Nöromüsküler Bozukluklar için Tedavileri Araştırmak için İnsan Fibroblastlarının Myoblastlara Doğrudan Yeniden Programlanması

Özet

Bu protokol, cilt fibroblastlarının miyoblastlara dönüşümünü ve farklılaşmalarını miyotüplere açıklar. Hücre hatları nöromüsküler bozukluğu olan hastalardan türetilmiştir ve patolojik mekanizmaları araştırmak ve terapötik stratejileri test etmek için kullanılabilir.

Özet

Kas distrofilerinde hem patofizyoloji hem de terapötik hedeflerle ilgili araştırmalar, insan miyoblastlarının sınırlı proliferatif kapasitesi ile engellenmiştir. Birkaç fare modeli oluşturulmuştur, ancak bunlar hastalığın insan fizyopatolojisini gerçekten temsil etmez veya insanlarda bulunan geniş mutasyon spektrumunu temsil etmez. İnsan birincil mioblastlarının ölümsüzleştirilmesi bu sınırlamaya bir alternatiftir; bununla birlikte, hala invaziv olan ve kolayca bulunmayan kas biyopsilerine bağlıdır. Buna karşılık, cilt biyopsilerinin elde etmesi daha kolaydır ve hastalara daha az invazivdir. Cilt biyopsilerinden elde edilen fibroblastlar ölümsüzleştirilebilir ve miyoblastlara dönüştürülerek mükemmel miyojenik potansiyele sahip bir hücre kaynağı sağlanabilir. Burada fibroblast'ın hızlı ve doğrudan yeniden programlanma yöntemini miyojenik bir soyun içine açıklıyoruz. Fibroblastlar iki lentivirüs ile transdüklenir: birincil kültürü ölümsüzleştirmek için hTERT ve doksiksin eklenmesi üzerine fibroblastların myoblastlara dönüştürülmesini ve daha sonra geç farklılaşma belirteçlerini ifade eden olgun myotube'ları indükleyen tet-indükleyici bir MYOD. Bu hızlı transdifferentiation protokolü patolojik mekanizmaları araştırmak ve nöromüsküler bozukluklar için yenilikçi gen bazlı veya farmakolojik biyoterapileri araştırmak için güçlü bir aracı temsil eder.

Giriş

Doğrudan insan dokularından elde edilen hücresel modeller, orijinal genomik bağlama sahip olmanın ve çoğu durumda hastalarda gözlenen aynı moleküler ve hücresel ayırt edici özelliklerin yeniden üretilmesinin avantajıyla birçok insan genetik bozukluğunu modellemek için yararlıdır. Nöromüsküler bozukluklar alanında, kas biyopsileri insan mioblastlarının büyük bir kaynağı olmuştur ve patolojik mekanizmaların aydınlatılmasında yardımcı olmuştur. Ek olarak, ilaçların ve gen tedavilerinin in vivo testi için önemli bir araçtır. Bir yandan, miyeoblastların kas parçalarından türetimi nispeten kolaydır. Öte yandan, birincil mioblastların kültürü ve bakımı, sınırlı çoğalma oranları ve replikatif senescence in vitro¹nedeniyle zordur. Bu sınırlamalar için bir alternatif, myoblastları insan telomerinin (hTERT) ve / veya sikline bağımlı kinaz 4 (CDK4) genlerinin yerleştirilmesi ile ölümsüzleştirmektir^2,3, iskelet kası özelliklerinin korunması ile⁴. Bununla birlikte, primer mioblastların obtensiyonu hala hastalara dezavantajları olan ve çoğu durumda kasları ileri dejenerasyonda olan cerrahi bir prosedür olan kas biyopsisine bağlıdır. Bu nedenle, bu hastaların kasları fibrotik ve/veya yağ dokusunun önemli bir kısmından oluşur ve daha az kas hücresi vererek hücrelerin daha önce ölümsüzleşmeye arındırılmasını gerektirir.

Kas biyopsilerinin aksine cilt biyopsileri daha erişilebilirdir ve hastalar için daha az zararlıdır. Primer fibroblastlar in vitrocilt parçalarından türetilebilir. Fibroblastlar öncelikle nöromüsküler bozukluklara neden olan mutasyonlardan etkilenmeseler de, miyoblastlara transdinafferentiated olabilirler. Bu, miyojenik düzenleyici transkripsiyon faktörü⁵olan Myod geninin yerleştirilmesiyle elde edilebilir. Bu yazıda, fibroblast kültürlerinin kurulmasından farklılaştırılmış miyotütlerin itaatine kadar transdiferansitasyonlu miyeoplastlar elde etme protokolünü açıklıyoruz (yöntemin temsili bir özeti Şekil 1'detasvir edildi).

