תכנות ישיר של פיברובלסטים אנושיים למיובלסטים כדי לחקור טיפולים להפרעות נוירומוסקולריות

Summary

פרוטוקול זה מתאר את ההמרה של פיברובלסטים בעור לתוך myoblasts ואת הבידול שלהם myotubes. קווי התאים נגזרים מחולים עם הפרעות נוירומוסקולריות וניתן להשתמש בהם כדי לחקור מנגנונים פתולוגיים ולבדוק אסטרטגיות טיפוליות.

Abstract

חקירות הן של הפתופיזיולוגיה והן של המטרות הטיפוליות בדיסטרופיות שרירים נבלמו על ידי היכולת המרובית המוגבלת של מיובלסטים אנושיים. מספר מודלים של עכברים נוצרו אך הם אינם מייצגים באמת את הפיזיופתולוגיה האנושית של המחלה או שאינם מייצגים את הספקטרום הרחב של מוטציות שנמצאו בבני אדם. הנצחת המיובלסטים העיקריים האנושיים היא חלופה למגבלה זו; עם זאת, הוא עדיין תלוי ביופסיות שרירים, אשר פולשניים ולא זמין בקלות. לעומת זאת, ביופסיות עור קלות יותר להשגה ופחות פולשניות לחולים. פיברובלסטים המופקים מביופסיות עור ניתן להנציח ולהשתנות לתוך myoblasts, מתן מקור של תאים עם פוטנציאל מיוגני מעולה. כאן, אנו מתארים שיטת תכנות מחדש מהירה וישירה של פיברובלסט לשושלת מיוגנית. Fibroblasts הם transduced עם שני lentiviruses: hTERT כדי להנציח את התרבות העיקרית ואת MYODפטיש, אשר על תוספת של דוקסיציקלין, גורם ההמרה של fibroblasts לתוך myoblasts ולאחר מכן myotubes בוגרת, אשר מבטאים סמני בידול מאוחר. פרוטוקול transdifferentiation מהיר זה מייצג כלי רב עוצמה לחקור מנגנונים פתולוגיים ולחקור ביותרפיות חדשניות מבוססות גנים או תרופתיות להפרעות נוירומוסקולריות.

Introduction

מודלים תאיים המתקבלים ישירות מרקמות אנושיות שימושיים למודל של הפרעות גנטיות אנושיות רבות, עם היתרון של ההקשר הגנומי המקורי, ובמקרים רבים, שחזור אותם סימני היכר מולקולריים ותאית שנצפו בחולים. בתחום הפרעות נוירומוסקולריות, ביופסיות שרירים היו מקור נהדר למיובלסטים אנושיים ועזרו בהבהרה של מנגנונים פתולוגיים. בנוסף, הם כלי חשוב עבור בדיקות vivo של תרופות וטיפולים גנטיים. מצד אחד, הנגזרת של מיובלסטים משברי שרירים היא קלה יחסית. מצד שני, התרבות והתחזוקה של myoblasts העיקרי הם מאתגרים, בגלל שיעור התפשטות מוגבל שלהם ו senescence משכפל במבחנה¹. חלופה למגבלות אלה היא להנציח מיובלסטים עם החדרת הטלומראז האנושי(hTERT)ו / או קינאז תלוי ציקלין 4 (CDK4)^{גנים 2,3}, עם שימור של תכונות שריר השלד⁴. עם זאת, העקשנות של myoblasts העיקרי עדיין תלוי ביופסיה שרירים, הליך כירורגי עם חסרונות לחולים, אשר, במקרים רבים, יש את השרירים שלהם ניוון מתקדם. לכן, השריר של חולים אלה מורכב מחלק משמעותי של רקמת פיברוטית ו / או שומן ומניב פחות תאי שריר, הדורשים טיהור של התאים בעבר להנצחה.

בניגוד לביופסיות שרירים, ביופסיות עור נגישות יותר ופחות מזיקות לחולים. פיברובלסטים ראשוניים יכולים להיגזר משברי עור במבחנה. למרות fibroblasts אינם מושפעים בעיקר על ידי מוטציות הגורמות הפרעות neuromuscular, הם יכולים להיות transdifferentiated לתוך myoblasts. זה יכול להיות מושגת על ידי החדרת הגן Myod, גורם שעתוק רגולטורי מיוגני⁵. בכתב יד זה, אנו מתארים את הפרוטוקול להשגת מיובלסטים מופרכים, מהקמת תרבויות פיברובלסטים ועד נטיה של מיוטובים מובחנים (סיכום מייצג של השיטה מתואר באיור 1).

בדיקות פרה-קליניות של אסטרטגיות טיפוליות תלויות במודלים תאיים ובעלי חיים הנושאים מוטציות דומות למוטציות שנמצאו בחולים אנושיים. למרות הפיתוח של מודלים בעלי חיים הפך ריאלי יותר עם התקדמות של טכנולוגיות עריכת גנים כגון CRISPR / Cas9⁶, זה עדיין מאתגר ויקר. לכן, קווי תאים שמקורם בחולה הם אופציה נגישה יש מודלים, המכסה את הספקטרום הגדול של מוטציות של מחלות כגון ניוון שרירים דושן (DMD). Obtention ויצירת מודלים של תאים חיוניים לפיתוח טיפולים מותאמים אישית עבור פתולוגיות כאלה.

