JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، ونحن نصف طريقة بسيطة تجمع بين مضان الحمض النووي الريبي في التهجين الموقعي (RNA-FISH) مع immunofluorescence لتصور الفيروس التاجي متلازمة الجهاز التنفسي الحاد الوخيمة 2 (سارس-CoV-2) الجيش الملكي النيبالي. وقد يزيد هذا البروتوكول من فهم الخصائص الجزيئية للتفاعلات بين سارس وكاف-2 التي تستضيف الحمض النووي الريبي على مستوى الخلية الواحدة.

Abstract

توفر هذه المخطوطة بروتوكولا لسلسلة التفاعل التهجين في الموقع (HCR) إلى جانب الفلورة المناعية لتصور الفيروس التاجي للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة 2 (SARS-CoV-2) الحمض النووي الريبي في ثقافات خط الخلية والثقافات ثلاثية الأبعاد (3D) لظهارة مجرى الهواء البشري. تسمح هذه الطريقة بتصور محدد وحساس للغاية للجيش الملكي النيبالي الفيروسي من خلال الاعتماد على HCR الذي بدأه تعريب المسبار. تساعد المسابير المنقسمة على تضخيم الإشارة عن طريق مكبرات الصوت ذات العلامات الفلورية ، مما يؤدي إلى تفلور الخلفية لا يذكر في المجهر الكونفوكوكال. يسهل وضع العلامات على مكبرات الصوت ذات الأصباغ الفلورية المختلفة التعرف المتزامن على الأهداف المختلفة. وهذا بدوره يسمح لرسم خرائط العدوى في الأنسجة لفهم أفضل الإمراض الفيروسي والنسخ المتماثل على مستوى الخلية الواحدة. وقد يسهل اقتران هذه الطريقة بفلورية المناعة فهما أفضل للتفاعلات بين الفيروس المضيف، بما في ذلك تناوب مسارات الإبجينوم المضيف والاستجابة المناعية. ونظرا لتكنولوجيا HCR الحساسة والمحددة، يمكن استخدام هذا البروتوكول أيضا كأداة تشخيصية. ومن المهم أيضا أن نتذكر أن هذه التقنية يمكن تعديلها بسهولة لتمكين الكشف عن أي الحمض النووي الريبي، بما في ذلك الحمض النووي الريبي غير الترميز والفيروسات الحمض النووي الريبي التي قد تظهر في المستقبل.

Introduction

سارس-كوف-2 هو فيروس بيتاكورونا بشري جديد ظهر في نهاية عام 2019، مما تسبب في وباء غير مسبوق بعد بضعة أشهر. ولأن الفيروس جديد على العلم، فإن الكثير من بيولوجياته وتأثيره على الخلايا المضيفة لا يزالان غير معروفين. ولذلك، فإن رسم خرائط لخلايا الفيروس والأنسجة أثناء العدوى أمر مهم إذا كان لخصائصه البيولوجية الأساسية وآثاره على المضيف أن تفهم. وتستخدم عدة تقنيات لفحص التفاعل بين الفيروس المضيف بما في ذلك البيوكيميائية والبيولوجية والفيزيائية. التهجين في الموقع هو طريقة شائعة تستخدم الحمض النووي التكميلي المسمى ، الحمض النووي الريبي ، أو مسابير الحمض النووي المعدلة ، والتي يتم توطينها على تسلسل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي المحدد في خلية أو نسيج.

تم تطوير طريقة جديدة للفلورسنت RNA في الموقع (RNA-FISH) تتضمن تعديلات لزيادة الحساسية من خلال تضخيم نسبة الإشارة إلى الضوضاء عبر HCR1. يسمح HCR بدراسة توطين الحمض النووي الريبي على مستوى الخلية الواحدة. ونظرا لخصوصية هذه الطريقة وحساسيتها وحلها، فإنها مفيدة ليس فقط للدراسات العلمية الأساسية، ولكن أيضا للمشاريع التطبيقية، مثل التشخيص. في الآونة الأخيرة ، تم إثبات جدوى هذه الطريقة للكشف عن سارس -CoV-2 RNA المترجمة إلى خلايا مهتحلة داخل ظهارة مجرى الهواء البشري ثلاثي الأبعاد (HAE)الثقافات 2. تشكل ثقافات HAE واحدة من أكثر الأدوات تقدما المستخدمة لدراسة العدوى الفيروسية في سياق "العدوى الطبيعية" البيئة الدقيقة3،4.

