Nöromüsküler Bozukluklar için Tedavileri Araştırmak için İnsan Fibroblastlarının Myoblastlara Doğrudan Yeniden Programlanması

Özet

Bu protokol, cilt fibroblastlarının miyoblastlara dönüşümünü ve farklılaşmalarını miyotüplere açıklar. Hücre hatları nöromüsküler bozukluğu olan hastalardan türetilmiştir ve patolojik mekanizmaları araştırmak ve terapötik stratejileri test etmek için kullanılabilir.

Özet

Kas distrofilerinde hem patofizyoloji hem de terapötik hedeflerle ilgili araştırmalar, insan miyoblastlarının sınırlı proliferatif kapasitesi ile engellenmiştir. Birkaç fare modeli oluşturulmuştur, ancak bunlar hastalığın insan fizyopatolojisini gerçekten temsil etmez veya insanlarda bulunan geniş mutasyon spektrumunu temsil etmez. İnsan birincil mioblastlarının ölümsüzleştirilmesi bu sınırlamaya bir alternatiftir; bununla birlikte, hala invaziv olan ve kolayca bulunmayan kas biyopsilerine bağlıdır. Buna karşılık, cilt biyopsilerinin elde etmesi daha kolaydır ve hastalara daha az invazivdir. Cilt biyopsilerinden elde edilen fibroblastlar ölümsüzleştirilebilir ve miyoblastlara dönüştürülerek mükemmel miyojenik potansiyele sahip bir hücre kaynağı sağlanabilir. Burada fibroblast'ın hızlı ve doğrudan yeniden programlanma yöntemini miyojenik bir soyun içine açıklıyoruz. Fibroblastlar iki lentivirüs ile transdüklenir: birincil kültürü ölümsüzleştirmek için hTERT ve doksiksin eklenmesi üzerine fibroblastların myoblastlara dönüştürülmesini ve daha sonra geç farklılaşma belirteçlerini ifade eden olgun myotube'ları indükleyen tet-indükleyici bir MYOD. Bu hızlı transdifferentiation protokolü patolojik mekanizmaları araştırmak ve nöromüsküler bozukluklar için yenilikçi gen bazlı veya farmakolojik biyoterapileri araştırmak için güçlü bir aracı temsil eder.

Giriş

Doğrudan insan dokularından elde edilen hücresel modeller, orijinal genomik bağlama sahip olmanın ve çoğu durumda hastalarda gözlenen aynı moleküler ve hücresel ayırt edici özelliklerin yeniden üretilmesinin avantajıyla birçok insan genetik bozukluğunu modellemek için yararlıdır. Nöromüsküler bozukluklar alanında, kas biyopsileri insan mioblastlarının büyük bir kaynağı olmuştur ve patolojik mekanizmaların aydınlatılmasında yardımcı olmuştur. Ek olarak, ilaçların ve gen tedavilerinin in vivo testi için önemli bir araçtır. Bir yandan, miyeoblastların kas parçalarından türetimi nispeten kolaydır. Öte yandan, birincil mioblastların kültürü ve bakımı, sınırlı çoğa....

Protokol

Tüm deneyler ve biyopsiler, Ülke Çapında Çocuk Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu'nun onayı altında ilgili kurumların etik kurallarına uyularak gerçekleştirildi.

1. Dermal fibroblast kültürünün başlatılması

1. Fibroblast kültürünün kurulması
   1. 15 mL konik tüplerde aliquot10mL fibroblast ortamı ( Tablo 1 ). Cilt biyopsisi bu ortama yerleştirilecek ve taşınmalıdır. Biyopsi, aynı gün tercihen işlenene kadar 4 °C'de saklanabilir.
      NOT: Potansiyel kontaminasyon büyümesini önlemek için cilt biyopsisini 24-36 saat içinde kullanın.
   2. Ortamı tüpten epire edin ve biyopsiyi 10 mL 1X PBS (oda sıcaklığı) ile üç k....