בין טיפולים מותאמים אישית שנחקרו, exon דילוג אסטרטגיות הוא אחד המבטיחים עבור dystrophies שרירים שונים^7,8. אסטרטגיה זו מורכבת מייצור חלבון קצר יותר אך פונקציונלי. זה מבוצע על ידי הסתרת ההגדרה exon לשחבור, ולכן להוציא את האקסון מוטציה מהשליח הסופי. זוהי טכנולוגיה מבטיחה מאוד שאושרה על ידי ה-FDA עבור DMD. לכן, אנו מתארים גם בפרוטוקול זה, שיטות כדי transfect myoblasts עם שתי exon שונים דילוג על טכנולוגיות קשורות: אוליגונוקלאוטידים antisense (AON) ו U7snRNA-אדנו הקשורים וירוס (AAV). AON transfection הוא כלי טוב עבור ההקרנה הראשונית של מספר רצפים שנועדו לקדם אקסון דילוג⁹. עם זאת, הפעילות של AONs היא חולפת. כדי לקבל ביטוי מתמשך של רצפי antisense, חקרנו גם RNAs גרעיניים קטנים (snRNAs) בשילוב עם AAV, המאפשר לוקליזציה גרעינית והכללה במכונות השחבור¹⁰. U7 הוא snRNA מעורב בעיבוד של mRNA histone שניתן להנדס כדי לאגד חלבונים כי יהיה להפנות אותו לשחבור ולספק רצפי antisense¹¹. השימוש ב- U7 snRNAs שונה בשילוב עם וקטורים AAV מתגבר על מגבלות של AONs וכתוצאה מכך ביטוי מתמשך של AONs והעברה טובה יותר של רקמות של^{עניין 12}. אנו משתמשים בתאים הנגזרים מחולים DMD עבור פרוטוקול זה כדי להמחיש את אסטרטגיית דילוג exon.

Protocol

כל הניסויים והביופסיות בוצעו בהתאם לכללים האתיים של המוסדות המעורבים באישור הוועדה המוסדית הארצית של בית החולים לילדים.

1. ייזום תרבות הפיברובלסטים העוריים

1. הקמת תרבות פיברובלסטים
   1. Aliquot 10 מ"ל של מדיום פיברובלסט(טבלה 1)ב 15 מ"ל צינורות חרוט. ביופסיית העור צריכה להיות ממוקמת ומועברת במדיום זה. הביופסיה יכולה להיות מאוחסנת ב 4 מעלות צלזיוס עד שהוא מעובד, מועדף באותו יום.
      הערה: השתמש ביופסיה העור בתוך 24-36 שעות, כדי למנוע צמיחה פוטנציאלית של זיהום.
   2. לשאוף את המדיה מהצינור ולשטוף את הביופסיה עם 10 מ"ל 1X PBS (טמפרטורת החדר) שלוש פעמים. לאחר הכביסה השלישית, להשאיר את PBS בצינור.
   3. יוצקים את PBS ואת העור על צלחת 10 ס"מ^2.
   4. באמצעות אזמלים סטריליים, לחתוך את הביופסיה לתוך שברים קטנים ככל האפשר.
   5. בעזרת פיפטה, מעבירים שבר עור בודד ומפילים אותו לתבשיל נקי של 10 ס"מ^2. מניחים 10 עד 12 שברים למנה.
   6. לשאוף את עודף PBS מכל קטע. היזהר לא לשאוף את השבר.
   7. מכסים את הכלים חלקית עם המכסה ומאפשרים שברי העור להתייבש במשך 5-20 דקות. אין לאפשר לרסיסים להתייבש יתר על המידה.
   8. לאחר השברים יבשים, להטות את המנה ב 45 מעלות ולאט לאט להוסיף 12 מ"ל של מדיום fibroblast לפינה. מנמיכים את המנה, מפיצים בזהירות את המדיה כדי שהרסיסים לא יתרוממו על ידי התקשורת.
   9. מניחים את הכלים לתוך האינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO_2). החלף את המדיה ב- 5-7 ימים ופעם בשבוע לאחר מכן.
   10. שימו לב לפיברובלסטים העולים מהשבר (איור 2) וברגע שהם מתכנסים, תעבירו את התאים ל-75 ס"מ² בקבוקים. הסר את המדיום, לשטוף את התאים עם PBS ולהוסיף 1 מ"ל 0.25 % טריפסין. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות או עד שכל התאים מורמים. הוסף 10 מ"ל בינוני צמיחה fibroblast כדי לעכב את טריפסין ולהעביר את התאים בקבוק חדש.
       הערה: עבור מינוח מספר מעבר, P1 נקבע כאשר fibroblasts הראשון שיצא מן הביופסיה העור מועברים בקבוק חדש לשגשוג.
2. הקפאה של קווי פיברובלסט ראשוניים
   1. לאחר בקבוקון 75 ס"מ² הוא confluent, לשטוף אותו עם 10 מ"ל 1X PBS ושואף PBS.
   2. הוסף 3 מ"ל של 0.25 % טריפסין לפני השטח של התא. מניחים את הבקבוק באינקובטור במשך 5 דקות. בדוק את הבקבוקים מתחת למיקרוסקופ כדי לראות אם התאים מורמים. אם לא, מניחים את הבקבוק בחזרה באינקובטור למשך 5 דקות נוספות.
   3. לאחר התאים מנותקים, להוסיף 7 מ"ל של מדיה fibroblast לבקבוק פיפטה למעלה ולמטה כדי resuspend התאים. לאסוף את התאים לתוך צינור חרוט 50 מ"ל.
   4. הכן 100 μL aliquot של כחול trypan, ולהסיר 100 μL מן המדגם להיות cryopreserved, לערבב עם כחול trypan. לטעון את התערובת על המוציטרומטר לספור. לספור את התאים בארבעה שדות שונים של המוציטרומטר מתחת למיקרוסקופ. כדי לחשב את המספר הכולל של תאים, השתמש בנוסחה: (תאים שנספרו/100) * נפח התרבות.
   5. לסובב את הצינורות חרוט ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר או 4 מעלות צלזיוס.
   6. לשאוף את המדיום ולהזרים מחדש את התאים בנפח נאות של מדיום הקפאה: 1 מ"ל לכל 1 מיליון תאים / בקבוקון. פיפטה למעלה ולמטה כדי הומוגניזציה ולהפיץ 1 מ"ל לכל cryovial שכותרתו.
   7. מניחים את הבקבוקונים בתיבת ההקפאה, ומאפשרים לבקבוקונים לקפוא בקצב של 1 מעלות צלזיוס לדקה במקפיא של -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   8. למחרת להעביר את הבקבוקונים למיכל חנקן נוזלי או -150 מעלות צלזיוס מקפיא.