Terapötik stratejilerin klinik öncesi testleri, insan hastalarda bulunan mutasyonlara benzer mutasyonlar taşıyan hücresel ve hayvan modellerine bağlıdır. Hayvan modellerinin geliştirilmesi CRISPR/Cas9⁶gibi gen düzenleme teknolojilerinin ilerlemesiyle daha uygulanabilir hale gelmesine rağmen, hala zorlu ve maliyetlidir. Bu nedenle, hasta kaynaklı hücre hatları, Duchenne kas distrofisi (DMD) gibi hastalığın geniş mutasyon spektrumunu kapsayan modellere sahip olmak için erişilebilir bir seçenektir. Hücre modellerinin geliştirilmesi ve oluşturulması, bu tür patolojiler için kişiselleştirilmiş tedavilerin geliştirilmesi için çok önemlidir.

Araştırılan kişiselleştirilmiş tedaviler arasında, ekson atlama stratejileri farklı kas distrofileri için umut verici olanlardan biridir^7,8. Bu strateji daha kısa ama fonksiyonel bir protein üretmekten oluşur. Bu, spliceosome'a ekson tanımı gizlenerek gerçekleştirilir, bu nedenle mutasyona uğramış ekson son haberciden hariç tutulur. Bu, DMD için FDA tarafından onaylanan çok umut verici bir teknolojidir. Bu nedenle, bu protokolde miyeoplastları iki farklı ekson atlama ile dönüştürme yöntemlerini de açıklıyoruz: antisense oligonükleotidler (AON) ve U7snRNA-adeno ilişkili virüs (AAV). AON transfection, ekson atlamayı teşvik etmek için tasarlanmış çeşitli dizilerin ilk gösterimi için iyi bir araçtır⁹. Ancak, AON'lerin etkinliği geçicidir. Antisense dizilerinin sürekli bir ifadesini elde etmek için, AAV ile birlikte küçük nükleer RNA'ları (snRNA'lar) araştırdık, nükleer lokalizasyona ve birleştirme makinelerine dahil edilmesine izin verdik¹⁰. U7, histone mRNA'nın işlenmesinde yer alan ve onu spliceosome'a yönlendirecek ve antisense dizileri sunacak proteinleri bağlamak için tasarlanmış bir^{snRNA'dır 11}. Değiştirilmiş U7 snRNA'larının AAV vektörleri ile birlikte kullanılması, AON'lerin sürekli bir ifadesi ve ilgi çekici dokuların daha iyi transdüksiyonu ile sonuçlanan AON sınırlamalarının üstesinden gelir¹². Ekson atlama stratejisini göstermek için bu protokol için DMD hastalarından elde edilen hücreleri kullanıyoruz.

Protokol

Tüm deneyler ve biyopsiler, Ülke Çapında Çocuk Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu'nun onayı altında ilgili kurumların etik kurallarına uyularak gerçekleştirildi.

