مخروط المخصب الثقافات من شبكية العين من أجنة الدجاج لدراسة رود إلى مخروط التفاعلات الخلوية

Summary

نحن نصف طريقة للحصول على الثقافات الأولية من مستقبلات ضوئية مخروطية من شبكية العين من أجنة الدجاج واستخدامها لفحص محتوى عال.

Abstract

تعتمد الرؤية النهارية البشرية على وظيفة المستقبلات الضوئية المخروطية في مركز شبكية العين ، fovea. المرضى الذين يعانون من الشكل الأكثر انتشارا من انحطاط الشبكية الموروثة، التهاب الشبكية الصباغي، تفقد الرؤية الليلية بسبب فقدان طفرة مدفوعة من مستقبلات ضوئية قضيب، وهي ظاهرة تليها فقدان تدريجي للوظيفة وموت المخاريط مما يؤدي إلى العمى. وقد حدد علماء الوراثة العديد من الجينات مع الطفرات التي تسبب هذا المرض، ولكن الطفرات الأولى التي تم تحديدها شككت في آليات انحطاط المخروط الثانوي وكيف يمكن لطفرة مهيمنة في ترميز جين رودوبسين للصبغة البصرية التي يتم التعبير عنها حصريا في قضبان أن تؤدي إلى انحطاط المخروط.

أدت هذه النتيجة من عمليات زرع في نموذج وراثي للمرض إلى مفهوم التفاعلات الخلية بين قضبان والمخاريط وانحطاط غير الخلية المستقلة من المخاريط في جميع الأشكال الوراثية لالتهاب الشبكية الصباغي.

تشكل المخاريط 5٪ من جميع المستقبلات الضوئية في البشر و3٪ فقط في الماوس ، لذلك فإن دراستهم صعبة في هذه الأنواع ، ولكن المخاريط يفوق عدد قضبان أنواع الطيور. لقد قمنا بتكييف 96 لوحة بئر زراعة السلائف الشبكية من شبكية العين من أجنة الدجاج في المرحلة 29 من تطورها. في هذه الثقافات الأولية، تمثل المخاريط 80٪ من الخلايا بعد التمايز في المختبر. تتدهور الخلايا على مدى أسبوع واحد في غياب المصل. هنا، ونحن نصف الأساليب وتوحيدها.

تم استخدام نظام الثقافة المخصب بالمخروط هذا لتحديد عامل صلاحية المخروط المشتق من الظهارة (EdCVF) من خلال فحص المحتوى العالي لمكتبة cDNA المصطبغة بشبكية الفئران. EdCVF المؤتلف يمنع انحطاط المخاريط.

Introduction

شبكية العين من الأنواع الفقارية مزدوجة، مع مستقبلات ضوئية قضيب لرؤية الضوء الخافت وتصورات ضوئية مخروطية لضوء النهار واللون والرؤية حدة. تعتمد حدة البصر الرئيسيات على منطقة في مركز شبكية العين ، تسمى fovea ، يتم تخصيبها في المخاريط ، ولكن بشكل عام ، تمثل المخاريط 5٪ فقط من جميع المستقبلات الضوئية. وبالتالي ، فإن تحليل المخاريط في شبكية العين الرئيسيات وخاصة ثقافة المخاريط صعبة من الناحية الفنية. جميع أنواع الثدييات الأخرى ليس لها fovea والنسبة المئوية للمخاريط منخفضة للقوارض التي تستخدم عادة في أبحاث الشبكية. وهذا ليس هو الحال بالنسبة لأنواع الطيور، التي تهيمن المخاريط على شبكية العين من هذه الأنواع الطيور رؤية جيدة. الديناصورات، التي هيمنت على النظام الإيكولوجي عندما ظهرت الثدييات لأول مرة أثناء التطور، هي في الأصل النباتي للطيور¹. ونتيجة لمثل هذه المنافسة بين الديناصورات والثدييات المبكرة ، فإن الثدييات ليلية في الغالب مع شبكية العين التي تهيمن عليها القضبان. وفي وقت لاحق فقط خلال التطور أصبحت الرؤية النهارية لبعض أنواع الثدييات، التي تنتمي منها الرئيسيات، ميزة تطورية. ومع ذلك، تبقى فترة الأجداد كتكادة من عنق الزجاجة الليلية في تطور رؤية الثدييات^2،3.

أثناء دراسة تمايز خلايا الشبكية، أظهر أدلر وهاتلي أن المستقبلات الضوئية تمثل ما يقرب من 70٪ من الخلايا المتمايزة في الشبكية في الثقافات المشتقة من الدجاج في اليوم الجنيني (ED) 6 أو المرحلة 29⁴. بسبب انتشار المخاريط في شبكية العين الدجاج، وقد وضعت ثقافات خلايا الشبكية من أجنة الدجاج ED6 كثقافات المخصب^{مخروط 5}.

