Reprogramación directa de fibroblastos humanos en mioblastos para investigar terapias para trastornos neuromusculares

Resumen

Este protocolo describe la conversión de fibroblastos de piel en mioblastos y su diferenciación en miotubes. Las líneas celulares se derivan de pacientes con trastornos neuromusculares y se pueden utilizar para investigar mecanismos patológicos y para probar estrategias terapéuticas.

Resumen

Las investigaciones sobre la fisiopatología y las dianas terapéuticas en distrofias musculares se han visto obstaculizadas por la limitada capacidad proliferativa de los mioblastos humanos. Se han creado varios modelos de ratón, pero no representan realmente la fisiopatología humana de la enfermedad o no son representativos del amplio espectro de mutaciones que se encuentran en los seres humanos. La inmortalización de los mioblastos primarios humanos es una alternativa a esta limitación; sin embargo, todavía depende de biopsias musculares, que son invasivas y no fácilmente disponibles. Por el contrario, las biopsias cutáneas son más fáciles de obtener y menos invasivas para los pacientes. Los fibroblastos derivados de biopsias de piel pueden ser inmortalizados y transdiferenciados en mioblastos, proporcionando una fuente de células con un excelente potencial miogénico. Aquí, describimos un método de reprogramación rápida y directa de fibroblasto en un linaje miogénico. Los fibroblastos se transducen con dos lentivirus: hTERT para inmortalizar el cultivo primario y un MYODinducible en tet, que tras la adición de doxiciclina, induce la conversión de fibroblastos en mioblastos y luego miotubes maduros, que expresan marcadores de diferenciación tardía. Este protocolo de transdiferenciación rápida representa una poderosa herramienta para investigar mecanismos patológicos e investigar bioterapias innovadoras basadas en genes o farmacológicas para trastornos neuromusculares.

Introducción

Los modelos celulares obtenidos directamente de los tejidos humanos son útiles para modelar muchos trastornos genéticos humanos, con la ventaja de tener el contexto genómico original y, en muchos casos, reproducir las mismas señas de identidad moleculares y celulares observadas en los pacientes. En el campo de los trastornos neuromusculares, biopsias musculares han sido una gran fuente de mioblastos humanos y han ayudado en la elucidación de mecanismos patológicos. Además, son una herramienta importante para las pruebas in vivo de fármacos y terapias génicas. Por un lado, la derivación de mioblastos de fragmentos musculares es relativamente fácil. Por otro la....

Protocolo

Todos los experimentos y biopsias se llevaron a cabo siguiendo las reglas éticas de las instituciones involucradas bajo la aprobación de la Junta Nacional de Revisión Institucional del Hospital de Niños.

1. Inicio del cultivo de fibroblastos dérmicos

1. Establecimiento del cultivo de fibroblastos
   1. Aliquot 10 mL de medio fibroblasto(Tabla 1)en tubos cónicos de 15 ml. La biopsia de la piel debe colocarse y transportarse en este medio. La biopsia se puede almacenar a 4 °C hasta que se procese, preferentemente el mismo día.
      NOTA: Utilice la biopsia de piel en un plazo de 24-36 horas para evitar el crecimiento p....

Resultados

Este protocolo muestra cómo establecer cultivos de fibroblastos derivados de la piel humana y convertirlos en mioblastos y luego en miotubes diferenciados. Este tipo de línea celular es extremadamente útil para el estudio de trastornos neuromusculares y pruebas in vitro de terapias potenciales.

Se muestra una representación esquemática de la conversión fibroblasta en la figura 1. La Figura 2A muestra un fragmento de pie.......

Discusión

Para obtener líneas celulares FM con buena calidad, algunos pasos son críticos. Cuanto antes se procese la biopsia de la piel, mayores serán las posibilidades de obtener fibroblastos sanos. El número de pasajes de cultivos de fibroblastos también es importante. Las células primarias tienen una capacidad proliferativa limitada y después de muchos pasajes, entran en senescencia replicativa. Por lo tanto, es mejor tener un stock de fibroblastos en un número de paso bajo y transformar las células en el paso más tem.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm dish	Corning	430167
0.25% Trypsin-EDTA, phenol red	Thermo Fisher	2500056
10X Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP3994
12-well plate	Corning	3513
20X Transfer buffer	Thermo Fisher	NP00061
20X Tris-acetate SDS running buffer	Thermo Fisher	LA0041
3-8% Tris-Acetate gel	Thermo Fisher	EA0378BOX
75 cm2 flask	Corning	430641U
Antibiotic-Antimicotic 100X	Thermo Fisher	15240062
Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody	Developmental Studies Hybridome Bank	MF20 supernatant	Dilution 1:50
Antioxidant	Thermo Fisher	NP0005
BCA Protein Assay	Thermo Fisher	23227
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
DAPI	Thermo Fisher	D3571	Dilution 1:1000
Digitonin	Millipore Sigma	300410250MG
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate	Thermo Fisher	10569044
DNAse I set (250U)	Zymo Research Corporation	E1010
Doxycycline Hydrochloride	Fisher Scientific	BP2653-5
Dup2 human primers	Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3'	Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3'
Dystrophin antibody	Abcam	ab15277	Dilution 1:200
Fetal bovine serum	Thermo Fisher	16000
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A11001	Dilution 1:1000
Halt Protease inhibitor cocktail 100X	Thermo Fisher	78430
Hemocytometer	Hausser Scientific	3100
Hygromycin B	Thermo Fisher	10687010
IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Li-Cor	926-68071	Dilution 1:5000
Lab-Tek II CC2 chamber slide system	Thermo Fisher	15852
Laemmli	Bioworld	105700201
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher	L3000008
Matrigel GFR membrane matrix	Corning	354230
Methanol	Fisher Scientific	A412P-4
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher	51000001
Nitrocellulose membrane 0.45 µm	GE Healthcare Life Sciences	10600002
Normal Goat serum control	Thermo Fisher	10000C
Odyssey Blocking Buffer (PBS)	Li-Cor	927-40003	Blocking buffer for Western blot
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher	11058021
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PCR master mix	Thermo Fisher	K0172
Phosphatase inhibitor	Thermo Fisher	A32957
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio Rad	1610374
Puromycin	Thermo Fisher	A1113803
Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization	Li-Cor	926-11021
RevertAid kit	Thermo Fisher	K1691
RNA Clean & Concentrator-25	Zymo Research Corporation	R1018
Scalpels	Aspen Surgical	372611
Skeletal Muscle Cell Differentiation medium	Promocell	C23061
Skeletal Muscle Cell Growth medium	Promocell	C23060
Triton X-100	Acros Organics	215682500
TRIzol reagent	Thermo Fisher	15596026
Tween 20	Fisher Scientific	BP337500
Ultra low temperature freezer	Thermo Scientific	7402
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher	15575020
Vectashield antifade mounting medium	Vector Labs	H1000