Обогащенные конусом культуры из сетчатки куриных эмбрионов для изучения клеточных взаимодействий между палочками и конусами

Резюме

Описан способ получения первичных культур колбочка фоторецепторов из сетчатки куриных эмбрионов и его использование для скрининга высокого содержания.

Аннотация

Дневное зрение человека опирается на функцию колбочных фоторецепторов в центре сетчатки, ямки. Пациенты, страдающие наиболее распространенной формой наследственной дегенерации сетчатки, пигментным ретинитом, теряют ночное зрение из-за мутационной потери палочковых фоторецепторов, явления, за которым следует прогрессирующая потеря функции и смерть колбочка, приводящая к слепоте. Генетики идентифицировали много генов с мутациями, вызывающими это заболевание, но первые выявленные мутации поставили под сомнение механизмы вторичной конусной дегенерации и то, как доминантная мутация в гене родопсина, кодирующая визуальный пигмент, экспрессируемый исключительно в палочках, может вызвать дегенерацию конуса.

Этот результат трансплантации в генетической модели заболевания привел к концепции клеточных взаимодействий между палочками и колбочками и неклеточной автономной дегенерации колбок во всех генетических формах пигментного ретинита.

Колбочки составляют 5% всех фоторецепторов у человека и только 3% у мышей, поэтому их изучение затруднено у этих видов, но колбочка превосходит по численности стержни у видов птиц. Мы адаптировали 96-колодезные пластины для культивирование предшественников сетчатки куриных эмбрионов на 29 стадии их развития. В этих первичных культурах колбчики составляют 80% клеток после дифференцировки in vitro. Клетки дегенерируют в течение одной недели при отсутствии сыворотки. Здесь мы опишем методы и их стандартизацию.

Эта обогащенная конусом система культивирования использовалась для идентификации фактора жизнеспособности конуса эпителия (EdCVF) путем скрининга высокого содержания пигментированной библиотеки кДНК пигментированного эпителия крыс. Рекомбинантный EdCVF предотвращает дегенерацию колбочих.

Введение

Сетчатка видов позвоночных двойственная, с палочковыми фоторецепторами для зрения тусклого света и колбочными фоторецепторами для дневного света, цвета и остроты зрения. Острота зрения приматов зависит от области в центре сетчатки, называемой ямкой, которая обогащена колбойками, но в целом колбки составляют только 5% всех фоторецепторов. Следовательно, анализ колбок у приматов сетчатки и особенно культуры колбок технически сложен. Все другие виды млекопитающих не имеют ямки, и процент колбочка низок для грызунов, которые чаще всего используются в исследованиях сетчатки. Это не относится к видам птиц, для которых колбки доминируют в сетчатке этих хорошо видящих видов птиц. Динозавры, которые доминировали в экосистеме, когда млекопитающие впервые появились во время эволюции, находятся у филогенетического происхождения птиц^1. Как следствие такой конкуренции между динозаврами и ранними млекопитающими, млекопитающие в основном ведут ночной образ жизни со сетчаткой, в которой доминируют стержни. Лишь позже в ходе эволюции суточное зрение некоторых видов млекопитающих, к числу которых принадлежат приматы, стало эволюционным преимуществом. Тем не менее, предкам период остается атавизмом ночного узкого места в эволюции зрения млекопитающих^2,3.

Изучая дифференцировку клеток сетчатки, Адлер и Хэтли показали, что фоторецепторы составляют примерно 70% дифференцированных клеток сетчатки в культурах, полученных из курицы на эмбриональном дне (ЭД) 6 или стадии 29^4. Из-за распространенности колбок в куриной сетчатке культуры клеток сетчатки из куриных эмбрионов ED6 были разработаны как обогащенные шишками^{культуры 5.}