إن أهمية حدة البصر بوساطة المخروط بالنسبة للإنسان هي حقيقة بديهية. الأشخاص المتضررين من الأمراض الوراثية أو الشيخوخة التي تغير وظيفة المخروط معوقون إلى حد كبير. وقد عزز هذا مجموعة كبيرة جدا من الدراسات على الضمور الشبكية الموروثة (IRD) بهدف إيجاد علاجات لهذه الأمراض المسببة للعمى^6،7. النجاح الأول، التي تم الحصول عليها باستخدام ناقلات أدينو المؤتلفة المرتبطة (AAV) لعلاج شكل حاد من IRD ليبر amaurosis الخلقية (LCA)، هو دليل على مفهوم للعلاج الجيني⁸. إن تحديد الجينات التي تؤدي طفراتها إلى الإصابة بأمراض القلب والأمراض المعدية ويفتح إمكانية علاج هذه الأمراض باستخدام العلاج الجيني. ومع ذلك، فإن هذه الأمراض تنتج عن الطفرات في أكثر من 200 جينات^{متميزة 9}. وحتى في حالة الأشكال المتنحية الذاتية ل IRD، عندما يمكن لإعادة إدخال النسخة العادية من الجين المهووس أن تستعيد الوظيفة البصرية، فإن التكلفة الاقتصادية لكل تطور فردي تفضل أكثرها انتشارا على حساب تلك الأقل شيوعا وتلك التي لا يزال الأصل الوراثي مجهولا لها. هذه الحقيقة دفعت الباحثين إلى التفكير في علاجات أكثر عمومية. ظهر موت الخلايا المبرمج كمسار مشترك ، وهدف علاجي لهذه الأمراض التي تتقدم عن طريق انحطاط المستقبلات الضوئية ، بما في ذلك الأشكال المهيمنة الذاتية^10،11. بيد أن النجاحات التي حققها هذا النهج مفقودة. بالنسبة للشكل الأكثر شيوعا من IRD ، التهاب الشبكية الصباغي (RP) ، فإن المسار الشائع هو فقدان الوظيفة الثانوي يليه في نهاية المطاف انحطاط المخاريط^12،13. منع فقدان وظيفة مخروط سوف تحافظ على الرؤية المركزية للfovea بشكل مستقل عن الطفرات المسببة¹⁴.

في المرحلة المبكرة من RP ، يؤدي فقدان القضبان إلى انخفاض في التعبير عن عامل صلاحية المخروط المشتقة من القضيب (RdCVF) ، المشفر بواسطة الجين 1(NXNL1)الشبيه بالنيوكليوريدوكسين ، والذي يقطع إشارات التمثيل الغذائي والأكسدة بين القضبان والمخاريط^15. إدارة AAV المؤتلف ترميز اثنين من منتجات الجين NXNL1، عامل الغذائية RdCVF وانزيم thioredoxin RdCVFL، يمكن نظريا منع فقدان الرؤية مخروط في جميع الأشكال الوراثية من RP¹⁶. لقد أظهرنا أن المنتج الجيني NXNL1، RdCVFL، يتم التعبير عنه في الثقافات المخصبة بمخروط الدجاج¹⁷ وحيث يلعب دورا وقائيا¹⁸. تم تحديد RdCVF وجين NXNL1 من خلال فحص محتوى عال من مكتبة cDNA الشبكية باستخدام بقاء الخلايا من ثقافة المخصب مخروط كما قراءات¹⁹. فحصنا ما يعادل 210،000 استنساخ فردي للمكتبة باستخدام 8 اختبارات موازية لكل استنساخ. وهذا يمثل عددا كبيرا جدا من الاختبارات التي تتطلب سهولة الوصول إلى المواد البيولوجية، وشبكية العين من أجنة الدجاج. وجدنا أنه كان من السهل نسبيا الحصول على بيض الدجاج الجنيني على أساس أسبوعي لأنها تنتج على نطاق واسع للصناعة الزراعية للدجاج الذي يضع البيض والدجاج المنتج للحوم. بعد التوحيد الدقيق للثقافات المخصبة بالمخروط ، يوفر النظام طريقة سهلة وقوية وقابلة للاستنساخ لاختبار آلاف الجزيئات لقدرتها على الحفاظ على صلاحية المخروط. هذه الخلايا هي أيضا قابلة للتلاعب الجيني²⁰ التي تستفيد من دراسة نقل إشارة والتحاليل الكيميائية الحيوية^21،22،23.

وقد وضعت الباحثين الشبكية أساليب بديلة كما استخدام خط الخلية مخروط 661W^24,25,26. ومع ذلك، فإن هوية هذا الخط الخلية لا تزال مثيرة للجدل^27،28. تم استنساخ الخلايا 661W من أورام الشبكية من خط الماوس المعدلة وراثيا التي تعبر عن مستضد T SV40 كبيرة تحت السيطرة على الإنسان interphotoreceptor الريتينول ملزمة البروتين المروج. SV40 مستضد T كبيرة تتوسط التحول الخلوي والخلود. ونتيجة لذلك، يجب الإبلاغ عن مسار الإشارات المحدد باستخدام خلايا 661W في سياق خط الخلية المتحول والخالد الذي يختلف بطرق عديدة عن المخاريط في الموقع. في هذا الصدد، يتكون نظام الثقافة المخصب بالمخروط من الخلايا العصبية الأولية، والمخاريط التي هي أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية.