2. הקמת קו התא פיברומיובלסט (FM)

1. זרע פיברובלסטים ראשוניים בכ-30% מההתקהלות בשתי בארות של צלחת של 12 בארות (2 x 10⁴ תאים /well) כדי לקבל כ-50% מההתקהלות למחרת.
2. עבור התמרה lentiviral, להוסיף 2 כדי 5 x 10⁹ vg (חלקיקי גנום ויראלי) של hTERT-puromycin lentivirus ב 400 μL של מדיום פיברובלסט. לבאר השנייה, להוסיף רק 400 μL של מדיום fibroblast. הוסף 1 מ"ל של מדיה למחרת.
   הערה: פלסמידים לייצור lentivirus התקבלו מהקבוצה שפרסמה את Chaouch et al, 2009 נייר. הם מתוארים גם בנפרד Aure et al, 2007¹³ עבור hTERT plasmid ו Barde et al, 2006¹⁴ עבור מערכת Tet-on מנוצל עבור העיצוב של פלסמיד MyoD. הם הושגו הודות להסכם העברת חומרים עם Genethon, צרפת (אנא צרו קשר עם ד"ר וינסנט Mouly כדי להשיג פלסמידים אלה - vincent.mouly@upmc.fr). בקצרה, hTERT מורכב גרסה hTERT 1 מונע על ידי מקדם CMV בעוד puromycin מונע על ידי מקדם PGK. פלסמיד MyoD מכיל גרסה MyoD 1 מונע על ידי מקדם CMV תחת שליטתו של rtTA2 מדכא. פלסמיד זה מכיל גם את הבחירה hygromycin לידי ביטוי בזכות מקדם SV40.
   Lentiviruses יוצרו באמצעות ייצור lentiviral רגיל (ראה וואנג ומקמנוס JoVe פרוטוקול¹⁵). בקצרה, עוזר MDL, Rev-Helper, SVS-G-עוזר היו transfected באמצעות משקעים סידן כלוריד גם של hTERT או MyoD פלסמידים. לאחר 48 שעות, supernatant נאסף, ולאחר מכן במשך שלושה ימים נוספים. כל העל-טבעיים התרכזו אז על-ידי אולטרה-צנטריפוגה. לאחר מכן נעשה שימוש חוזר בכדור לתוך מאגר Tris-HCL+NaCl+EDTA. הערכת טיטר הוערכה על ידי מבחני qPCR סטנדרטיים של lentivirus.
3. יום או יומיים לאחר מכן, מעבירים את התאים לצלחת של 6 בארות ומגדלים אותם עד שהם מגיעים ל-60-70% מפגש.
4. להשלים את המדיום fibroblast עם 1 מיקרוגרם / מ"ל של puromycin ולהוסיף 2 מ"ל לכל באר.
5. שמור על התאים תחת בחירה עד שכל התאים בבאר הבקרה ימותו (עד 12 ימים), שינוי מדיה כל 2-3 ימים. מעבר התאים מצלחת 6-באר לשתי מנות 10 ס"מ² לשגשוג נוסף.
6. להקפיא בקבוקונים של פיברובלסטים לאחר הבחירה. תווית כ- F(hTer).
7. זרע hTERT-מבטא פיברובלסטים (F(hTer)) בערך 30% מפגש במדיום fibroblast, בשתי בארות של צלחת 12-באר, יש כ 50% מפגש למחרת.
8. עבור התמרה lentivirus, לערבב 2 עד 5 x 10⁹ vg של MyoD-hygromycinB lentivirus ב 400 μl של מדיום fibroblast ולהוסיף בארות בהתאמה; לבאר השלישית להוסיף 400 μl בינוני פיברובלסט. הוסף 1 מ"ל של מדיום למחרת.
9. יום או יומיים לאחר מכן מעבירים את התאים לצלחת של 6 בארות וגדלים עד 60-70% מפגש.
10. להשלים את מדיום הצמיחה fibroblast עם hygromycin B (400 מיקרוגרם / מ"ל) ולהוסיף 2 מ"ל לכל באר.
11. שמור על התאים תחת בחירה עד שכל התאים בבאר הבקרה ימותו (עד 12 ימים), שינוי מדיה כל 2-3 ימים.
12. להקפיא בקבוקונים של פיברובלסטים לאחר הבחירה. תווית כ- FM ואחריה מספר זיהוי התא/שם התא.