Важность конусно-опосредопосредооченной остроты зрения для человека является трюизмом. Люди, страдающие генетическими или стареющими заболеваниями, которые изменяют функцию конуса, сильно ограничены. Это способствовало очень большому объему исследований наследственных дегенераций сетчатки (IRD) с целью поиска методов лечения этих ослепляющих заболеваний^6,7. Первый успех, полученный с использованием рекомбинантного аденоацепциированного вектора (AAV) для терапии тяжелой формы ВРОЖДЕННОГО АМАВРОЗА ЛЕБЕРА (LCA), является доказательством концепции генной терапии^8. Идентификация генов, мутации которых запускают IRD, открывает возможность излечения этих заболеваний с помощью генной терапии. Тем не менее, эти заболевания являются результатом мутаций в более чем 200 различных генах^9. Даже в случае аутосомно-рецессивных форм IRD, когда реинтродукция нормальной копии болезненного гена может восстановить зрительную функцию, экономические издержки каждого отдельного развития благоприятствуют наиболее распространенным в ущерб менее распространенным и тем, для которых генетическое происхождение остается неизвестным. Этот факт заставил исследователей задуматься о более общих методах лечения. Апоптотическая гибель клеток появилась как общий путь и терапевтическая мишень этих заболеваний, прогрессирующей за счет дегенерации фоторецепторов, в том числе для аутосомно-доминантных форм^10,11. Однако успехи такого подхода отсутствуют. Для наиболее распространенной формы IRD, пигментного ретинита (RP), общим путем является вторичная потеря функции, в конечном итоге сопровождаемая дегенерацией колбок^12,13. Предотвращение потери конусной функции позволит сохранить центральное зрение ямки независимо от причинных мутаций^14.

На ранней стадии RP потеря стержней вызывает снижение экспрессии фактора жизнеспособности конуса, полученного из стержня (RdCVF), кодируемого геном нуклеоредоксин-подобного 1(NXNL1),который прерывает метаболическую и окислительно-восстановительную передачу сигналов между палочками и колбочками^15. Введение рекомбинантного AAV, кодируя два продукта гена NXNL1, трофический фактор RdCVF и фермент тиоредоксин RdCVFL, теоретически может предотвратить потерю зрения конуса во всех генетических формах RP^16. Мы показали, что генный продукт NXNL1, RdCVFL, экспрессируется в^{культурах, обогащенных} куриными шишки 17 и где он играет защитную роль^18. RdCVF и ген NXNL1 были идентифицированы путем скрининга с высоким содержанием библиотеки кДНК сетчатки с использованием выживания клеток из культуры, обогащенной конусом, как показания^19. Мы проверили эквивалент 210 000 отдельных клонов библиотеки, используя 8 параллельных тестов для каждого клона. Это представляет собой очень большое количество тестов, требующих легкого доступа к биологическому материалу, сетчатке куриных эмбрионов. Мы обнаружили, что относительно легко получить эмбриональные куриные яйца на еженедельной основе, потому что они широко производятся для агропромышленности для кур-несушек и кур, производящих мясо. После тщательной стандартизации культур, обогащенных конусами, система обеспечивает простой, надежный и воспроизводимый способ тестирования тысяч молекул на их способность сохранять жизнеспособность конуса. Эти клетки также поддаются генетическим манипуляциям^20, которые приносят пользу изучению сигнальной трансдукции и биохимическим анализам^21,22,23.

Исследователи сетчатки разработали альтернативные методы, как использование колбочка клеточной линии 661W^24,25,26. Тем не менее, идентичность этой клеточной линии остается спорной^27,28. Клетки 661W были клонированы из опухолей сетчатки трансгенной линии мыши, которая экспрессирует большой Т-антиген SV40 под контролем человеческого интерфоторецепторного ретинол-связывающего промотора белка. Большой Т-антиген SV40 опосредует клеточную трансформацию и увековечивание. Как следствие, сигнальный путь, идентифицированный с использованием клеток 661W, должен быть представлен в контексте преобразованной и увековеченной клеточной линии, которая во многом отличается от колбочка in situ. В этом отношении система культуры, обогащенная конусами, состоит из первичных нейронов, колбок, которые более физиологически значимы.