في حين أنه من الممكن الحصول على ثقافة نقية من المستقبلات الضوئية باستخدام قسم هزاز من شبكية العين الماوس، ونسبة منخفضة جدا من المخاريط في شبكية العين الخارجية من القوارض يجعل هذا النهج غير مناسب لإنتاج الثقافات المخصب^{مخروط 29}. شبكية العين خنزير لا يحتوي على fovea ولكن لديه منطقة تسمى centralis المنطقة التي يتم إثراء جدا في المخاريط³⁰. نسبة عالية من المخاريط في القوارض النهارية شبكية العين, كما Arvicanthis ansorgei وPsammomys obsesus^31,32, يقدم حلا ممكنا ولكن يتطلب تربية مثل هذه الأنواع الغريبة. يمكن استخدام عيون الخنازير البالغة ، التي تم جمعها من المسالخ المحلية ، لإنتاج ثقافة مختلطة من القضبان والمخاريط التي تم استخدامها لدراسة بقاء المستقبل الضوئي^33. حل أنيق هو قبل تنقية المخاريط من شبكية العين الخنزير باستخدام بالغسل مع الفول السوداني agglutinin (PNA) lectin، الذي يربط بشكل انتقائي إلى المخاريط³⁴. ومع ذلك، يصعب تنفيذ هذه الطريقة على نطاق واسع بسبب تعقيدها.

الخلايا الجذعية المستحثة بشريا (iPS) يقدم النهج الواعد للحصول على مخروط الخلايا مستقبلات ضوئية التي يمكن استخدامها لزرع الشبكية ولكن يمكن أيضا أن تتكيف مع ثقافة^{المخصب مخروط 35,36}. منذ عامل النسخ NRL مطلوب لقضبان مستقبلات^{ضوئية 37}، وNRL - / الماوس لديه شبكية العين التي تهيمن عليها المخاريط موجة قصيرة (S - المخاريط). ويمكن استخدام تعطيل لإنتاج S-مخروط المخصب إعداد عن طريق التمايز بين الإنسان من iPS^38,39. نهج آخر ممكن هو تعزيز التمايز مخروط باستخدام هرمون الغدة الدرقية^{إشارة 40}. في حين أن أساليب جديدة لإنتاج الثقافات المخصبة بالمخروط من iPS الإنسان آخذة في الظهور ، فإن أجنة الدجاج توفر طريقة مثبتة حاليا¹⁹.

كان للثقافة المخصبة بالمخروط دور فعال في تحديد RdCVF عن طريق استنساخ التعبير¹⁹. كما تم استخدام هذا النظام بنجاح لإثبات أن RdCVF يحفز امتصاص الجلوكوز والتمثيل الغذائي من خلال انحلال الجليكوليسيس^{الهوائية 22}. وعلاوة على ذلك تم استخدام الثقافة المخصبة بالمخروط للتحقق من صحة الدور الوقائي ل RdCVFL ، المنتج الثاني لجين NXNL1 ²³. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام هذا النظام لإثبات وجود جزيئات حماية تفرزها الخلايا الظهارية المصطبغة الشبكية التي تم نقلها مع OTX2⁴¹.

Protocol

وقد وافقت على البروتوكول لجنة أخلاقيات التجارب الحيوانية التابعة للجامعة بيير وماري كوري ووزارة البحوث الفرنسية (رقم التصريح: APAFIS#1028 2015070211275177). أجريت التجارب على الحيوانات بموجب التفويض التالي: "Certificat d'autorisation d'expérimenter sur les animaux vertébrés A-75-1863. محافظة شرطة باريس (9 نوفمبر 2011 - 8 نوفمبر 2016)".

1. حضانة البويضات المخصبة

1. جمع البيض المخصب الأسبوعية (سلالة I 657، التسمية الحمراء)، التي تم الحصول عليها بشكل طبيعي، في مفرخ الصناعية.
2. الحفاظ على البويضات المخصبة عند 17 درجة مئوية (صفرها البيولوجي) في المختبر بعد أن يتم "وضعها" من قبل هن.
3. لكل ثقافة، احتضان سبع بويضات مخصبة لمدة 24 ساعة في 20 درجة مئوية ثم 136 ساعة في 37 درجة مئوية مع الارتداد المتقطع للميل (حركة تدريجية لمدة ساعتين من جانب واحد إلى نقيضه، دورة 4 ساعات) من البيض في غرفة رطبة.

