Riprogrammazione diretta dei fibroblasti umani in mioblasti per indagare le terapie per i disturbi neuromuscolari

Riepilogo

Questo protocollo descrive la conversione dei fibroblasti cutanei in mioblasti e la loro differenziazione in miotubi. Le linee cellulari sono derivate da pazienti con disturbi neuromuscolari e possono essere utilizzate per indagare meccanismi patologici e testare strategie terapeutiche.

Abstract

Le indagini sia sulla fisiopatologia che sugli obiettivi terapeutici nelle distrofie muscolari sono state ostacolate dalla limitata capacità proliferativa dei mioblasti umani. Sono stati creati diversi modelli di topi, ma non rappresentano veramente la fisiopatologia umana della malattia o non sono rappresentativi dell'ampio spettro di mutazioni presenti nell'uomo. L'immortalizzazione dei mioblasti primari umani è un'alternativa a questa limitazione; tuttavia, dipende ancora dalle biopsie muscolari, che sono invasive e non facilmente disponibili. Al contrario, le biopsie cutanee sono più facili da ottenere e meno invasive per i pazienti. I fibroblasti derivati dalle biopsie cutanee possono essere immortalati e transdifferenziati in mioblasti, fornendo una fonte di cellule con un eccellente potenziale miogenico. Qui descriviamo un metodo di riprogrammazione rapido e diretto del fibroblasto in un lignaggio miogenico. I fibroblasti vengono trasdotti con due lentivirus: hTERT per immortalare la coltura primaria e un MYODtet-inducibile , che con l'aggiunta di doxiciclina, induce la conversione dei fibroblasti in mioblasti e poi miotubi maturi, che esprimono marcatori di differenziazione tardiva. Questo protocollo di transdifferenziazione rapida rappresenta un potente strumento per indagare i meccanismi patologici e studiare bioterapie innovative a base genica o farmacologica per disturbi neuromuscolari.

Introduzione

I modelli cellulari ottenuti direttamente dai tessuti umani sono utili per modellare molti disturbi genetici umani, con il vantaggio di avere il contesto genomico originale e, in molti casi, riprodurre gli stessi tratti distintivi molecolari e cellulari osservati nei pazienti. Nel campo dei disturbi neuromuscolari, le biopsie muscolari sono state una grande fonte di mioblasti umani e hanno contribuito alla spiegazione dei meccanismi patologici. Inoltre, sono uno strumento importante per il test in vivo di farmaci e terapie geniche. Da un lato, la derivazione dei mioblasti dai frammenti muscolari è relativamente facile. D'altra parte, la coltura e il mantenime....

Protocollo

Tutti gli esperimenti e le biopsie sono stati effettuati seguendo le regole etiche delle istituzioni coinvolte sotto l'approvazione del Nationwide Children's Hospital Institutional Review Board.

1. Inizio della coltura di fibroblasti dermici

1. Istituzione della cultura dei fibroblasti
   1. Aliquota 10 mL di mezzo fibroblasto(tabella 1)in tubi conici da 15 ml. La biopsia cutanea deve essere posizionata e trasportata in questo mezzo. La biopsia può essere conservata a 4 °C fino a quando non viene lavorata, preferenzialmente lo stesso giorno.
      NOTA: Utilizzare la biopsia cutanea entro 24-36 ore per evitare una pot....

Risultati

Questo protocollo mostra come stabilire colture di fibroblasti derivati dalla pelle umana e convertirle in mioblasti e quindi in miotubi differenziati. Questo tipo di linea cellulare è estremamente utile per lo studio dei disturbi neuromuscolari e il test in vitro di potenziali terapie.

Una rappresentazione schematica della conversione dei fibroblasti è illustrata nella figura 1. La figura 2A mostra un frammento di pelle e .......

Discussione

Per ottenere linee cellulari FM di buona qualità, alcuni passaggi sono fondamentali. Prima viene elaborata la biopsia cutanea, maggiori sono le probabilità di ottenere fibroblasti sani. Anche il numero di passaggi delle colture di fibroblasti è importante. Le cellule primarie hanno una capacità proliferativa limitata e dopo molti passaggi, entrano in senescenza replicativa. Pertanto, è meglio avere uno stock di fibroblasti a un basso numero di passaggi e trasformare le cellule al primo passaggio possibile.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm dish	Corning	430167
0.25% Trypsin-EDTA, phenol red	Thermo Fisher	2500056
10X Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP3994
12-well plate	Corning	3513
20X Transfer buffer	Thermo Fisher	NP00061
20X Tris-acetate SDS running buffer	Thermo Fisher	LA0041
3-8% Tris-Acetate gel	Thermo Fisher	EA0378BOX
75 cm2 flask	Corning	430641U
Antibiotic-Antimicotic 100X	Thermo Fisher	15240062
Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody	Developmental Studies Hybridome Bank	MF20 supernatant	Dilution 1:50
Antioxidant	Thermo Fisher	NP0005
BCA Protein Assay	Thermo Fisher	23227
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
DAPI	Thermo Fisher	D3571	Dilution 1:1000
Digitonin	Millipore Sigma	300410250MG
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate	Thermo Fisher	10569044
DNAse I set (250U)	Zymo Research Corporation	E1010
Doxycycline Hydrochloride	Fisher Scientific	BP2653-5
Dup2 human primers	Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3'	Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3'
Dystrophin antibody	Abcam	ab15277	Dilution 1:200
Fetal bovine serum	Thermo Fisher	16000
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A11001	Dilution 1:1000
Halt Protease inhibitor cocktail 100X	Thermo Fisher	78430
Hemocytometer	Hausser Scientific	3100
Hygromycin B	Thermo Fisher	10687010
IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Li-Cor	926-68071	Dilution 1:5000
Lab-Tek II CC2 chamber slide system	Thermo Fisher	15852
Laemmli	Bioworld	105700201
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher	L3000008
Matrigel GFR membrane matrix	Corning	354230
Methanol	Fisher Scientific	A412P-4
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher	51000001
Nitrocellulose membrane 0.45 µm	GE Healthcare Life Sciences	10600002
Normal Goat serum control	Thermo Fisher	10000C
Odyssey Blocking Buffer (PBS)	Li-Cor	927-40003	Blocking buffer for Western blot
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher	11058021
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PCR master mix	Thermo Fisher	K0172
Phosphatase inhibitor	Thermo Fisher	A32957
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio Rad	1610374
Puromycin	Thermo Fisher	A1113803
Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization	Li-Cor	926-11021
RevertAid kit	Thermo Fisher	K1691
RNA Clean & Concentrator-25	Zymo Research Corporation	R1018
Scalpels	Aspen Surgical	372611
Skeletal Muscle Cell Differentiation medium	Promocell	C23061
Skeletal Muscle Cell Growth medium	Promocell	C23060
Triton X-100	Acros Organics	215682500
TRIzol reagent	Thermo Fisher	15596026
Tween 20	Fisher Scientific	BP337500
Ultra low temperature freezer	Thermo Scientific	7402
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher	15575020
Vectashield antifade mounting medium	Vector Labs	H1000