Хотя можно получить чистую культуру фоторецепторов с помощью вибратомного сечения сетчатки мыши, очень низкий процент колбочка во внешней сетчатке грызунов делает этот подход непригодным для получения обогащенных конусами культур^29. Сетчатка свиньи не содержит ямки, но имеет область, называемую областью centralis, которая очень обогащена шишами^30. Высокая доля колбочек в суточных грызунах сетчатки, таких как Arvicanthis ansorgei и Psammomys obsesus^31,32,предлагает возможное решение, но требует разведения таких экзотических видов. Взрослые глаза свиней, собранные с местных скотобоен, могут быть использованы для получения смешанной культуры стержней и колбочка, которые были использованы для изучения выживания фоторецепторов^33. Элегантным решением является предварительная очистка колбочки от сетчатки свиньи с использованием паннинга с лектином арахисового агглютинина (PNA), который избирательно связывается с колбочками^34. Тем не менее, этот метод трудно реализовать в больших масштабах из-за его сложности.

Индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (iPS) предлагают наиболее перспективный подход к получению популяции колбочных фоторецепторных клеток, которые могут быть использованы для трансплантации сетчатки, но которые также могут быть адаптированы к обогащенной конусом культуре^35,36. Поскольку транскрипционный фактор NRL необходим для палочко-фоторецепторов^37,у Nrl-/- мыши сетчатка, в которой преобладают коротковолновые колбочки (S-колбочки). Инактивация может быть использована для получения S-конусного обогащенного препарата путем дифференциации человека от iPS^38,39. Другим возможным подходом является содействие дифференциации конуса с использованием сигналов гормонов щитовидной железы^40. В то время как появляются новые методы получения обогащенных конусами культур из человеческих iPS, куриные эмбрионы обеспечивают современный проверенный метод^19.

Культура, обогащенная конусом, сыграла важную роль в идентификации RdCVF путем выражения^{клонирования 19.} Эта система также была успешно использована для демонстрации того, что RdCVF стимулирует поглощение глюкозы и ее метаболизм аэробным гликолизом^22. Кроме того, обогащенная конусами культура использовалась для подтверждения защитной роли RdCVFL, второго продукта гена NXNL1 ^23. Совсем недавно эта система использовалась для демонстрации существования защитных молекул, секретируемых пигментированными эпителиальными клетками сетчатки, трансдуцированными OTX2^41.

протокол

Протокол был одобрен Комитетом по этике экспериментов на животных Университета Пьера и Марии Кюри и министерством исследований Франции (номер разрешения: APAFIS#1028 2015070211275177). Эксперименты на животных проводились под следующим разрешением: «Certificat d'autorisation d'expérimenter sur les animaux vertébrés A-75-1863. Префектура полиции Парижа (9 ноября 2011 года — 8 ноября 2016 года)».

1. Инкубация оплодотворенных яйцеклеток

1. Собирают еженедельно оплодотворенные яйца (штамм I 657, красная этикетка), полученные естественным путем, в промышленном инкубатории.
2. Поддерживайте оплодотворенные яйцеклетки при 17°C (их биологический ноль) в лаборатории после того, как они будут «отложены» курицей.
3. Для каждой культуры инкубируют семь оплодотворенных яиц в течение 24 часов при 20 °C, а затем 136 часов при 37 °C с прерывистым возвратом склона (прогрессирующее движение в течение 2 часов из одной стороны в противоположную, 4-часовой цикл) яиц в увлажненной камере.

2. Восстановление куриных эмбрионов

1. Вымойте поверхность семи яиц дезинфицирующим средством (например, экспрессом Pursept A).
2. Чтобы разбить яичную скорлупу, сделайте отверстие в верхней части скорлупы крупными прямыми плоскогубцами. Затем нарежьте скорлупу, чтобы снять шляпку с яйца в виде яйца всмятку.
3. Осторожно извлеките каждый эмбрион из яичной скорлупы изогнутыми щипцами, а затем перенесите его в чашку Петри, содержащую стерильный фосфатный буферный физиологический раствор (PBS), предварительно нагретый до 37 °C. Аккуратно удалите оболочку, которая окружает эмбрионы (хорион или хориоаллантоическую мембрану).
4. Проверьте стадию развития каждого эмбриона путем визуального сравнения с Гамбургером и Гамильтоном^42.
5. Отобрать два эмбриона на^29-й стадии развития(рисунок 1). Крылья сгибаются в локтях. Воротник заметно выделяется. Законопроект более заметен, чем на^28-м этапе.
6. Энуклеат глаз этих отобранных эмбрионов и перенос их в_{СО2-независимую среду}(life technologies).
   ВНИМАНИЕ: Очень важно, чтобы эмбрион находился на стадии 29, а не на стадии 28 или 30(рисунок 1); именно поэтому необходимо высиживать не менее 7 яиц, даже если окончательно будут использованы только два. Хорион очень тонкий, поэтому его трудно отличить, но он очень близок от эмбриона, поэтому его приходится удалять, не касаясь эмбриона.