3. פרוטוקול ההסתעף

1. זרעי FM על 10 ס"מ² מנות עם 30-40% מפגש. בצלחת של 12 באר, זרע 6 x 10⁴ תאים (זה תלוי בקו התא הבודד).
   הערה: עבור immunostaining, תאי זרע על כיסויי זכוכית או שקופיות תא מצופה Matrigel. לדלל Matrigel ב 1:10 במדיום DMEM, להוסיף נפח מספיק כדי לכסות את פני השטח, ולתת את השקופיות לשבת בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. לשאוף את ממש לפני זריעת התאים.
2. עבור אינדוקציה myoblasts, כאשר fibroblasts הגיע 70% מפגש (איור 3A),לשטוף את פני התא עם PBS ולהוסיף מדיה מיובלסט טרי בתוספת טרי 8 מיקרוגרם / מ"ל דוקסיציקלין.
   הערה: ההצלחה של בידול נפגעת בעבר 80% מפגש.
3. לאחר יומיים-שלושה, התאים הם 90-95% מפגשים והמורפולוגיה שלהם תשתנה (איור 3B). יש לשטוף את משטח התא באמצעות PBS ולהוסיף מדיית בידול טרייה בתוספת דוקסיציקלין טרי של 8 מיקרוגרם/מ"ל.
4. המשך לשנות מדיה כל 2-3 ימים ללא מעבר עד להקמת myotubes (אשר באמצעות מורפולוגיה) (איור 3C).
5. שבעה עד עשרה ימים לאחר תחילת הבידול myotube, תאים צריכים להיות מובחנים לחלוטין ועלול להתחיל להתנתק או למות. לפני שזה קורה, לקצור myotubes לניתוח נוסף.
   הערה: מהלך הזמן של היווצרות myotube תלוי בקו התא. מוטציות בחלבונים הקשורים לשרירים עלולות להפריע לפוטנציאל המיאוגני. כאשר myotubes מתחילים להיראות בהירים ולהסתכל לבן על הגבולות זה אות שהם מתחילים להתנתק (איור 4).
6. כדי לקצור myotubes, לאסוף מדיה ולהעביר אותו צינור חרוט 50 מ"ל. המדיום עשוי להכיל מיוטובים שהתנתקו.
7. לשטוף את myotubes עם 5 מ"ל PBS ולהעביר PBS לצינור 50 מ"ל.
8. הוסף 3 מ"ל של 0.25 % טריפסין לפני השטח של התא. מניחים את המנה באינקובטור במשך 5 דקות. בדוק את המנה מתחת למיקרוסקופ כדי לראות אם התאים מורמים. אם לא, הניחו אותו בחזרה באינקובטור למשך 5 דקות נוספות.
9. לאחר התאים מנותקים, להוסיף 7 מ"ל של מדיה fibroblast לצלחת פיפטה למעלה ולמטה כדי resuspend את התאים. לאסוף את התאים לצינור חרוט 50 מ"ל.
10. צנטריפוגה ב 1,200 x גרם במשך 7 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
11. בזהירות לשאוף את הנוזל, מבלי להפריע גלולה. לאחסן את כדורי ב -80 מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף.

4. חיסון של מיוטובים מובחנים

הערה: עבור immunostaining, לגדל את התאים בכיסויי זכוכית או שקופיות תא כאמור לעיל.

