有限，体外¹的复制衰老。这些局限性的一个替代方案是，通过插入人类端粒酶（hTERT）和/或环素依赖激酶4（CDK4）基因^2，3，保持骨骼肌肉特征^4，使肌细胞永生。然而，原发性肌细胞的衰减仍然依赖于肌肉活检，这是一种对患者不利的外科手术，在许多情况下，患者的肌肉处于晚期退化。因此，这些患者的肌肉由相当一部分纤维化和/或脂肪组织组成，产生更少的肌肉细胞，需要净化以前不朽的细胞。

与肌肉活检相比，皮肤活检更容易获得，对患者的危害也较小。原发性成纤维细胞可以从 体外的皮肤碎片中提取。虽然成纤维细胞主要不受导致神经肌肉紊乱的突变的影响，但它们可以转入肌细胞。这可以通过插入Myod基因来实现 ，Myod 基因是一....

研究方案

所有实验和活检都是按照国家儿童医院机构审查委员会批准的有关机构的道德规则进行的。

1. 皮肤成纤维细胞文化的开始

1. 建立成纤维细胞文化
   1. 阿里引用 10 mL 的成纤维细胞介质 （表 1） 在 15 ml 圆锥管。皮肤活检应放置并运送到这种介质中。活检可以存储在4°C，直到它被处理，优先在同一天。
      注：在24-36小时内使用皮肤活检，以避免潜在的污染增长。
   2. 从管子中吸气介质，用 10 mL 1X PBS （室温） 冲洗活检三次。第三次洗涤后，将 PBS 留在管子中。
   3. 倒出PBS和皮肤到10厘米² 菜。
   4. 使用无菌手术刀，将活检切成尽可能小的碎片。
   5. 使用移液器，转移单个皮肤碎片，并将其放入干净的 10 厘米² 盘中。每道菜放置 10 到 12 个片段。
   6. 从每个片段周围吸出多余的 PBS。小心不要吸气碎片。
   7. 用盖子部分盖住盘子，让皮肤碎片干燥5-20分钟。不要让碎片过度干燥。
   8. 一旦碎片干燥，将盘子倾斜45度，然后慢慢将12mL的成纤维细胞介质添加到角落。放下盘子，小心地分发媒体，这样碎片就不会被媒体抬起来。
   9. 将菜肴放入孵化器（37 °C， 5% CO_2）。在 5 - 7 天....

结果

此协议展示了如何建立人类皮肤衍生的成纤维细胞培养物，并将它们转化为肌细胞，然后转化为差异化肌管。这种类型的细胞系对于神经肌肉疾病的研究和潜在疗法的 体外 测试非常有用。

图 1中显示了成纤维细胞转换的示意图。 图 2A 显示了皮肤碎片和从皮肤上冒出的成纤维细胞。当达到交汇点（图2B）

讨论

要获得高质量的调频细胞线，某些步骤至关重要。皮肤活检处理得越早，获得健康成纤维细胞的机会就越大。成纤维细胞文化的通过数量也很重要。原细胞的增殖能力有限，经过许多通道后，它们进入复制性衰老。因此，最好在低通道数下储存成纤维细胞，并尽早转化细胞。

另一个重要步骤是病毒生产具有最大的纯度和准确的量化。例如，使用 qPCR 的病毒基因组定量提供了?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm dish	Corning	430167
0.25% Trypsin-EDTA, phenol red	Thermo Fisher	2500056
10X Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP3994
12-well plate	Corning	3513
20X Transfer buffer	Thermo Fisher	NP00061
20X Tris-acetate SDS running buffer	Thermo Fisher	LA0041
3-8% Tris-Acetate gel	Thermo Fisher	EA0378BOX
75 cm2 flask	Corning	430641U
Antibiotic-Antimicotic 100X	Thermo Fisher	15240062
Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody	Developmental Studies Hybridome Bank	MF20 supernatant	Dilution 1:50
Antioxidant	Thermo Fisher	NP0005
BCA Protein Assay	Thermo Fisher	23227
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
DAPI	Thermo Fisher	D3571	Dilution 1:1000
Digitonin	Millipore Sigma	300410250MG
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate	Thermo Fisher	10569044
DNAse I set (250U)	Zymo Research Corporation	E1010
Doxycycline Hydrochloride	Fisher Scientific	BP2653-5
Dup2 human primers	Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3'	Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3'
Dystrophin antibody	Abcam	ab15277	Dilution 1:200
Fetal bovine serum	Thermo Fisher	16000
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A11001	Dilution 1:1000
Halt Protease inhibitor cocktail 100X	Thermo Fisher	78430
Hemocytometer	Hausser Scientific	3100
Hygromycin B	Thermo Fisher	10687010
IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Li-Cor	926-68071	Dilution 1:5000
Lab-Tek II CC2 chamber slide system	Thermo Fisher	15852
Laemmli	Bioworld	105700201
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher	L3000008
Matrigel GFR membrane matrix	Corning	354230
Methanol	Fisher Scientific	A412P-4
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher	51000001
Nitrocellulose membrane 0.45 µm	GE Healthcare Life Sciences	10600002
Normal Goat serum control	Thermo Fisher	10000C
Odyssey Blocking Buffer (PBS)	Li-Cor	927-40003	Blocking buffer for Western blot
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher	11058021
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PCR master mix	Thermo Fisher	K0172
Phosphatase inhibitor	Thermo Fisher	A32957
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio Rad	1610374
Puromycin	Thermo Fisher	A1113803
Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization	Li-Cor	926-11021
RevertAid kit	Thermo Fisher	K1691
RNA Clean & Concentrator-25	Zymo Research Corporation	R1018
Scalpels	Aspen Surgical	372611
Skeletal Muscle Cell Differentiation medium	Promocell	C23061
Skeletal Muscle Cell Growth medium	Promocell	C23060
Triton X-100	Acros Organics	215682500
TRIzol reagent	Thermo Fisher	15596026
Tween 20	Fisher Scientific	BP337500
Ultra low temperature freezer	Thermo Scientific	7402
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher	15575020
Vectashield antifade mounting medium	Vector Labs	H1000