Sonuçlar

Bu protokol, insan derisinden türetilmiş fibroblast kültürlerinin nasıl kurulup mioblastlara ve daha sonra farklılaştırılmış miyotüplere nasıl dönüştürülür olduğunu göstermektedir. Bu tür hücre hattı nöromüsküler bozuklukların incelenmesi ve potansiyel tedavilerin in vitro testi için son derece yararlıdır.

Fibroblast dönüşümünün şematik bir gösterimi Şekil 1'de gösterilmiştir. Şekil 2A

Tartışmalar

FM hücre hatlarını kaliteli elde etmek için bazı adımlar kritik öneme sahiptir. Cilt biyopsisi ne kadar erken işlenirse, sağlıklı fibroblast elde etme şansı o kadar artar. Fibroblast kültürlerinin geçiş sayısı da önemlidir. Birincil hücreler sınırlı proliferatif kapasiteye sahiptir ve birçok geçitten sonra çoğaltıcı senescence girerler. Bu nedenle, düşük bir geçiş sayısında fibroblast stoğuna sahip olmak ve hücreleri mümkün olan en erken geçişte dönüştürmek daha iyidir.

.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm dish	Corning	430167
0.25% Trypsin-EDTA, phenol red	Thermo Fisher	2500056
10X Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP3994
12-well plate	Corning	3513
20X Transfer buffer	Thermo Fisher	NP00061
20X Tris-acetate SDS running buffer	Thermo Fisher	LA0041
3-8% Tris-Acetate gel	Thermo Fisher	EA0378BOX
75 cm2 flask	Corning	430641U
Antibiotic-Antimicotic 100X	Thermo Fisher	15240062
Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody	Developmental Studies Hybridome Bank	MF20 supernatant	Dilution 1:50
Antioxidant	Thermo Fisher	NP0005
BCA Protein Assay	Thermo Fisher	23227
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
DAPI	Thermo Fisher	D3571	Dilution 1:1000
Digitonin	Millipore Sigma	300410250MG
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate	Thermo Fisher	10569044
DNAse I set (250U)	Zymo Research Corporation	E1010
Doxycycline Hydrochloride	Fisher Scientific	BP2653-5
Dup2 human primers	Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3'	Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3'
Dystrophin antibody	Abcam	ab15277	Dilution 1:200
Fetal bovine serum	Thermo Fisher	16000
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A11001	Dilution 1:1000
Halt Protease inhibitor cocktail 100X	Thermo Fisher	78430
Hemocytometer	Hausser Scientific	3100
Hygromycin B	Thermo Fisher	10687010
IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Li-Cor	926-68071	Dilution 1:5000
Lab-Tek II CC2 chamber slide system	Thermo Fisher	15852
Laemmli	Bioworld	105700201
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher	L3000008
Matrigel GFR membrane matrix	Corning	354230
Methanol	Fisher Scientific	A412P-4
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher	51000001
Nitrocellulose membrane 0.45 µm	GE Healthcare Life Sciences	10600002
Normal Goat serum control	Thermo Fisher	10000C
Odyssey Blocking Buffer (PBS)	Li-Cor	927-40003	Blocking buffer for Western blot
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher	11058021
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PCR master mix	Thermo Fisher	K0172
Phosphatase inhibitor	Thermo Fisher	A32957
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio Rad	1610374
Puromycin	Thermo Fisher	A1113803
Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization	Li-Cor	926-11021
RevertAid kit	Thermo Fisher	K1691
RNA Clean & Concentrator-25	Zymo Research Corporation	R1018
Scalpels	Aspen Surgical	372611
Skeletal Muscle Cell Differentiation medium	Promocell	C23061
Skeletal Muscle Cell Growth medium	Promocell	C23060
Triton X-100	Acros Organics	215682500
TRIzol reagent	Thermo Fisher	15596026
Tween 20	Fisher Scientific	BP337500
Ultra low temperature freezer	Thermo Scientific	7402
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher	15575020
Vectashield antifade mounting medium	Vector Labs	H1000