1. Dermal fibroblast kültürünün başlatılması

1. Fibroblast kültürünün kurulması
   1. 15 mL konik tüplerde aliquot10mL fibroblast ortamı ( Tablo 1 ). Cilt biyopsisi bu ortama yerleştirilecek ve taşınmalıdır. Biyopsi, aynı gün tercihen işlenene kadar 4 °C'de saklanabilir.
      NOT: Potansiyel kontaminasyon büyümesini önlemek için cilt biyopsisini 24-36 saat içinde kullanın.
   2. Ortamı tüpten epire edin ve biyopsiyi 10 mL 1X PBS (oda sıcaklığı) ile üç kez durulayın. Üçüncü yıkamadan sonra PBS'yi tüpte bırakın.
   3. PBS'yi ve cildi 10 cm^2'lik bir tabağa dökün.
   4. Steril neşterler kullanarak biyopsiyi mümkün olduğunca küçük parçalar halinde kesin.
   5. Bir pipet kullanarak, tek bir cilt parçasını aktarın ve temiz bir 10 cm² kabına bırakın. Yemek başına 10 ila 12 parça yerleştirin.
   6. Pbs'in fazlalığını her parçanın etrafından epire edin. Parçayı aspire etmemeye dikkat edin.
   7. Bulaşıkları kısmen kapakla örtün ve cilt parçalarının 5-20 dakika kurumasını bekleyin. Parçaların aşırı kurumasına izin vermeyin.
   8. Parçalar kuruduktan sonra, kabı 45 derecede eğin ve yavaşça köşeye 12 mL fibroblast ortamı ekleyin. Çanağı 2007'den aşağı 2007'den bularak, parçaların medya tarafından kaldırılmaması için medyayı dikkatlice dağıtın.
   9. Bulaşıkları inkübatöre yerleştirin (37 °C, %5 CO_2). Medyayı 5-7 gün içinde ve haftada bir kez değiştirin.
   10. Parçadan çıkan fibroblastları gözlemleyin (Şekil 2) ve bir kez birleştiğinde, hücreleri 75 cm² şişeye geçin. Ortamı çıkarın, hücreleri PBS ile durulayın ve % 1 mL 0,25 trypsin ekleyin. 37 °C'de 5 dakika veya tüm hücreler kaldırılana kadar kuluçkaya yatır. Tripsin inhibe etmek ve hücreleri yeni bir şişeye aktarmak için 10 mL fibroblast büyüme ortamı ekleyin.
       NOT: Geçiş numarası isimlendirmesi için P1, deri biyopsisinden çıkan ilk fibroblastlar çoğalmak üzere yeni bir şişeye aktarıldığında kurulur.
2. Birincil fibroblast çizgilerinin kriyoprezervasyonu
   1. 75 cm² şişe birleştiğinde, 10 mL 1X PBS ile durulayın ve PBS'yi aspire edin.
   2. Hücre yüzeyine % 0,25 tripsin 3 mL ekleyin. Şişeyi 5 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. Hücrelerin kaldırılıp kaldırılmadığını görmek için mikroskop altındaki şişeleri kontrol edin. Değilse, şişeyi 5 dakika daha inkübatöre geri yerleştirin.
   3. Hücreler ayrıldıktan sonra, şişeye 7 mL fibroblast ortamı ekleyin ve hücreleri yeniden gerçekleştirmek için yukarı ve aşağı pipet ekleyin. Hücreleri 50 mL konik bir tüpe toplayın.
   4. 100 μL'lik trippan mavisi aliquot hazırlayın ve kriyoprezerserved olan numuneden 100 μL çıkarın, trippan mavisi ile karıştırın. Saymak için karışımı hemositometreye yükleyin. Mikroskop altında hemositometrenin dört farklı alanında hücreleri sayın. Toplam hücre sayısını hesaplamak için şu formülü kullanın: (sayılan hücreler/100) * kültür hacmi.
   5. Konik tüpleri oda sıcaklığında veya 4 °C'de 10 dakika boyunca 300 x g'da döndürün.
   6. Ortamı aspire edin ve hücreleri yeterli donma ortamı hacminde yeniden biriktirin: her 1 milyon hücre/şişe başına 1 mL. Homojenize etmek ve etiketli her cryovial'a 1 mL dağıtmak için pipet yukarı ve aşağı.
   7. Şişeleri dondurma kutusuna yerleştirin ve şişelerin bir gecede -80 °C dondurucuda 1 °C/dk hızında donmasını bırakın.
   8. Ertesi gün şişeleri sıvı bir azot tankına veya -150 °C dondurucuya aktarın.

2. FibroMyoblasts (FM) hücre hattının kurulması

1. Tohum birincil fibroblastları, ertesi gün yaklaşık% 50 izne sahip olmak için 12 kuyulu bir plakanın iki kuyusunda⁽² x 10 4 hücre / kuyu) izdiahın yaklaşık% 30'undadır.
2. Lentiviral transdüksiyon için, 400 μL fibroblast ortamında hTERT-puromycin lentivirus'un 2 ila 5 x 10⁹ vg'lik (viral genom parçacıkları) ekleyin. İkinci kuyuya sadece 400 μL fibroblast ortamı ekleyin. Ertesi gün 1 mL ortam ekleyin.
   NOT: Lentivirüs üretimi için plazmidler Chaouch ve ark. Ayrıca, MyoD plazmid tasarımı için kullanılan Tet-on sistemi için hTERT plasmid ve Barde ve diğerleriiçin 2007^13, Aure veark. Genethon, Fransa ile yapılan Malzeme Transfer Anlaşması sayesinde elde edildiler (lütfen bu plazmidleri elde etmek için Dr. Vincent Mouly ile iletişime geçin - vincent.mouly@upmc.fr). Kısaca, hTERT bir CMV promotörü tarafından tahrik edilen hTERT varyant 1'den oluşurken, puromycin bir PGK promotörü tarafından tahrik edilir. MyoD plazmid, represör rtTA2'nin kontrolü altındaki bir CMV promotörü tarafından tahrik edilen bir MyoD varyantı 1 içerir. Bu plazmid ayrıca SV40 promotörü sayesinde ifade edilen hygromycin seçimini de içerir.
   Lentivirüsler düzenli lentiviral üretim kullanılarak üretildi (bkz. Wang ve McManus JoVe protokolü^15). Kısaca, MDL-helper, Rev-Helper, SVS-G-helper, hTERT veya MyoD plazmidlerinin kalsiyum klorür yağışı yoluyla trans enfekte edildi. 48 saat sonra, süpernatant toplandı ve daha sonra üç gün daha. Tüm süpernatantlar daha sonra ultrasantrifüjleme ile yoğunlaştı. Pelet daha sonra Tris-HCL +NaCl+EDTA arabelleğine yeniden kaldırıldı. Titer tahmini standart lentivirüs qPCR tahlili ile değerlendirildi.
3. Bir veya iki gün sonra, hücreleri 6 kuyulu bir tabağa aktarın ve% 60-70 izdihama ulaşana kadar yetiştirin.
4. Fibroblast ortamını 1 μg/mL puromycin ile destekleyin ve her kuyuya 2 mL ekleyin.
5. Kontrol kuyusundaki tüm hücreler ölene kadar (12 güne kadar) hücreleri seçim altında tutun ve her 2-3 günde bir ortam değiştirin. Daha fazla çoğalma için hücreleri 6 kuyulu plakadan iki adet 10 cm² tabağa alın.
6. Seçimden sonra fibroblast şişelerini dondurun. F(hTer) olarak etiketle.
7. Tohum hTERT ifade fibroblastları (F(hTer)) fibroblast ortamında yaklaşık% 30 izdihamda, 12 kuyulu bir plakanın iki kuyusunda, ertesi gün yaklaşık% 50 izdihama sahip olmak.
8. Lentivirüs transdüksiyon için, 400 μl fibroblast ortamında 2 ila 5 x^{10 9} vg MyoD-hygromycinB lentivirus karıştırın ve ilgili kuyulara ekleyin; üçüncü kuyuya 400 μl fibroblast ortamı ekleyin. Ertesi gün 1 mL orta ekleyin.
9. Bir veya iki gün sonra hücreleri 6 kuyulu bir tabağa aktarın ve% 60-70 izdihama kadar büyüyün.
10. Fibroblast büyüme ortamını higromisinin B (400 μg/mL) ile tamamla ve her kuyuya 2 mL ekleyin.
11. Kontrol kuyusundaki tüm hücreler ölene kadar (12 güne kadar) hücreleri seçim altında tutun ve her 2-3 günde bir ortam değiştirin.
12. Seçimden sonra fibroblast şişelerini dondurun. FM olarak etiket ve ardından hücre kimlik numarası/adı.