2. استعادة أجنة الدجاج

1. غسل سطح البيض السبعة بالمطهر (على سبيل المثال، Pursept A Express).
2. لكسر قشر البيض، وجعل ثقب في الجزء العلوي من قذيفة مع كماشة مستقيمة كبيرة. ثم قطع قذيفة لإزالة قبعة من البيض كبيضة مسلوقة لينة.
3. استخراج بلطف كل جنين من قشر البيض مع ملقط منحني، ومن ثم نقله إلى طبق بيتري تحتوي على محلول ملحي الفوسفات العازلة العقيمة (PBS) ساخنة سابقا إلى 37 درجة مئوية. بلطف، قم بإزالة المغلف الذي يحيط بالأجنة (المشيمة أو الغشاء المشيمي).
4. تحقق من مرحلة تطور كل جنين من خلال المقارنة البصرية مع هامبرغر وهاملتون⁴².
5. اختر جنينين في المرحلة^{التاسعة والعشرين} من التطور (الشكل 1). الأجنحة تنحني عند المرفقين. ذوي الياقات البيضاء تبرز بشكل واضح. ومشروع القانون أكثر بروزا مما كان عليه في المرحلة^{الثامنة والعشرين.}
6. 1- إعادة رقي عيون هذه الأجنة المختارة ونقلها في متوسط مستقل CO₂(تقنيات الحياة).
   تنبيه: من المهم جدا أن يكون الجنين في المرحلة 29، وليس في المرحلة 28 أو 30(الشكل 1)؛ هذا هو السبب في أنه من الضروري احتضان ما لا يقل عن 7 بيضات ، حتى لو تم استخدام بيضتين فقط في النهاية. المشيمة رقيقة جدا، من الصعب جدا التمييز، لكنها قريبة جدا من الجنين، لذلك يجب إزالتها دون لمس الجنين.

3. تشريح شبكية العين

1. قطع الرأس وتقطيب الأجنة المختارة مع ملقط منحني.
2. نقل العيون الأربعة إلى CO₂-المتوسطة المستقلة. هذا المتوسط يحتوي على 0.9 mM CaCl₂ و 0.65 mM MgCl₂.
3. ضع العين مع وجه القرنية لأسفل ، العصب البصري الذي يواجه المجرب. حفر ثقب في العصب البصري باستخدام اثنين من ملقط مستقيم.
4. إدراج فرع من كل ملقط بين شبكية العين وظهارة الصباغ (الشكل 2). سحب على كل ملقط وتدوير العين لفصل الظهارة من شبكية العين. إزالة القرنية تليها العدسة وvitreous.
5. نقل شبكية العين الأربعة في طبق بيتري يحتوي على متوسط رينغر في درجة الحموضة 7.2.
   تنبيه: تأكد من بقاء الشبكية فقط وإزالة أي آثار للظهارة الزجاجية والمصطبغة المتبقية في الشبكية.

4. إعداد تعليق خلية الشبكية

1. قطع شبكية العين الأربعة في قطع صغيرة جدا باستخدام كماشة اثنين على التوالي.
2. اغسل قطع الشبكية مرتين باستخدام وسيط رينغر.
3. بعد الغسيل الثاني مع وسيط رينغر، دع قطع الشبكية تسقط على الجزء السفلي من الأنبوب وأزل وسط الرينجر. علاج قطع الشبكية لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية مع حل من التريبسين (0.25٪ ث / v).
4. تفريق الحل بعد 10 دقائق عن طريق الشفط المتعاقبة. التفريغ باستخدام ماصة باستور والتحقق من انفصال قطع الشبكية. وقف رد الفعل عن طريق إضافة وسائل الإعلام الثقافة تكملها مع 10٪ مصل العجل الجنين المعطل.
5. احتضان تعليق الخلية مع 0.05 ملغ من DNase I. فصل مجموعات الخلية والحمض النووي عن طريق الشفط والتفريغ المتعاقبة باستخدام ماصة باستور مباشرة بعد إضافة DNase.
6. غسل تعليق خلية الشبكية مرتين مع وسيط الثقافة الكيميائية المحددة (CDCM): حجم متساو من وسائط Dulbecco النسر المعدلة المتوسطة وM199 تكملها مع 100 ميكروغرام / مل حمض اللينوليك / BSA، 0.86 ميكرومتر الأنسولين، 0.07 ميكرومتر نقل، 2.0 ميكرومتر البروجسترون، 0.28 ميكرومتر بروستاجلاندين، 0.29 ميكرومتر نا₂SeO_3،182 ميكرومتر putrescine، 3 mM تورين، 4.7 ميكرومتر سيتيدين 5′-ديبهوسفوكولين, 2.7 ميكرومتر سيتيدين 5′-ديبهوسيفوثانولامين, 0.55 ميكرومتر هيدروكورتيزون, 0.03 ميكرومتر تريودوثيروينين, 1 م الصوديوم بيروفاتي و 20 ميكرومتر جنتامايسين.