3. Рассечение сетчатки

1. Обезглавливают и энуклеируют отобранные эмбрионы изогнутыми щипцами.
2. Перенесите четыре глаза в_CO2-независимую среду. Эта среда содержит 0,9 мМ CaCl₂ и 0,65 мМ MgCl_2.
3. Расположите глаз роговицей лицом вниз, зрительный нерв лицом к экспериментатору. Просверлите отверстие в зрительном нерве с помощью двух прямых щипцов.
4. Вставьте ветвь каждого щипца между сетчаткой и пигментным эпителием(рисунок 2). Потяните за каждый щипц и поверните глаз, чтобы отсоедить эпителий от сетчатки. Удалите роговицу, затем хрусталик и стекловидное стекло.
5. Перенесите четыре сетчатки в чашку Петри, содержащую среду Рингера при рН 7,2.
   ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что осталась только сетчатка, и удалите любые следы стекловидного и оставшегося пигментированного эпителия сетчатки.

4. Приготовление суспензии клеток сетчатки

1. Разрежьте четыре сетчатки на очень маленькие кусочки, используя два прямых плоскогубцев.
2. Дважды вымойте кусочки сетчатки средой Рингера.
3. После второго промывания средой Рингера дайте кусочкам сетчатки упасть на дно трубки и удалите среду Рингера. Обработать кусочки сетчатки в течение 20 минут при 37 °C раствором трипсина (0,25% мас./об.).
4. Диспергировать раствор через 10 мин путем последовательного всасывания. Разгрузка с помощью пипетки Пастера и проверка на диссоциацию кусочков сетчатки. Остановите реакцию, добавив культуральную жиму, дополненную 10% инактивированной сывороткой для телят плода.
5. Инкубируют клеточную суспензию с 0,05 мг ДНКазы I. Диссоциируют клеточные кластеры и ДНК путем последовательного всасывания и разрядки с помощью пипетки Пастера сразу после добавления ДНКазы.
6. Промыть суспензию клеток сетчатки дважды химически определенной культуральной средой (CDCM): равный объем модифицированной среды Eagle Medium от Dulbecco и среды M199, дополненной 100 мкг/мл линолевой кислоты/BSA, 0,86 мкМ инсулина, 0,07 мкМ трансферрина, 2,0 мкМ прогестерона, 0,28 мкМ простагландина, 0,29 мкМ Na₂SeO_3,182 мкМ путресцина, 3 мМ таурина, 4,7 мкМ цитидина 5'-дифосфохолина, 2,7 мкМ цитидина 5′-дифосфоэтаноламина, 0,55 мкМ гидрокортизона, 0,03 мкМ трийодтиронина, 1 мМ пирувата натрия и 20 мкМ гентамалин.

5. Посев клеток сетчатки

1. Обработать две черные 96-луночные культуральные пластины с прозрачным дном в течение 2 часов при 37 °C поли-L-лизином при 32,25^{мкг/см2.}
2. Промыть эти пластины дважды питательной средой M199. Повторно суспендируют клеточную гранулу в 1 мл CDCM.
3. Добавьте к аликвоте 10 мкл клеточной суспензии трипан синего цвета, чтобы окрасить живые клетки. Добавьте образец суспензии клеток в гемоцитометр (клеточная счетная камера Малассеза).
   1. Под микроскопом подсчитайте окрашенные клетки для четырех рядов гемоцитометра (т.е. 40 квадратов), а затем вычислите среднее число клеток для одной строки. Рассчитайте концентрацию клеток суспензии, применив следующий метод: Количество ячеек/мл суспензии = среднее количество ячеек подряд (10 квадратов) x 10 общее количество квадратов гемоцитометра x разбавление трипановым синим x 1000 (для выражения результата в виде клеток/мл).
4. Доведите клеточную суспензию до двух концентраций (5,6^{x 10 4} клеток/мл и 1,12 x^{10 5} клеток/мл), соответствующих двум плотностям покрытия (1 x 10⁵ клеток/см2 и 2 x 10⁵ клеток/см2) с помощью CDCM.
5. Посеять 50 мкл двухклеточных суспензий в две предварительно обработанные черные 96-скважинные культуральная пластины. Распределите ячейки по пластинам многоканальной пипеткой справа от пластины слева, гомогенизируя между каждой колонкой, чтобы распределение ячеек было однородным.
6. Добавьте 50 мкл библиотеки молекул (например, условных сред из библиотеки кДНК, см. ниже) для скрининга с использованием предопределенного шаблона(таблица 1).
7. Инкубировать пластины в течение семи дней при 37°C при 5% CO₂ без изменения среды.