3. Transdifferentiation protokolü

1. Tohum, FM'i% 30-40 izdihamla 10 cm² tabağa aktarır. 12 kuyulu bir tabakta, tohum 6 x 10⁴ hücre (bu bireysel hücre hattına bağlıdır).
   NOT: İmmünasyon için, matrigel ile kaplanmış cam örtülere veya oda kaydıraklarına tohum hücreleri. Matrigel'i 1:10'da DMEM ortamında seyreltin, yüzeyi kaplayacak kadar bir hacim ekleyin ve slaytların bir saat oda sıcaklığında oturmasına izin verin. Hücreleri tohumlamadan hemen önce aspire edin.
2. Myoblasts indüksiyonu için, fibroblastlar% 70 izdihama ulaştığında (Şekil 3A), hücre yüzeyini PBS ile durulayın ve taze 8 μg / mL doksiklin ile desteklenmiş taze miyoblast ortamı ekleyin.
   NOT: Farklılaşmanın başarısı %80'lik bir aradan sonra tehlikeye girer.
3. İki ila üç gün sonra, hücreler% 90-95 birliktedir ve morfolojileri değişmiş olacaktır (Şekil 3B). Hücre yüzeyini PBS ile durulayın ve taze 8 μg/mL doksiksin ile desteklenmiş taze farklılaşma ortamı ekleyin.
4. Miyotütler kurulana kadar her 2-3 günde bir medya değiştirmeye devam edin (morfoloji ile onaylayın) (Şekil 3C).
5. Miyotube farklılaşmasına başladıktan yedi ila on gün sonra, hücreler tamamen farklılaştırılmalı ve kopmaya veya ölmeye başlayabilir. Bu olmadan önce, daha fazla analiz için miyotüpleri hasat edin.
   NOT: Miyotüt oluşumunun zaman seyri hücre hattına bağlıdır. Kasla ilişkili proteinlerdeki mutasyonlar miyojenik potansiyeli etkileyebilir. Miyotüpler parlak görünmeye ve sınırlarda beyaz görünmeye başladığında, ayırmaya başladıkları bir sinyaldir (Şekil 4).
6. Miyotüpleri toplamak için medya toplayın ve 50 mL konik bir tüpe aktarın. Ortam, ayrılmış miyotüpler içerebilir.
7. Miyotütleri 5 mL PBS ile durulayın ve PBS'yi 50 mL tüpe aktarın.
8. Hücre yüzeyine % 0,25 tripsin 3 mL ekleyin. Yemeği 5 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. Hücrelerin kaldırılıp kaldırılmadığını görmek için mikroskop altındaki kabı kontrol edin. Değilse, 5 dakika daha inkübatöre geri yerleştirin.
9. Hücreler ayrıldıktan sonra, çanağa 7 mL fibroblast ortamı ekleyin ve hücreleri yeniden çıkarmak için pipet yukarı ve aşağı ekleyin. Hücreleri 50 mL konik tüpe toplayın.
10. 4 °C'de 7 dakika boyunca 1.200 x g'da santrifüj.
11. Peletin rahatsız etmeden sıvıyı dikkatlice epire edin. Peletleri bir sonraki işleme kadar -80 °C'de saklayın.

4. Farklılaştırılmış miyotüplerin immünostaining

NOT: İmmün yetinme için, hücreleri yukarıda belirtildiği gibi cam kapaklarda veya oda slaytlarında büyütün.