1. לאחר myotubes מובחנים באופן מלא, לשאוף את המדיה בזהירות לשטוף את השקופיות עם PBS. לשאוף את פי.אס.אס.
2. מוסיפים 4% PFA טריים (500 μL לבאר של צלחת של 12 באר) ומדגרים בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. לשאוף את PFA.
3. יש לשטוף עם 1 מ"ל PBS.
4. דגירה עם גליצין 0.2 M בטמפרטורת החדר, במשך 10 דקות. לשאוף גליצין.
5. לחלחל עם PBS 0.5% TritonX-100 (300 μL / באר של צלחת 12-well), במשך 10 דקות עם תסיסה עדינה.
6. חסום עם 300 μL / באר של פתרון חסימה, במשך 10 דקות עם תסיסה עדינה.
7. דגירה עם נוגדן ראשוני מדולל 1:50 ב 300 μL של פתרון חסימה, במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר, עם רעידות עדינות.
8. יש לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל/באר של PBS למשך 5 דקות, עם רעידות עדינות.
9. דגירה עם נוגדן משני מדולל 1:500 ב 300 μL של פתרון חסימה, במשך שעה אחת, בטמפרטורת החדר, עם רעידות עדינות. מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום.
10. יש לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל/באר של PBS למשך 5 דקות, עם רעידות עדינות.
11. דגירה עם DAPI מדולל PBS במשך 10 דקות. יש לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל/באר של PBS.
12. הוסף טיפה של מדיום הרכבה לשקופית זכוכית. הסר את הכיסוי עם מלקחיים ומניחים אותו עם הפנים כלפי מטה על טיפת מדיום הרכבה.
13. הפוך החלקה על מגבת נייר ולחץ בעדינות כדי להסיר בועות ועודף של מדיום הרכבה.
14. לאטום את השקופיות עם לק ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד הדמיה.

5. אנטיסנס אוליגונוקלאוטידים

הערה: הפרוטוקול שלהלן הוא עבור transfection של צלחת 6-well. כוונן אמצעי אחסון בהתאם עבור לוחות קטנים או גדולים יותר. transfection נעשה 100% מיובלסטים קונגלאנט כאשר התאים מוכנים לשלב הבידול.

1. לשאוף את התקשורת צמיחה myoblast ולשטוף את התאים עם 1 מ"ל PBS.
2. הוסף 500 μL / באר של מדיה OptiMEM ודגרת ב 37 °C (69 °F) במשך 1 שעה.
3. לדלל את oligonucleotide antisense (AON) ב 100 μL של OptiMEM לריכוז הסופי הרצוי (כלומר 50 nM, 100 nM, 200 nM, 500 nM). דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
   הערה: פרוטוקול זה ממוטב עבור AONs 2'omethyl-phosphorothioate.
4. מערבבים את lipofectamine עם OptiMEM (נפח סופי של 100 μL) כדי לתת יחס סופי של 1:1 (מיקרוגרם DNA: μL lipofectamine). דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
5. מערבבים את ליפופקטמין מדולל עם AON מדולל. מערבבים בעדינות על ידי pipetting ודגר במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר היווצרות מורכבת. הימנע בועות אוויר.
6. הוסף 200 μL של ליפופקטמין ותערובת AON לבארות בהתאמה. דגירה התאים לילה ב 37 °C (69 °F), 5% CO₂.
7. למחרת להסיר את תערובת transfection ולהוסיף 2 מ"ל של מדיה בידול חם בתוספת דוקסיציקלין.
8. לאסוף תאים לפחות שלושה ימים מאוחר יותר עבור מיצוי RNA או שבעה עד 21 ימים במקרה של ניתוח חלבון.
   הערה: ימי הבידול הדרושים לגילוי RNA ו/או ביטוי חלבון עשויים להשתנות בהתאם לגן העניין או לקו התא. במקרה של DMD, ניתן לזהות mRNA שלה בתוך שלושה ימים. גילוי חלבון דיסטרופין דורש לפחות שבעה ימים. זה ישתנה בהתאם לקו התא. ריכוזים גבוהים של AON ו מגיב transfection יכול להשפיע על transdifferentiation.

6. התמרה AAV1-U7

הערה: פרוטוקול זה היה אופטימיזציה עבור צלחות 6-באר. התאם את אמצעי האחסון באופן פרופורציונלי לאזור פני השטח של התרבות. התמרים נעשים 100% מיובלסטים משולבים כאשר התאים מוכנים לשלב הבידול. AAV1 הוא Serotype AAV עם יכולת התמרוצות הטובה ביותר של מיובלסטים תרבותיים.

1. לשאוף את מדיום הצמיחה myoblast ולשטוף את התאים עם 1 מ"ל PBS.
2. לדלל 0.5-1 x 10¹¹ חלקיקים ויראליים של AAV1-U7 ב 700 μL של מדיה בידול חם בתוספת דוקסיציקלין.
   הערה: אנו משתמשים qPCR כדי לקבוע את הריכוז הנגיפי. כמות הווירוס לשימוש עשויה להשתנות בהתאם לשיטת הכימות ויש לקבוע אותה בעבר באמצעות מבחני עיתונאי.
3. מוסיפים את התערובת הנגיפית לבאר על ידי הפלתה הומוגנית.
4. למחרת, להוסיף 1.3 מ"ל של מדיה בידול חם בתוספת דוקסיציקלין.
5. לאסוף את התאים לפחות שלושה ימים מאוחר יותר עבור מיצוי RNA או שבעה עד 21 ימים במקרה של ניתוח חלבון.