6. Подсчет жизнеспособных клеток

1. К каждой скважине пластины добавляют 2,7 мкМ кальциина АМ и 0,3 мМ гомодимера этидия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кальцеин проникает в клетки, которые непроницаемы для больших молекул в виде гомодимера этидия. В цитоплазме живых клеток кальциин гидролизуется эндогенными эстеразами, становится флуоресцентным, испуская при 520 нм при возбуждении при 485 нм. Гомодимер этидия связывается с ДНК на мертвых клетках. Связывание этидия с ДНК-гомодимером вызывает красную флуоресценцию при 635 нм после возбуждения при 520 нм.
2. Инкубировать пластины в течение 1 часа при комнатной температуре при отсутствии света.
3. Считывание флуоресценции на автоматизированном пластинчатом считывателе, состоящем из перевернутого микроскопа, оснащенного ртутной лампой с двумя фильтрами возбуждения на 485 и 520 нм, двумя фильтрами излучения на 520 и 635 нм, объективом (x10), моторизованной ступенью, управляемой процессором и камерой устройства с зарядовой связью (ПЗС). Эта счетная платформа управляется программным обеспечением Metamorph^19. Это позволяет получать флуоресцентные изображения живых клеток и мертвых клеток одновременно в каждой скважине 96-скважинной пластины, начиная от скважин А1 к скважине А12, затем В12 к В1, С1 к С12 и так далее(Таблица I).
4. Рассчитать среднюю площадь А одной ячейки, используя 18 скважин отрицательных контрольных элементов(Таблица I).
5. Подсчитайте ячейки в каждой скважине пластины и примените следующую эмпирическую формулу A x 29 / 20.7, чтобы предотвратить подсчет дублетов клеток (группировки двух ячеек). Оценить защитное действие колбок по молекулам как отношение между средним числом клеток в 4 скважинах, где мы тестировали молекулу, и средним числом клеток в 18 скважинах отрицательного контроля (см. Таблицу 1 и Дополнительный рисунок 1).
6. Объедините результаты посеянных пластин при 1 х 10⁵ клеток/см2 с результатами, посеянных при 2 х 10⁵ клетках/см2, чтобы оценить потенциальную защиту (коэффициент жизнеспособности) каждой экранируемой молекулы.

Результаты

Здесь мы описываем, как система культивированной конусом может быть использована для идентификации новых белков, защищающих конус. Мы использовали этот протокол для скрининга нормализованной библиотеки кДНК, состоящей из пигментированного эпителия сосудистой оболочки и сетчатки из 400 глаз 8-недельных крыс Лонг-Эванса^43.

Эта библиотека содержит 6,0 x 10⁶ независимых колоний, образующих единицы (КОЕ) и имеет средний размер клонированной вставки 2,1 килобаза (кб), с более чем 99% рекомбинантных клонов. Пулы из 100 клонов из этой библиотеки были временно трансфектированы (0,1 мкг плазмидной ДНК) в клетки COS-1, а кондиционированная среда (CM) COS-1 была собрана после инкубации в течение 48 часов в DMEM без сыворотки. Мембраны или экзосомы не удалялись ультрацентрифугированием. Пятьдесят микролитров каждого СМ были добавлены к 4 скважинам двух 96-луночных пластин: одна засеяна на 2^{х 10 5} клеток/^см2,другая на 4 х 10⁵ клеток /^см2. CM из клеток COS-1, трансфектированных пустым вектором pcDNA3.1, использованным для построения библиотеки, использовался в качестве отрицательного контроля(таблица 1). В общей сложности 2 112 наборов из 100 клонов, соответствующих 211 200 отдельным клонам, были оценены в четырех культурных колодцах и для двух условий посева обогащенных конусами культур. Эти два условия соответствуют двум несколько различным плотностям прививки, что позволяет более точно оценить защитную активность, в общей сложности 1 689 600 культурных скважин.