1. Miyotube'lar tamamen farklılaştıktan sonra, ortamı aspire edin ve slaytları PBS ile dikkatlice durulayın. PBS'i aspire edin.
2. Taze %4 PFA (12 kuyu plakasının kuyusu başına 500 μL) ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. PFA'yı aspire edin.
3. 1 mL PBS ile durulayın.
4. Oda sıcaklığında 0,2 M glisin ile 10 dakika kuluçkaya yatır. Glisini aspire edin.
5. PBS% 0.5 TritonX-100 (12 kuyu plakasının 300 μL / kuyusu) ile hafif ajitasyon ile 10 dakika boyunca permeabilize edin.
6. Nazik ajitasyon ile 10 dakika boyunca 300 μL / iyi bloklama çözeltisi ile blok.
7. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca, hafifçe sallanarak, 300 μL blokaj çözeltisinde 1:50 seyreltilmiş birincil antikorla kuluçkaya yatırın.
8. 5 dakika boyunca 1 mL / kuyu PBS ile üç kez durulayın, hafifçe sallayın.
9. İkincil antikor ile 300 μL blokaj çözeltisinde 1:500 seyreltilmiş, oda sıcaklığında 1 saat boyunca hafifçe sallanarak kuluçkalayın. Plakayı alüminyum folyo ile örtün.
10. 5 dakika boyunca 1 mL / kuyu PBS ile üç kez durulayın, hafifçe sallayın.
11. PBS'de 10 dakika seyreltilmiş DAPI ile kuluçkaya yatır. 1 mL/kuyu PBS ile üç kez durulayın.
12. Cam slayda bir damla montaj ortamı ekleyin. Kapak kapağını uzunlatır ve montaj ortamının damlasına yüzüstü yerleştirin.
13. Slaytı bir kağıt havluya ters çevirin ve kabarcıkları ve montaj ortamının fazlalığını gidermek için hafifçe bastırın.
14. Slaytları oje ile kapatın ve görüntülemeye kadar 4 °C'de saklayın.

5. Antisense oligonükleotid transfeksiyon

NOT: Aşağıdaki protokol 6 kuyulu bir plakanın transfection içindir. Daha küçük veya daha büyük plakalar için hacimleri buna göre ayarlayın. Transfeksiyon, hücreler farklılaşma adımına hazır olduğunda% 100 birikme mioblastlarında yapılır.

1. Myoblast büyüme medyasını epire edin ve hücreleri 1 mL PBS ile durulayın.
2. 500 μL/kuyu OptiMEM ortamı ekleyin ve 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
3. Antisense oligonükleotidini (AON) 100 μL OptiMEM'de istenen son konsantrasyona (yani 50 nM, 100 nM, 200 nM, 500 nM) seyreltin. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatır.
   NOT: Bu protokol 2'ometil-fosforothioate AON'ler için optimize edilmiştir.
4. Lipofeklamini OptiMEM (100 μL'lik son hacim) ile karıştırarak 1:1 (μg DNA: μL lipofectamin) nihai oranını verin. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatır.
5. Seyreltilmiş lipofeklamin ile seyreltilmiş AON'ı birleştirin. Pipetleme ile hafifçe karıştırın ve karmaşık oluşuma izin vermek için oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın. Hava kabarcıklarından kaçının.
6. İlgili kuyulara 200 μL lipofeklamin ve AON karışımı ekleyin. Hücreleri gece boyunca 37 °C, %5 CO_2'dekuluçkaya yatırın.
7. Ertesi gün transfeksiyon karışımını çıkarın ve doksiksin ile desteklenmiş 2 mL sıcak farklılaşma ortamı ekleyin.
8. Hücreleri en az üç gün sonra RNA ekstraksiyonu için veya protein analizi durumunda yedi ila 21 gün toplayın.
   NOT: RNA ve/veya protein ekspresyonunu tespit etmek için gerekli farklılaşma günleri, ilgi genine veya hücre çizgisine göre değişebilir. Durumunda DMD, mRNA'sını üç gün içinde tespit etmek mümkündür. Distrofin proteini tespiti en az yedi gün sürer. Bu, hücre hattına bağlı olarak değişir. Yüksek konsantrasyonlarda AON ve transfeksiyon reaktifi transdifferentiasyonu etkileyebilir.

6. AAV1-U7 transdüksiyonu

NOT: Bu protokol 6 kuyulu plakalar için optimize edilmiştir. Hacimleri kültür yüzey alanına orantılı olarak ayarlayın. Transdüksiyon, hücreler farklılaşma adımına hazır olduğunda% 100 birikmiş mioblastlarda yapılır. AAV1, kültürlü mioblastların en iyi transdüksiyon kapasitesine sahip AAV serotiptir.