7. מיצוי RNA

הערה: כל החומר המשמש בשלב זה צריך להיות ללא RNase.

1. הוסף 500 μL של TRIzol לכל גלולה ו pipet למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להבטיח כי התאים הם lysed הומוגנית.
2. מעבירים את lysate התא בצינור 1.5 מ"ל דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
3. מוסיפים 100 μL של כלורופורם ומנערים ידנית במשך 15 שניות. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
4. צנטריפוגה ב 12,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאסוף את השלב מימית (העליון) ולהעביר אותו צינור חדש 1.5 מ"ל.
5. עבור נפח אחד של השלב מימית, להוסיף 1 נפח של אתנול 100% ומערבבים על ידי pipetting.
   הערה: אנו ממליצים על טיהור עמודות וריכוז.
6. העבר את הדגימה לעמודת IC Zymo-Spin בצינור איסוף וצנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 30 s. השלך את הזרימה.
7. לעיכול DNase I בטור, יש לשטוף מראש את העמודה עם 400 μL RNA לשטוף חוצץ. צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 30 s. השלך את הזרימה.
8. הכן 40 μL של תערובת תגובת DNase לכל מדגם. מערבבים 5 μL DNase אני עם 35 μL DNA עיכול מאגר.
9. הוסף את התערובת ישירות למטריצת העמודות. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
10. הוסף 400 μL RNA הכנת מאגר לעמודה צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 30 s. השלך את הזרימה.
11. הוסף 700 μL RNA לשטוף מאגר לעמודה צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 30 s. השלך את הזרימה.
12. הוסף 400 μL RNA לשטוף מאגר לעמודה צנטריפוגה ב 12,000 x g במשך 2 דקות כדי להבטיח הסרה מלאה של מאגר לשטוף. העבירו את העמודה בזהירות לצינור 1.5 מ"ל נטול RNase.
13. הוסף 15 מים נטולי גרעינים μL ישירות למטריצת העמודים. דגירה במשך 5 דקות וצנטריפוגה ב 12,000 x g במשך דקה אחת.
    הערה: לאסוף את RNA eluted ולהחיל אותו שוב על העמודה כדי להגדיל את התשואה. צנטריפוגה ב 12,000 x g במשך דקה אחת.
14. מניחים דגימות על קרח לכמת את הדגימות ב Nanodrop.
15. אחסן דגימות ב- -80 °C (69 °F).

8. ניתוח RT-PCR

הערה: בשלב זה, אנו מציגים הצעה של ריאגנטים כדי לזהות את הביטוי של dystrophin mRNA, אבל זה יכול להיות מותאם בקלות ריאגנטים אחרים של בחירה.

1. היפוך שעתוק
   1. להפשיר את כל ריאגנטים ולשמור אותם על קרח.
   2. הכן תערובת עם 4 μL של מאגר תגובה 5x, 2 μL של dNTP לערבב (10 מ"מ), 1 μL של מעכב ריבולוק RNase, ו 1 μL של RevertAid RT.
   3. מערבבים את הצינור בעדינות וצנטריפוגה בקצרה.
   4. בצינורות PCR 0.2 מ"ל, להוסיף את הנפח ההולם של RNA על מנת לקבל 1 מיקרוגרם לכל תגובה. הוסף מים ללא גרעין q.s.p 12 μL. כלול צינור אחד ללא שעתוק הפוך כפקד שלילי צינור אחד עם מים ללא גרעין במקום RNA.
   5. להפיץ 8 μL של תערובת תגובה לכל צינור. הנפח הכולל הוא 20 μL.
   6. מניחים צינורות בתרמוציקלר ומדגרים במשך 5 דקות ב 25 מעלות צלזיוס ואחריו 60 דקות ב 42 מעלות צלזיוס. לעצור את התגובה על ידי חימום ב 70 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
   7. מניחים את הצינורות על קרח או ב -20 מעלות צלזיוס לאחסון ארוך יותר.
2. Pcr
   הערה: עיצוב פרייומרים בצמתים exons רצוי.
   1. ריאגנטים וורטקס לסובב למטה לפני השימוש.
   2. הכן תערובת מאסטר באמצעות פריימר קדמי 0.5 μL (25 מיקרומטר), פריימר הפוך 0.5 μL (25 מיקרומטר), 12.5 μL 2x PCR מאסטר מיקס, ו 8.5 μL של מים ללא גרעין לדגימה.
   3. Aliquot 22 μL של מאסטר לערבב לתוך צינור עבור כל מדגם.
   4. הוסף 3 μL של cDNA (150 ng) לצינור PCR בהתאמה שלה. הוסף 3 μL של מים ללא גרעין לצינור בקרה שלילי PCR.
   5. וורטקס ולסובב את צינורות PCR.
   6. דגירה הצינורות תרמוציקלר ב 95 °C (95 °F) במשך 3 דקות, 95 °C (75 °F עבור 30 s, °C (30 °F) עבור (1 דקות / kb) 34 פעמים, 72 °C (72 °F) ° C במשך 5 דקות.
      הערה: טמפרטורת חישול אופטימלית ניתן לקבוע באופן אמפירי. לתערובת המאסטר המוצעת, הפחת 5 מעלות צלזיוס מטמפרטורת ההיתוך של פריימר.
   7. לטעון 12 μL של תגובת PCR על ג'ל agarose ולהקפיא את הדגימות ב -20 מעלות צלזיוס.