Среди 42 пулов клонов с соотношением больше 2 пулы 0080 и 0073 имеют коэффициент жизнеспособности в 16 и 14 раз выше после 7 дней культивирования, чем отрицательный контроль, pcDNA3.1(Дополнительный рисунок 1). Этот анализ имеет важное значение для выявления пулов, представляющих интерес. Каждый выбранный пул из 100 клонов был разделен на 16 наборов по 10 клонов из их глицеринового запаса. Эти подгруппы были подготовлены и испытана в соответствии с тем же методом во втором раунде скрининга (т.е. в общей сложности 3 200 культурных скважин). Подгруппа 0073-09 дала самый сильный коэффициент жизнеспособности(дополнительный рисунок 2A)и была подразделена для получения 16 отдельных клонов, которые были протестированы в третьем раунде скрининга на культурах, обогащенных конусами. Клон 0073-09-37 явно выделяется на других с коэффициентом жизнеспособности, равным 2,5(Дополнительный рисунок 2B). Ось y имеет другую шкалу, даже если плотность посева была такой же, как на дополнительном рисунке 2A. Мы часто видели это, когда анализы повторяются еженедельно в течение нескольких месяцев. После анализа эти результаты подтверждают, что клон 0073-09-37 оказывает надежное и воспроизводимое влияние на выживание конуса. Тест повторяли независимо(рисунок 3A),а вставку 1,8 кб секвенировали(рисунок 3B).

Биоинформатический анализ показал, что клон 0073-09-37, который мы назвали фактором жизнеспособности конуса эпителия (EdCVF), содержит три открытых кадра считывания (ORF), один из которых наиболее восходящий (ORF1) кодирует 84 остатка С-концевой части белка крысы цинкового пальца-180 (ZFP180, NP_653358) из 727 аминокислот^44. Два других ORF (ORF2 и ORF3) гораздо менее хорошо сохраняются у мышей и отсутствуют у других млекопитающих. При независимом тестировании только ORF1 оказывает защитное действие на колбок(дополнительный рисунок 3). ORF1 продуцировали в виде белка слияния глутатион S-трансферазы (GST)(рисунок 4A). Белок EdCVF очищали, а метку GST удаляли(рисунок 4B). EdCVF способен предотвращать конусную дегенерацию в системе культур, обогащенной конусами(рисунок 4C).

Рисунок 1:Куриные эмбрионы на 28-й,29-й и 30-й стадиях развития. Стрелки W: крыло, C: воротник и B: клюв. Шкала 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2:Рассечение сетчатки куриного эмбриона Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3:Коэффициент жизнеспособности конуса эпителия (EdCVF), клон 0073-09-37. А. Повышенная жизнеспособность на конусной обогащенной культуре. В. Последовательность клона кДНК 0073-09-37. Подчеркнутая последовательность GAATTC представляет себя сайтом ограничения EcoRI, используемым для создания библиотеки. Два кодона GTG, выделенные жирным шрифтом, являются необычными сайтами инициации перевода для EdCVF, происходящими из вектора. Статистический анализ по студенческому тесту. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4:Рекомбинантная активность EdCVF. A. Последовательность EdCVF при слиянии с глутатион S-трансферазой (GST). В. Очищенный рекомбинантный белок EdCVF. С. Трофическая активность GST-EdCVF на конусе в культуре. Статистический анализ с использованием теста Туки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Соотношение среднего числа клеток для пула кДНК и отрицательного контроля, кондиционированной среды клеток COS-1, трансфекционированных пустым вектором pcDNA3.1 во время первого раунда скрининга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. 