1. Myoblast büyüme ortamını epire edin ve hücreleri 1 mL PBS ile durulayın.
2. 0.5-1 x 10¹¹ viral AAV1-U7 parçacıklarını doksiksin ile desteklenmiş 700 μL sıcak farklılaşma medyasında seyreltin.
   NOT: Viral konsantrasyonu belirlemek için qPCR kullanıyoruz. Kullanılacak virüs miktarı nicelik yöntemine bağlı olarak değişebilir ve daha önce bir muhabir tahlili kullanılarak belirlenmelidir.
3. Viral karışımı homojen bir şekilde bırakarak kuyuya ekleyin.
4. Ertesi gün, doksiksin ile desteklenmiş 1,3 mL sıcak farklılaşma ortamı ekleyin.
5. Hücreleri en az üç gün sonra RNA ekstraksiyonu için veya protein analizi durumunda yedi ila 21 gün toplayın.

7. RNA ekstraksiyonu

NOT: Bu adım sırasında kullanılan tüm malzemeler RNase içermemelidir.

1. Pelet başına 500 μL TRIzol ekleyin ve hücrelerin homojen bir şekilde lise olmasını sağlamak için birkaç kez yukarı ve aşağı borulayın.
2. Hücre lysate'yi 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
3. 100 μL kloroform ekleyin ve 15 sn boyunca manuel olarak çalkalayın. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatır.
4. 4 °C'de 15 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüj. Sulu fazı (üst bir) toplayın ve yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.
5. Sulu fazın 1 hacmi için, % 100 1 hacim etanol ekleyin ve pipetleme ile karıştırın.
   NOT: Kolon saflaştırma ve konsantrasyon öneririz.
6. Örneği bir toplama tüpündeki Zymo-Spin IC sütununa ve 30 sn için 12.000 x g'da santrifüje aktarın. Akışı atın.
7. Sütun içi DNase I sindirimi için, sütunu 400 μL RNA Yıkama Tamponu ile önceden yıkayın. 30 sn için 12.000 x g'da santrifüj. Akışı atın.
8. Numune başına 40 μL DNase reaksiyon karışımı hazırlayın. 5 μL DNase I'i 35 μL DNA Sindirim Tamponu ile karıştırın.
9. Karışımı doğrudan sütun matrisine ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatır.
10. Sütuna 400 μL RNA Hazırlık Tamponu ekleyin ve 30 sn için 12.000 x g'da santrifüj ekleyin. Akışı atın.
11. Kolona 700 μL RNA Yıkama Tamponu ekleyin ve 30 s için 12.000 x g'da santrifüj ekleyin. Akışı atın.
12. Kolona 400 μL RNA Yıkama Tamponu ekleyin ve yıkama tamponunun tamamen çıkarılmasını sağlamak için 2 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüj ekleyin. Sütunu RNase içermeyen 1,5mL tüpe dikkatlice aktarın.
13. Sütun matrisine doğrudan 15 μL çekirdeksiz su ekleyin. 5 dakika kuluçkaya yatır ve 1 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüj.
    NOT: Elde edilen RNA'yı toplayın ve verimi artırmak için sütuna tekrar uygulayın. 1 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüj.
14. Örnekleri buza yerleştirin ve örnekleri bir Nanodrop'ta ölçün.
15. Numuneleri -80 °C'de saklayın.

8. RT-PCR analizi

NOT: Bu adımda, distrofin mRNA'nın ekspresyonunu tespit etmek için reaktiflerin bir önerisini sunuyoruz, ancak tercih edilen diğer reaktiflere kolayca uyarlanabilir.

1. Ters transkripsiyon
   1. Tüm reaktifleri çözün ve buzda tutun.
   2. 4 μL 5x Reaksiyon Tamponu, 2 μL dNTP Mix (10 mM), 1 μL RiboLock RNase Inhibitörü ve 1 μL RevertAid RT ile bir karışım hazırlayın.
   3. Tüpü hafifçe karıştırın ve santrifüjü kısa bir süre karıştırın.
   4. 0,2 mL PCR tüplerinde, reaksiyon başına 1 μg'ye sahip olmak için yeterli RNA hacmini ekleyin. Nükleaz içermeyen su ekleyin q.s.p 12 μL. Negatif kontrol olarak ters transkriptaz olmadan bir tüp ve RNA yerine nükleaz içermeyen su içeren bir tüp ekleyin.
   5. Tüp başına 8 μL reaksiyon karışımı dağıtın. Toplam hacim 20 μL'dir.
   6. Tüpleri bir termosit içine yerleştirin ve 25 °C'de 5 dakika, ardından 42 °C'de 60 dakika kuluçkaya yatırın. Reaksiyonun 70 °C'de 5 dakika ısıtılmasıyla durdurun.
   7. Daha uzun depolama için tüpleri buza veya -20 °C'ye yerleştirin.
2. Pcr
   NOT: Eksons kavşaklarında tercihen astarlar tasarlayin.
   1. Vortex yeniden reaktifleri ve kullanmadan önce aşağı döner.
   2. Numune başına 0,5 μL ileri astar (25 μM), 0,5 μL ters astar (25 μM), 12,5 μL 2x PCR Master Mix ve 8,5 μL çekirdeksiz su kullanarak bir ana karışım hazırlayın.
   3. Aliquot 22 μL ana karışım her örnek için bir tüp içine.
   4. İlgili PCR tüpüne 3 μL cDNA (150 ng) ekleyin. PCR negatif kontrol tüpüne 3 μL çekirdeksiz su ekleyin.
   5. Girdap ve PCR tüpleri aşağı döndürün.
   6. Tüpleri 95 °C'de 3 dakika, 95 °C'de 30 s, (Tm-5) °C'de 30 sn, 72 °C'de (1 dk/kb) 34 kez, 72 °C'de 5 dakika kuluçkaya yaslayın.
      NOT: En uygun tavlama sıcaklığı ampirik olarak belirlenebilir. Önerilen ana karışım için astar erime sıcaklığından 5 °C çıkarın.
   7. Agarose jel üzerine 12 μL PCR reaksiyonu yükleyin ve numuneleri -20 °C'de dondurun.