9. איתור ביטוי דיסטרופין על ידי פריחה מערבית

הערה: פרוטוקול זה מותאם במיוחד לדיסטרופין, חלבון קרום גדול. ייתכן שיהיה צורך בתנאים מסוימים עבור חלבונים שונים.

1. מיצוי חלבונים
   1. לאחר 7-21 ימים של בידול, לאסוף תאים עם 5 מ"ל של PBS עם 100 μL 0.5 M EDTA, ו 50 מעכבי פרוטאז μL. דגירה ב 37 °C (69 °F) עד תאים להתנתק. צנטריפוגה ב 1,200 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הצמד להקפיא את גלולה על ידי טבילת הצינור בחנקן נוזלי. לאחסן את גלולה ב -80 מעלות צלזיוס או להמשיך לשלב התזה.
   2. הכן מאגר תמוגה על ידי הוספת 1% של דיגיטונין, 1% מעכבי פרוטאז, 10% מעכבי פוספטאז, ומאגר בסיס לנפח הכולל (60 μL לכל גלולה תא).
   3. הוסף 60 μL של מאגר תמוגה לכדור התא, על קרח. סוניקאט במשך 5 שניות. בואו נשב על קרח במשך 8 שניות. חזור על צעדי sonication ומנוחה פעמיים.
   4. דגימות דגירה על קרח במשך 30 דקות.
   5. צנטריפוגה ב 14,000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
   6. העבר את supernatant לצינורות נקיים.
   7. לכמת דגימות על ידי חומצה bicinchoninic (BCA) assay, בעקבות הוראות היצרן.
   8. מערבבים את פתרון החלבון עם הנפח המתאים של מאגר לאמלי. הפוך aliquots של 100 מיקרוגרם. במידת הצורך, כוונן את עוצמת הקול ל- 25 μl עם מאגר תמוגה בסיסית. אחסן דגימות ב- -80 °C (69 °F).
2. פריחה מערבית
   1. להפשיר דגימות על קרח.
   2. Denature את הדגימות ב 100 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות, ואז לקרר אותם בקרח, לסובב למטה.
   3. לדלל את 20X Tris-אצטט SDS פועל מאגר ב 200 מ"ל dH₂O ולהוסיף 500 μL נוגד חמצון.
   4. הכן את 3-8% טריס-אצטט פוליאקרילאמיד ג'ל על ידי הסרת מסרק ושטיפה עם dH₂O. להרכיב את הג'ל במנגנון אלקטרופורזה. מלא את התא הפנימי במאגר פועל.
   5. טען 5 μL של סולם חלבון ו 25 μL של מדגם בג'ל. מלא את התא החיצוני במאגר פועל.
   6. לרוץ ב 80 V עבור 1 שעה ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, ב 120 V עבור 2 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.
   7. הכן 3 L של מאגר העברה 1X עם 150 מ"ל של מתנול 20X, 150 מ"ל של מאגר העברה 20X, ו 2,700 מ"ל של dH₂O. לקרר אותו עד 4 מעלות צלזיוס.
   8. חותכים 4 חתיכות של נייר מסנן וחתיכה אחת של קרום nitrocellulose. משרים את מסנן הנייר ואת הממברנה במגש עם מאגר העברה.
   9. מוציאים בעדינות את הג'ל מהמארז ומרכיבים אותו במנגנון ההעברה עם נייר סינון, ממברנה וספוגים. הג'ל ממוקם בצד השלילי והממברנה בצד החיובי.
   10. הפעל העברה ב 300 mA, ערבוב, ב 4 מעלות צלזיוס, לילה.
   11. לחסום את הממברנה ב 10 מ"ל של חיץ חסימה במשך 1 שעות עם תסיסה עדינה, בטמפרטורת החדר.
   12. הכן פתרון נוגדנים ראשוני עם 10 מ"ל של חיץ חסימה ו 50 μL של נוגדן דיסטרופין (1:200).
   13. השלך את מאגר החסימה והוסף את פתרון הנוגדנים העיקרי. דגירה עם תסיסה עדינה לפחות 2 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
   14. יש לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם 0.1% טווין PBS, למשך 5 דקות בעצבנות עדינה.
   15. הכן פתרון נוגדנים משני באמצעות 10 מ"ל של פתרון חסימה, 2 μL של נוגדן נגד ארנב (1:5000), ו 20 μL של 0.2% Tween.
   16. מוסיפים את פתרון הנוגדנים המשני לקרום. דגירה למשך שעה עם תסיסה עדינה, מכוסה בנייר אלומיניום להגנה מפני אור.
   17. השלך את תמיסת הנוגדן ושטוף את הממברנה 3 פעמים עם 0.1% Tween PBS, במשך 5 דקות עם תסיסה עדינה, מוגן מפני אור.
   18. חשיפה ותמונה של הממברנה במכשיר הדמיה.
   19. הכתים את הממברנה עבור חלבון כולל עם כתם Revert 700 סה"כ חלבון, בהתאם להוראות היצרן.
       הערה: זיהוי דיסטרופין על ידי חולצה מערבית תלוי בגיל / מוטציה של המטופל ואת היכולת של התא להתיך ולהישאר מחובר מספיק זמן כדי לצבור מספיק דיסטרופין.