5. بذر الخلايا الشبكية

1. علاج اثنين من لوحات ثقافة 96 جيدا الأسود مع أسفل شفافة لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية مع بولي-L-ليسين في 32.25 ميكروغرام/سم².
2. شطف هذه الأطباق مرتين مع M199 ثقافة المتوسطة. Resuspend بيليه الخلية في 1 مل من CDCM.
3. إضافة إلى aliquot من 10 ميكرولتر من خلية تعليق تريبان الأزرق للطخة الخلايا الحية. إضافة عينة تعليق الخلايا إلى مقياس الهيموسيتوميتر (غرفة عد الخلايا في مالازيز).
   1. تحت المجهر، عد الخلايا الملطخة لأربعة صفوف من مقياس الدم (أي 40 مربعا)، ثم احسب متوسط عدد الخلايا لصف واحد. حساب تركيز خلايا التعليق بتطبيق الطريقة التالية: عدد الخلايا / مل من التعليق = متوسط عدد الخلايا في صف واحد (10 مربعات) × 10 العدد الإجمالي للمربعات من تخفيف مقياس الدم × مع تريبان الأزرق × 1000 (للتعبير عن النتيجة كخلايا / مل).
4. جعل تعليق الخلية إلى تركيزين (5.6 × 10⁴ خلايا / مل و 1.12 × 10⁵ خلايا / مل) المقابلة لكثافة الطلاء اثنين (1 × 10⁵ خلايا / سم² و 2 × 10⁵ خلايا / سم²) باستخدام CDCM.
5. البذور 50 ميكرولتر من تعليق الخلية اثنين في اثنين من لوحات ثقافة 96 جيدا السوداء المعالجة مسبقا. توزيع الخلايا في لوحات مع ماصة متعددة القنوات من يمين لوحة إلى اليسار، والتجانس بين كل عمود، بحيث توزيع الخلايا متجانسة.
6. إضافة 50 ميكرولتر من مكتبة الجزيئات (على سبيل المثال، الوسائط المكيفة من مكتبة cDNA، انظر أدناه) ليتم فحصها باستخدام نمط محدد مسبقا(الجدول 1).
7. احتضان لوحات لمدة سبعة أيام في 37°C تحت 5٪ CO₂ مع عدم وجود تغيير في وسائل الإعلام.

6. عد خلايا قابلة للحياة

1. إلى كل بئر من لوحة، إضافة 2.7 ميكرومتر من كالسين AM و 0.3 mM من ethidium homodimer.
   ملاحظة: يخترق كالسين الخلايا التي لا يمكن نفاذها إلى جزيئات كبيرة مثل ethidium homodimer. في السيتوبلازم من الخلايا الحية، هو hydrolyzed calcein بواسطة esterases الذاتية، يصبح الفلورسنت عن طريق انبعاث في 520 نانومتر عندما متحمس في 485 نانومتر. Ethidium homodimer ربط الحمض النووي على الخلايا الميتة. Ethidium الحمض النووي homodimer ملزمة يسبب الفلورسينس الأحمر أن تنبعث في 635 نانومتر بعد الإثارة في 520 نانومتر.
2. احتضان لوحات لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في غياب الضوء.
3. اقرأ الفلورسينس على قارئ لوحة آلي يتكون من مجهر مقلوب مجهز بمصباح زئبق مع فلترين للإثارة على 485 و520 نانومتر، ومرشحين للانبعاثات عند 520 و635 نانومتر، وهدف (x10)، ومرحلة آلية يسيطر عليها معالج وكاميرا جهاز مقترنة بالشحن (CCD). يتم التحكم في هذه المنصة العد من قبل برنامج التحول¹⁹. فإنه يجعل من الممكن الحصول على صور مضان من الخلايا الحية والخلايا الميتة في وقت واحد في كل بئر من لوحة 96 جيدا، بدءا من الآبار A1 نحو A12 جيدا، ثم B12 نحو B1، C1 نحو C12 وهلم جرا(الجدول I).
4. حساب متوسط مساحة A من خلية واحدة باستخدام الآبار 18 من الضوابط السلبية (الجدول 1).
5. عد الخلايا في كل بئر من لوحة وتطبيق الصيغة التجريبية التالية A x 29 / 20.7 لمنع أن يتم احتساب doublets الخلية (تجميع خليتين). تسجيل التأثير الوقائي للمخاريط حسب الجزيئات كنسبة بين متوسط عدد الخلايا في الآبار 4 حيث اختبرنا الجزيء مقابل متوسط عدد الخلايا في الآبار ال 18 للتحكم السلبي (انظر الجدول 1 والشكل التكميلي 1).
6. الجمع بين نتائج لوحة المصنف في 1 × 10⁵ خلايا / سم² مع واحد المصنف في 2 × 10⁵ خلايا / سم 2 لتقييم الحماية المحتملة^(نسبة الجدوى) من قبل كل جزيء فحصها.

النتائج

نحن نصف هنا كيف يمكن استخدام نظام الثقافة المخصب بالمخروط لتحديد المخروط الجديد الذي يحمي البروتينات. استخدمنا هذا البروتوكول لفحص مكتبة cDNA طبيعية مصنوعة من ظهارة مصطبغة المشيمية والشبكية من 400 عين من الفئران لونغ إيفانز 8 أسابيع من العمر⁴³.