Дополнительно Рисунок 2: Количество живых клеток. А. Второй раунд скрининга с подгруппами пула 0073. В. Третий раунд скрининга с изолированными клонами. CN: кондиционированная среда клеток COS-1, трансфекционированных пустым вектором, pcDNA3.1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок3: Трофическая активность трех открытых кадров считывания изолированного клона 0073-09-37. Статистический анализ с использованием теста Даннетта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
ля	1	1	1	1	2	ЧПУ	2	2	2	3	3	ЧПУ
си	ЧПУ	3	3	4	4	4	ЧПУ	4	5	5	5	5
до	6	ЧПУ	6	6	6	7	7	ЧПУ	7	7	8	8
ре	8	8	ЧПУ	9	9	9	9	10	ЧПУ	10	10	10
ми	11	11	11	ЧПУ	11	12	12	12	12	ЧПУ	13	13
фа	13	13	14	14	ЧПУ	14	14	15	15	15	ЧПУ	15
соль	16	16	16	16	17	ЧПУ	17	17	17	18	18	ЧПУ
ч	18	18	19	19	19	19	ЧПУ	20	20	20	ЧПУ	20
Отрицательный контроль ЧПУ
1-20 позиций пулов, протестированных в четырехкратном размере

Таблица 1: План плиты из 96 скважин для отбора высокого содержания

Обсуждение

Среди многих параметров, которые могут ограничить производство обогащенной конусами культуры из куриных эмбрионов, первым критическим шагом является точное определение стадии развития эмбрионов в инкубационных яйцах. Было замечено, что культура клеток из сетчатки эмбрионов на ED8 (34-я стадия) продуцирует^только 35% фоторецепторов, а остальные 65% состоят из других нейронов^4. Какой бы ни была логистика, применяемая для получения инкубированных яиц, необходимо точно настроить температуру и время инкубации, а также тщательно изучить эмбрионы по сравнению с эталонными картинами всех стадий развития^42,45.

Первоначально система культивируемых культур, обогащенных конусами, была разработана с использованием штамма White Leghorn^4. Белый цвет яиц этого сорта не особенно ценится во Франции, поэтому мы использовали штамм курицы, который производит коричневые яйца. Мы использовали штамм I 657, который производится путем скрещивания петухов I 66 с курами JA57^5. Мы смогли воспроизвести характеристики самобытных культур. Это показывает, что генетический фон курицы не критичен для получения обогащенных конусами культур.

Мы не тестировали эффект индивидуального удаления добавок в культуральной среде, но наблюдали, что инсулин играет решающую роль в соответствии с влиянием инсулина на выживаемость колбок у мыши rd1, модель аутосомно-рецессивного RP^46. Трийодтиронин (Т3) может также участвовать в дифференцировке клеток-предшественников сетчатки куриного эмбриона в колбюшки в соответствии с ролью рецептора гормона щитовидной железы в судьбе клеток сетчатки во время развития^40. Следовательно, обогащенная конусом система культивирования не может быть использована для идентификации инсулина путем экспрессии^{клонирования 46.}

Система культуры, обогащенная конусами, опирается на культуру первичных нейронов и гораздо более уместна методам, опирающимся на использование увековеченных клеток в качестве клеточной линии 661W^24,25,26.

Описанный здесь способ может быть модифицирован путем выполнения предварительной электропорации с плазмидной ДНК^20. Перед приготовлением суспензии клеток сетчатки всю сетчатку помещают в камеру изготовленного на заказ электропоратора со 120 мкл 0,5 мкг/мкл плазмидной ДНК в 10 мМ Tris-HCl pH 8,0, 1 мМ ЭДТА. Пять импульсов по 15 В по 50 мс каждый применяются разделенными интервалом 950^{мс 22.} Попытки доставить интерферирующую РНК (РНК) с использованием ретровирусов компетентной репликации птичьего сращения (RCAS) в культуры, обогащенные конусами, были неудачными^47. Это, безусловно, связано с тем, что в отсутствие сыворотки и в культурах низкой плотности клетки-предшественники сетчатки не являются реплицативными, что необходимо для распространения ретровирусов.