תוצאות

פרוטוקול זה מראה כיצד להקים תרבויות פיברובלסט אנושיות שמקורן בעור ולהמיר אותן למיובלסטים ולאחר מכן למיוטובים מובחנים. סוג זה של קו התא הוא מאוד שימושי לחקר הפרעות neuromuscular ובדיקות במבחנה של טיפולים פוטנציאליים.

באיור 1מוצג ייצוג סכמטי של ההמרה הפיברובל...

Discussion

כדי להשיג קווי תא FM באיכות טובה, כמה צעדים הם קריטיים. ככל שביופסיה של העור מעובדת מוקדם יותר, כך גדלים הסיכויים להשיג פיברובלסטים בריאים. מספר המעבר של תרבויות פיברובלסטים חשוב גם הוא. לתאים ראשיים יש יכולת התפשטות מוגבלת ולאחר מעברים רבים, הם נכנסים בהיגיון משכפל. לכן, עדיף שיש מלאי של fibrob...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm dish	Corning	430167
0.25% Trypsin-EDTA, phenol red	Thermo Fisher	2500056
10X Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP3994
12-well plate	Corning	3513
20X Transfer buffer	Thermo Fisher	NP00061
20X Tris-acetate SDS running buffer	Thermo Fisher	LA0041
3-8% Tris-Acetate gel	Thermo Fisher	EA0378BOX
75 cm2 flask	Corning	430641U
Antibiotic-Antimicotic 100X	Thermo Fisher	15240062
Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody	Developmental Studies Hybridome Bank	MF20 supernatant	Dilution 1:50
Antioxidant	Thermo Fisher	NP0005
BCA Protein Assay	Thermo Fisher	23227
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
DAPI	Thermo Fisher	D3571	Dilution 1:1000
Digitonin	Millipore Sigma	300410250MG
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate	Thermo Fisher	10569044
DNAse I set (250U)	Zymo Research Corporation	E1010
Doxycycline Hydrochloride	Fisher Scientific	BP2653-5
Dup2 human primers	Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3'	Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3'
Dystrophin antibody	Abcam	ab15277	Dilution 1:200
Fetal bovine serum	Thermo Fisher	16000
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A11001	Dilution 1:1000
Halt Protease inhibitor cocktail 100X	Thermo Fisher	78430
Hemocytometer	Hausser Scientific	3100
Hygromycin B	Thermo Fisher	10687010
IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Li-Cor	926-68071	Dilution 1:5000
Lab-Tek II CC2 chamber slide system	Thermo Fisher	15852
Laemmli	Bioworld	105700201
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher	L3000008
Matrigel GFR membrane matrix	Corning	354230
Methanol	Fisher Scientific	A412P-4
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher	51000001
Nitrocellulose membrane 0.45 µm	GE Healthcare Life Sciences	10600002
Normal Goat serum control	Thermo Fisher	10000C
Odyssey Blocking Buffer (PBS)	Li-Cor	927-40003	Blocking buffer for Western blot
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher	11058021
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PCR master mix	Thermo Fisher	K0172
Phosphatase inhibitor	Thermo Fisher	A32957
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio Rad	1610374
Puromycin	Thermo Fisher	A1113803
Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization	Li-Cor	926-11021
RevertAid kit	Thermo Fisher	K1691
RNA Clean & Concentrator-25	Zymo Research Corporation	R1018
Scalpels	Aspen Surgical	372611
Skeletal Muscle Cell Differentiation medium	Promocell	C23061
Skeletal Muscle Cell Growth medium	Promocell	C23060
Triton X-100	Acros Organics	215682500
TRIzol reagent	Thermo Fisher	15596026
Tween 20	Fisher Scientific	BP337500
Ultra low temperature freezer	Thermo Scientific	7402
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher	15575020
Vectashield antifade mounting medium	Vector Labs	H1000