تحتوي هذه المكتبة على 6.0 × 10⁶ مستعمرات مستقلة تشكل وحدات (CFUs) ويبلغ متوسط حجم إدراج المستنسخة 2.1 كيلوبايت (kb) ، مع أكبر من 99٪ من المستنسخين المؤتلفين. وقد تم نقل برك من 100 مستنسخ من تلك المكتبة بشكل عابر (0.1 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد) إلى خلايا COS-1 وتم حصاد المتوسطة المكيفة (CM) من COS-1 بعد الحضانة لمدة 48 ساعة في DMEM بدون مصل. لم تتم إزالة الأغشية أو الاكسوسومات عن طريق الطرد المركزي الفائق. تمت إضافة خمسين ميكرولتر من كل سم إلى 4 آبار من اثنين من لوحات 96 بئر: واحدة بذر في 2 × 10⁵ خلايا / سم²، والآخر في 4 × 10⁵ خلايا / سم². تم استخدام CM من خلايا COS-1 المصابة بالمتجه الفارغ pcDNA3.1 المستخدم في بناء المكتبة كتحكم سلبي(الجدول 1). وتم تقييم ما مجموعه 112 2 مجموعة من 100 مستنسخ مقابل 200 211 مستنسخ فردي في أربعة آبار ثقافية ولشرطين من شروط البذر في الثقافات المخصبة بالمخروط. ويتوافق الشرطان مع كثافتين تلقيح مختلفتين قليلا مما يجعل من الممكن تقييم النشاط الوقائي بدقة أكبر، لما مجموعه 600 689 1 بئر من آبار الثقافة.

من بين 42 بركة من المستنسخين بنسبة أكبر من 2، برك 0080 و 0073 لديها نسبة البقاء 16 و 14 مرة أعلى بعد 7 أيام من الثقافة من السيطرة السلبية، pcDNA3.1 (الشكل التكميلي 1). وهذا التحليل ضروري لتحديد مجمعات الاهتمام. تم تقسيم كل مجموعة مختارة من 100 استنساخ إلى 16 مجموعة من 10 استنساخ من مخزونها من الجلسرين. وقد أعدت هذه المجمعات الفرعية واختبرت وفقا لنفس الطريقة في جولة ثانية من الفحص (أي ما مجموعه 200 3 بئر ثقافة). أعطى المجمع الفرعي 0073-09 أقوىنسبة صلاحية (الشكل التكميلي 2A)وتم تقسيمه لإنتاج 16 استنساخا فرديا تم اختباره في جولة ثالثة من الفحص على الثقافات المخصبة بالمخروط. استنساخ 0073-09-37 استنساخ تبرز بوضوح من الآخرين مع نسبة البقاء على قدم المساواة إلى 2.5(الشكل التكميلي 2B). محور ص له مقياس مختلف حتى لو كانت كثافة البذر هي نفسها مما كانت عليه في الشكل التكميلي 2A. وقد رأينا ذلك عادة عندما تتكرر المقايسات أسبوعيا لعدة أشهر. بعد التحليل، تؤكد هذه النتائج أن استنساخ 0073-09-37 له تأثير قوي وقابل للاستنساخ على بقاء المخروط. تكرر الاختبار بشكل مستقل(الشكل 3A)،وتم تسلسل إدراج 1.8 كيلوبايت(الشكل 3B).

كشف تحليل المعلوماتية الحيوية أن استنساخ 0073-09-37، التي أطلقنا عليها اسم عامل حيوية المخروط المشتقة من الظهارة (EdCVF) ، تحتوي على ثلاثة إطارات قراءة مفتوحة (ORFs) ، واحدة أكثر ترميز المنبع (ORF1) ل 84 بقايا الجزء C-terminal من بروتين الفئران بروتين إصبع الزنك -180 (ZFP180 ، NP_653358) من 727 الأحماض الأمينية⁴⁴. أما ال ORFs الآخران (ORF2 و ORF3) فأقل حفظا بكثير في الفئران وتغيبا في الثدييات الأخرى. عند اختبارها بشكل مستقل، فقط ORF1 يمارس تأثير وقائي على المخاريط(الشكل التكميلي 3). تم إنتاج ORF1 كبروتين اندماج الجلوتاثيون S-transferase (GST)(الشكل 4A). تم تنقية البروتين EdCVF وإزالة علامة GST (الشكل 4B). EdCVF قادرة على منع انحطاط مخروط في نظام الثقافة المخصب مخروط(الشكل 4C).

الشكل 1: أجنة الدجاج في المراحل^{28 و}29 و 30^من التطور. السهام W: الجناح، C: طوق وباء: مشروع قانون. شريط مقياس 1 سم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تشريح شبكية العين من جنين الدجاج الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: معامل حيوية المخروط المشتقة من الظهارة (EdCVF)، استنساخ 0073-09-37. أ. زيادة الجدوى على الثقافة المخصبة بالمخروط. باء - ال 20 في المائ تسلسل استنساخ cDNA 0073-09-37. التسلسل المسطر GAATTC هو موقع تقييد EcoRI المستخدم في إنشاء المكتبة. وCODONS GTG اثنين في جريئة هي مواقع بدء الترجمة غير شائعة لEdCVF الناشئة من ناقلات. التحليل الإحصائي حسب اختبار الطالب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: نشاط EdCVF المؤتلف. باء - ال 20 في المائ بروتين إدكف المؤتلف المنقى. جيم - الدوائر التي لا يمكن أن النشاط الغذائي من GST-EdCVF على مخروط في الثقافة. التحليل الإحصائي باستخدام اختبار توكي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: نسبة متوسط عدد الخلايا لتجمع cDNA والتحكم السلبي، وهي الوسيلة المكيفة لخلايا COS-1 التي يتم إصابةها بالنواقل الفارغ pcDNA3.1 خلال الجولة الأولى من الفحص. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. 