Мы разработали систему культур, обогащенную конусами, для выявления трофических факторов, способствующих выживанию конуса, с помощью^{экспрессии клонирования 19.} Чтобы сделать это возможным, мы выполнили первый шаг скрининга высокого содержания с использованием кондиционированной среды из пулов из 100 клонов. Даже если кДНА из библиотеки экспрессируются под контролем сильного промотора ЦМВ после трансфекции клеток COS-1, это не дает гарантии, что все белки, кодируемые отдельными цДНК, достигают концентрации, достаточной для того, чтобы быть оцененными положительной путем анализа жизнеспособности. Это серьезное ограничение. В этом смысле любой скрининг не является на самом деле исчерпывающим. Кроме того, даже если перемягонные белки не были удалены из кондиционированной среды, конфигурация анализа неблагоприятна для идентификации недиффузионных факторов. Альтернативой было бы скрининг отдельных клонов после получения последовательности cDNAs, чтобы избежать дублирования при анализе во много раз одного и того же белка-кандидата. Это было инициировано секвенированием библиотек кДНК сетчатки, которые мы использовали^43. Хотя этот подход и рационален, он также имеет свои ограничения. Биоинформационный анализ последовательностей кДНК будет непреодолимо навязывать, помимо уменьшения избыточности, приоритет скрининга определенных клонов на основе знаний. Это не будет вредным, если, наконец, вся библиотека будет проверена, даже если время, необходимое для этого, будет значительно удлинено. Но неизменно идентичность последовательности будет влиять на наш взгляд на результаты. Это не будет нейтральным, поскольку интерпретация последовательности, естественно, будет соревноватеться с экспериментальными данными.

Идентификация EdCVF также показывает, что высокий скрининг контента влечет за собой технические ограничения. С первого раунда скрининга мы выявили два бассейна с высокой активностью(Дополнительный рисунок 1). Пул 0073 привел к успешной идентификации EdCVF, в то время как пул 0080 не проводил такого вывода. Мы не решили проблему, которая могла возникнуть в результате потери активного клона во время подготовки под пулов. В качестве альтернативы, не исключено, даже если не статистически благоприятно, что среди цДНК пула 0080 два белка действовали синергетически и их активность не могла наблюдаться как отдельные клоны.

Идентификация молекул, защищающих колбок, путем скрининга малых молекул является будущим применением системы культур, обогащенной конусами. Такие молекулы будут неоценимы для лечения патологий сетчатки, для которых генная терапия не является наиболее подходящим подходом, как возрастная макулярная дегенерация.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 black plates (Clear Button with lid Tissue culture treated)	Corning	3603
Calcein AM	Thermo-Fisher scientific	C1430
CCD Camera	Photometrics	CoolSnap  FX HQ
CDPC (Cytidine 5′-diphosphocholine sodium salt dihydrate)	Sigma-Aldrich	C0256
CO2 Independant	Thermo-Fisher scientific	18045-054
Curved forceps	Dutscher	005093
DMEM Media	Thermo-Fisher scientific	41966-029
DNAse	Sigma-Aldrich	D4263
Eggs incubator	FarmLine	M08 01 3100
Ethidium Homodimer	Thermo-Fisher scientific	E1169
Fœtal bovine serum	Thermo-Fisher scientific	10270-098
Gentamycin	Thermo-Fisher scientific	15710-049
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0880
ITS (insulin Transferine selenium)	Sigma-Aldrich	I1884
large straight pliers	Dutscher	005074
Linoleic acid	Sigma-Aldrich	L8384
M199 medium	Thermo-Fisher scientific	31150-022
Metamorph software	Metamorph
Microscope	NIKON	Eclipse TE2000
Motorized stage	Martzauzer	Mutlicontrol 2000
Optical filter switch	Shutter Instrument company	Lambda 10-2
PBS 1X	Thermo-Fisher scientific	14190-086
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P6282
Progesterone	Sigma-Aldrich	P7556
Pursept A express	Fisher scientific	11814110
Putriscine	Sigma-Aldrich	P5780
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636
straight forceps	Dutscher	005092
Taurine	Sigma-Aldrich	T8691
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T6397
Trypan blue	Thermo-Fisher scientific	15250-061
Trypsine 0.25 %	Thermo-Fisher scientific	25200-056