9. Batı Blotting tarafından distrofin ifadesinin tespiti

NOT: Bu protokol, büyük bir membran proteini olan distrofin için optimize edilmiştir. Farklı proteinler için özel koşullar gerekebilir.

1. Protein ekstraksiyonu
   1. 7-21 günlük farklılaşmadan sonra, 100 μL 0,5 M EDTA ve 50 μL proteaz inhibitörleri ile 5 mL PBS ile hücreleri toplayın. Hücreler kopana kadar 37 °C'de kuluçkaya yaslanın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 1.200 x g'da santrifüj. Tüpü sıvı nitrojene batırarak peletin dondurun. Peletin -80 °C'de saklayın veya liziz adımına geçin.
   2. Digitonin%1'ini, %1 proteaz inhibitörünü, %10 fosfataz inhibitörünü ve baz tamponu toplam hacme (hücre pelet başına 60 μL) ekleyerek lizis tamponu hazırlayın.
   3. Hücre peletine 60 μL lizis tamponu ekleyin, buz üzerinde. 5 sn için sonicate. 8 sn buzun üzerinde otur. Sonication ve dinlenme adımlarını iki kez tekrarlayın.
   4. Örnekleri 30 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatır.
   5. 4 °C'de 20 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüj.
   6. Süpernatant temiz tüplere aktarın.
   7. Numuneleri, üretici talimatlarını izleyerek bicinchoninic acid (BCA) testine göre ölçün.
   8. Protein çözeltisini uygun hacimli Laemmli tamponu ile karıştırın. 100 μg'lik aliquots yapın. Gerekirse, tabanı liziz tamponu ile hacmi 25 μl'ye ayarlayın. Numuneleri -80 °C'de saklayın.
2. Batı şişkinliği
   1. Buzdaki örnekleri eritin.
   2. Numuneleri 100 °C'de 5 dakika denatüre edin, sonra buzda soğutun, aşağı döndürün.
   3. 200 mL dH 2 O'da 20X Tris-asetat SDS çalışma tamponunu seyreltin ve₅₀₀μL antioksidan ekleyin.
   4. Tarağı çıkararak ve dH₂O ile durulayarak% 3-8 Tris-asetat poliakrilamid jelini hazırlayın. İç bölmeyi çalışan arabellekle doldurun.
   5. Jelde 5 μL protein merdiveni ve 25 μL numune yükleyin. Dış bölmeyi çalışan arabellekle doldurun.
   6. 4 °C'de 1 saat boyunca 80 V'ta çalıştırın. Sonra, 4 °C'de 2 saat için 120 V'ta.
   7. 150 mL 20X metanol, 150 mL 20X transfer tamponu ve 2.700 mL dH 2 O ile 3 L_1Xtransfer tamponu hazırlayın.
   8. 4 adet filtre kağıdı ve bir parça nitroselüloz membran kesin. Kağıt filtreyi ve zarı transfer tamponlu bir tepsiye batırın.
   9. Jeli kasadan hafifçe çıkarın ve filtre kağıdı, membran ve süngerlerle transfer aparatında monte edin. Jel negatif tarafa, zar ise pozitif tarafa yerleştirilir.
   10. Transferi 300 mA'da çalıştırın, karıştırın, 4 °C'de, gece boyunca.
   11. Membranı oda sıcaklığında hafif ajitasyonla 1 saat boyunca 10 mL blokaj tamponunda engelleyin.
   12. 10 mL blokaj tamponu ve 50 μL distrofin antikoru (1:200) ile primer antikor çözeltisi hazırlayın.
   13. Engelleme tamponu atın ve birincil antikor çözeltisini ekleyin. Oda sıcaklığında en az 2 saat veya 4 °C'de gece boyunca hafif ajitasyonla kuluçkaya yatırın.
   14. Membranı% 0.1 Ara PBS ile üç kez, hafif ajitasyonla 5 dakika durulayın.
   15. 10 mL blokaj çözeltisi, 2 μL anti-tavşan antikor (1:5000) ve 20 μL% 0,2 Ara kullanarak ikincil antikor çözeltisi hazırlayın.
   16. membrana ikincil antikor çözeltisini ekleyin. Işıktan korumak için alüminyum folyo ile kaplı nazik ajitasyon ile 1 saat kuluçkaya yatın.
   17. Antikor çözeltisini atın ve membranı% 0.1 Ara PBS ile 3 kez durulayın, hafif ajitasyonla 5 dakika boyunca ışıktan korunun.
   18. Bir görüntüleme cihazındaki zarı pozlama ve görüntüleme.
   19. Toplam protein için membranı, üretici talimatlarına uyarak Revert 700 Total Protein lekesi ile lekelendirin.
       NOT: Batı şişkinliği ile distrofin tespiti hastanın yaşına/mutasyonuna ve hücrenin yeterli distrofin biriktirmek için yeterli zaman kaynaşması ve bağlı kalabilmesine bağlıdır.