تكميلية الشكل 2: عدد الخلايا الحية. أ. الجولة الثانية من الفحص مع برك فرعية من 0073 حمام سباحة. باء - ال 20 في المائ الجولة الثالثة من الفحص مع استنساخ معزولة. CN: المتوسطة المكيفة لخلايا COS-1 التي يتم إصابةها بالمتجه الفارغ pcDNA3.1. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: النشاط الغذائي لثلاثة إطارات القراءة المفتوحة للنسخة المعزولة 0073-09-37. تحليل إحصائي باستخدام اختبار دونيت. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	1	1	1	1	2	NC	2	2	2	3	3	NC
B	NC	3	3	4	4	4	NC	4	5	5	5	5
سي	6	NC	6	6	6	7	7	NC	7	7	8	8
D	8	8	NC	9	9	9	9	10	NC	10	10	10
E	11	11	11	NC	11	12	12	12	12	NC	13	13
و	13	13	14	14	NC	14	14	15	15	15	NC	15
G	16	16	16	16	17	NC	17	17	17	18	18	NC
ح	18	18	19	19	19	19	NC	20	20	20	NC	20
NC الضوابط السلبية
1-20 مواقف من برك اختبارها في أربع مرات

الجدول 1: خطة لوحة من 96 بئرا لفحص المحتوى العالي

Discussion

من بين العديد من المعلمات التي قد تحد من إنتاج ثقافة المخصب مخروط من أجنة الدجاج، والخطوة الحاسمة الأولى هي تحديد دقيق لمرحلة تطور الأجنة في البويضات المفقسة. وقد لوحظ أن ثقافة الخلايا من شبكية العين من الأجنة في ED8 (34^{المرحلة)} تنتج فقط 35٪ مستقبلات ضوئية، مع 65٪ المتبقية مصنوعة من الخلايا العصبية الأخرى⁴. مهما كانت اللوجيستية المطبقة للحصول على البويضات المفقسة، فمن الضروري ضبط درجة الحرارة ووقت الحضانة، وفحص الأجنة بعناية بالمقارنة مع الصور المرجعية لجميع مراحل التطور^42،45.

في الأصل ، تم تطوير نظام الثقافة المخصب بالمخروط باستخدام سلالة وايت ليغورن^4. اللون الأبيض للبيض من تلك السلالة لا يحظى بتقدير خاص في فرنسا ، لذلك استخدمنا سلالة من الدجاج التي تنتج البيض البني. نحن استخدام سلالة I 657، الذي يتم عن طريق عبور أنا 66 الديكة مع الدجاج JA57⁵. تمكنا من إعادة إنتاج خصائص الثقافات الأصلية. وهذا يدل على أن الخلفية الوراثية للدجاج ليست حاسمة للحصول على الثقافات المخصبة بالمخروط.

لم نختبر تأثير الإزالة الفردية للمكملات الغذائية في وسط الثقافة ، ولكن لاحظنا أن الأنسولين يلعب دورا حاسما وفقا لتأثير الأنسولين على بقاء المخاريط في الماوس rd1 ، وهو نموذج من RP⁴⁶المتنحية الذاتية. تريودوثيريونين (T3) قد تشارك أيضا في التفريق بين خلايا السلائف الشبكية من جنين الدجاج إلى المخاريط وفقا لدور مستقبلات هرمون الغدة الدرقية في مصير خلايا الشبكية خلال التنمية⁴⁰. وبالتالي، لا يمكن استخدام نظام الثقافة المخصب بالمخروط لتحديد الأنسولين عن طريق استنساخ التعبير^46.

يعتمد نظام الثقافة المخصب بالمخروط على ثقافة الخلايا العصبية الأولية وهو أكثر ملاءمة بكثير من أساليب ثا التي تعتمد على استخدام الخلايا الخالدة كخط الخلية 661W^24،25،26.

يمكن تعديل الطريقة الموضحة هنا عن طريق إجراء عملية كهربية سابقة مع الحمض النووي البلازميد^20. قبل إعداد تعليق الخلية الشبكية، يتم وضع شبكية العين بأكملها في غرفة كهربائية مصنوعة خصيصا مع 120 ميكرولتر من 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد في 10 mM تريس-HCl درجة الحموضة 8.0، 1 mM EDTA. يتم تطبيق خمس نبضات من 15 V ل 50 مللي ثانية لكل منهما مفصولة بفاصل 950 مللي ثانية^22. محاولات لتقديم التدخل الجيش الملكي النيبالي (RNAI) باستخدام النسخ المتماثل المختصة الطيور لصق (RCAS) الفيروسات الرجعية في الثقافات المخصبة مخروطية كانت غير ناجحة⁴⁷. ويرجع ذلك بالتأكيد إلى حقيقة أنه في غياب المصل وفي الثقافات ذات الكثافة المنخفضة ، فإن خلايا السلائف الشبكية ليست متماثلة ، وهو شرط لنشر الفيروسات الرجعية.