Sonuçlar

Bu protokol, insan derisinden türetilmiş fibroblast kültürlerinin nasıl kurulup mioblastlara ve daha sonra farklılaştırılmış miyotüplere nasıl dönüştürülür olduğunu göstermektedir. Bu tür hücre hattı nöromüsküler bozuklukların incelenmesi ve potansiyel tedavilerin in vitro testi için son derece yararlıdır.

Fibroblast dönüşümünün şematik bir gösterimi Şekil 1'de gösterilmiştir. Şekil 2A

Tartışmalar

FM hücre hatlarını kaliteli elde etmek için bazı adımlar kritik öneme sahiptir. Cilt biyopsisi ne kadar erken işlenirse, sağlıklı fibroblast elde etme şansı o kadar artar. Fibroblast kültürlerinin geçiş sayısı da önemlidir. Birincil hücreler sınırlı proliferatif kapasiteye sahiptir ve birçok geçitten sonra çoğaltıcı senescence girerler. Bu nedenle, düşük bir geçiş sayısında fibroblast stoğuna sahip olmak ve hücreleri mümkün olan en erken geçişte dönüştürmek daha iyidir.

...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm dish	Corning	430167
0.25% Trypsin-EDTA, phenol red	Thermo Fisher	2500056
10X Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP3994
12-well plate	Corning	3513
20X Transfer buffer	Thermo Fisher	NP00061
20X Tris-acetate SDS running buffer	Thermo Fisher	LA0041
3-8% Tris-Acetate gel	Thermo Fisher	EA0378BOX
75 cm2 flask	Corning	430641U
Antibiotic-Antimicotic 100X	Thermo Fisher	15240062
Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody	Developmental Studies Hybridome Bank	MF20 supernatant	Dilution 1:50
Antioxidant	Thermo Fisher	NP0005
BCA Protein Assay	Thermo Fisher	23227
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
DAPI	Thermo Fisher	D3571	Dilution 1:1000
Digitonin	Millipore Sigma	300410250MG
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate	Thermo Fisher	10569044
DNAse I set (250U)	Zymo Research Corporation	E1010
Doxycycline Hydrochloride	Fisher Scientific	BP2653-5
Dup2 human primers	Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3'	Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3'
Dystrophin antibody	Abcam	ab15277	Dilution 1:200
Fetal bovine serum	Thermo Fisher	16000
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A11001	Dilution 1:1000
Halt Protease inhibitor cocktail 100X	Thermo Fisher	78430
Hemocytometer	Hausser Scientific	3100
Hygromycin B	Thermo Fisher	10687010
IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Li-Cor	926-68071	Dilution 1:5000
Lab-Tek II CC2 chamber slide system	Thermo Fisher	15852
Laemmli	Bioworld	105700201
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher	L3000008
Matrigel GFR membrane matrix	Corning	354230
Methanol	Fisher Scientific	A412P-4
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher	51000001
Nitrocellulose membrane 0.45 µm	GE Healthcare Life Sciences	10600002
Normal Goat serum control	Thermo Fisher	10000C
Odyssey Blocking Buffer (PBS)	Li-Cor	927-40003	Blocking buffer for Western blot
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher	11058021
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PCR master mix	Thermo Fisher	K0172
Phosphatase inhibitor	Thermo Fisher	A32957
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio Rad	1610374
Puromycin	Thermo Fisher	A1113803
Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization	Li-Cor	926-11021
RevertAid kit	Thermo Fisher	K1691
RNA Clean & Concentrator-25	Zymo Research Corporation	R1018
Scalpels	Aspen Surgical	372611
Skeletal Muscle Cell Differentiation medium	Promocell	C23061
Skeletal Muscle Cell Growth medium	Promocell	C23060
Triton X-100	Acros Organics	215682500
TRIzol reagent	Thermo Fisher	15596026
Tween 20	Fisher Scientific	BP337500
Ultra low temperature freezer	Thermo Scientific	7402
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher	15575020
Vectashield antifade mounting medium	Vector Labs	H1000