طورنا نظام الثقافة المخصب بالمخروط لتحديد العوامل الغذائية التي تعزز بقاء المخروط باستخدام استنساخ التعبير^19. من أجل جعلها ممكنة ، قمنا بخطوة أولى من فحص المحتوى العالي باستخدام وسيط مشروط من برك من 100 مستنسخ. وحتى لو أعرب عن ال CDNAs من المكتبة تحت سيطرة مروج CMV قوي بعد إعادة إصابة خلايا COS-1، فإنه لا يقدم ضمانا بأن جميع البروتينات المشفرة بواسطة cDNAs الفردية تصل إلى تركيز كاف ليتم تسجيلها إيجابيا من خلال تقييم الجدوى. هذا هو القيد الرئيسي. وبهذا المعنى، فإن أي فحص ليس شاملا حقا. بالإضافة إلى ذلك ، حتى لو لم تتم إزالة البروتينات الممبرانية من الوسط المكيف ، فإن تكوين المقايسة غير موات لتحديد العوامل غير المنتشرة. والبديل هو فحص المستنسخين الأفراد بعد الحصول على تسلسل ال CDNAs من أجل تجنب الازدواجية في قياس نفس البروتين المرشح عدة مرات. وقد بدأ هذا عن طريق تسلسل مكتبات cDNA الشبكية استخدمنا⁴³. ورغم أن هذا النهج عقلاني، إلا أنه له أيضا حدوده. وسيفرض التحليل المعلوماتي الحيوي لتسلسلات الهيئة، إلى جانب الحد من التكرار، ترتيب أولويات فحص بعض المستنسخين استنادا إلى المعرفة. وهذا لن يكون ضارا إذا تم فحص المكتبة بأكملها في النهاية حتى لو تم إطالة الوقت اللازم للقيام بذلك بشكل كبير. ولكن دائما، هوية التسلسل سوف تؤثر على طريقتنا في النظر إلى النتائج. وهذا لن يكون محايدا لأن تفسير التسلسل سيكون بطبيعة الحال في منافسة مع البيانات التجريبية.

كما يظهر تحديد EdCVF أن فحص المحتوى العالي ينطوي على قيود تقنية. من الجولة الأولى من الفحص، حددنا اثنين من حمامات السباحة مع نشاط عالية(الشكل التكميلي 1). أدى المجمع 0073 إلى تحديد ناجح ل EdCVF ، في حين أن المجمع 0080 لم يتصرف لمثل هذه النتيجة. لم نحل المشكلة التي يمكن أن تنتج عن فقدان استنساخ نشط أثناء إعداد برك فرعية. وبدلا من ذلك، لا يستبعد، حتى وإن لم يكن مواتيا إحصائيا، أنه من بين ال CDNAs للجمع 0080، كان بروتينان يعملان بشكل تآزري ولم يكن من الممكن ملاحظة نشاطهما كمستنسخين فرديين.

تحديد الجزيئات التي تحمي المخاريط عن طريق فحص الجزيئات الصغيرة هو تطبيق مستقبلي لنظام الثقافة المخصب بالمخروط. وستكون هذه الجزيئات لا تقدر بثمن لعلاج أمراض الشبكية التي العلاج الجيني ليس النهج الأنسب مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 black plates (Clear Button with lid Tissue culture treated)	Corning	3603
Calcein AM	Thermo-Fisher scientific	C1430
CCD Camera	Photometrics	CoolSnap  FX HQ
CDPC (Cytidine 5′-diphosphocholine sodium salt dihydrate)	Sigma-Aldrich	C0256
CO2 Independant	Thermo-Fisher scientific	18045-054
Curved forceps	Dutscher	005093
DMEM Media	Thermo-Fisher scientific	41966-029
DNAse	Sigma-Aldrich	D4263
Eggs incubator	FarmLine	M08 01 3100
Ethidium Homodimer	Thermo-Fisher scientific	E1169
Fœtal bovine serum	Thermo-Fisher scientific	10270-098
Gentamycin	Thermo-Fisher scientific	15710-049
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0880
ITS (insulin Transferine selenium)	Sigma-Aldrich	I1884
large straight pliers	Dutscher	005074
Linoleic acid	Sigma-Aldrich	L8384
M199 medium	Thermo-Fisher scientific	31150-022
Metamorph software	Metamorph
Microscope	NIKON	Eclipse TE2000
Motorized stage	Martzauzer	Mutlicontrol 2000
Optical filter switch	Shutter Instrument company	Lambda 10-2
PBS 1X	Thermo-Fisher scientific	14190-086
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P6282
Progesterone	Sigma-Aldrich	P7556
Pursept A express	Fisher scientific	11814110
Putriscine	Sigma-Aldrich	P5780
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636
straight forceps	Dutscher	005092
Taurine	Sigma-Aldrich	T8691
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T6397
Trypan blue	Thermo-Fisher scientific	15250-061
Trypsine 0.25 %	Thermo-Fisher scientific	25200-056