العديد من التقارير عن الفيروسات التاجية البشرية (HCoV)، بما في ذلك سارس-CoV-2، تسلط الضوء على أهمية التعديلات اللاجينية فيما يتعلق بعدوى فيروس التهاب الكبد HCoV والفيزيولوجيا المرضية [تمت مراجعتها في 5]،على سبيل المثال، نمط ميثيل الجين ترميز الانزيم المحول الأنجيوتنسين 2 (ACE-2) مستقبلات6،7. ومن المثير للاهتمام أن الفحص الطيفي الشامل حدد العديد من العوامل اللاجينية التي تتفاعل مع بروتيوم سارس-كوف-28. وبشكل أكثر تحديدا، يرتبط البروتين غير الهيكلي 5 (NSP5) بمنظم اللاجينية، وهستون دي اسيتيلاسي 2، ويتفاعل NSP5 غير النشط بشكل تحفيزي (C145A) مع ميثيل ترانسفيراسي TRNA 1 (24). بالإضافة إلى ذلك، يتم حظر نشاط ميثيل ترانسفيراز NSP16 بواسطة مثبط ميثيل ترانسفيراز، سينيفونجين9. ومع ذلك، لا يزال الدور الدقيق لهذه العوامل اللاجينية في COVID-19 غير واضح. يحدث تكرار فيروس التهاب الكبد في السيتوبلازم للخلية المصابة ، ويثير استجابات التهابية تنظمها تعديلات لا جينية10.

على سبيل المثال، HCoV-229E غرامة الإيقاعات النووية عامل كابا B الإشارات وإعادة برمجة عميقة المشهد الكروماتين الخلوية المضيفة عن طريق زيادة أسيتيل H3K36 و H4K5 في مناطق معينة11. تزيد عدوى الفيروس التاجي المرتبطة بمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية من مستويات H3K27me3 وتستنفد H3K4me3 في المناطق المروجة للمجموعات الفرعية من جينات محددة حساسة للإنترفيرون12. بالإضافة إلى ذلك، RNA الفيروسية مشغلات الاستجابات المناعية الخلية، كما هو موضح لflviviruses13،الفيروساتالرجعية 14،15،والفيروسات التاجية16. علامات اللاجينية على الحمض النووي الريبي الفيروسي قد تلعب دورا في الاعتراف من قبل أجهزة الاستشعار الخلوية, كما هو مبين لمثيلة M7A من فيروس نقص المناعة البشرية-1 RNA17. ومع ذلك، لا تزال هناك أسئلة: ما هو تأثير السارس-CoV-2 RNA على الاستجابة المناعية، وما هي العلامات اللاجينية المعنية؟

هنا، تم وصف طريقة محسنة RNA-FISH مقرونة بتحليل immunofluorescence لخطوط الخلايا والأنسجة ثلاثية الأبعاد (HAE متباينة تماما). على الرغم من أن الأساليب الخلوية، مثل FISH و immunofluorescence، تستخدم على نطاق واسع، فإن هذا الجيل الجديد من طريقة التهجين في الموقع على أساس HCR لم يستخدم أبدا للكشف عن الفيروسات (إلا في منشور حديث)2. بشكل عام، يتطلب الاحتواء المناعي والسمك الخطوات التالية: البيرمابيلينج لتمكين اختراق المسابير أو الأجسام المضادة؛ والنفاذ إلى الأجسام المضادة؛ والنفاذ إلى الأجسام المضادة؛ والاختراق في الأجسام المضادة؛ التثبيت الذي يتم فيه إصلاح المواد الخلوية والحفاظ عليها؛ الكشف عن الأجسام المضادة أو مسابير الحمض النووي التي يتم تطبيقها؛ وأخيرا ، تركيب عينات للتصور.

وعلى الرغم من أن البروتوكولات الموجودة تشترك في هذه الميزات العامة، فإنها تختلف اختلافا ملحوظا فيما يتعلق بالمعلمات المعنية. هنا، تم وصف بروتوكول محسن وبسيط ومناعي RNA-FISH للكشف عن سارس-كوف-2 الحمض النووي الريبي في ثقافات HAE وخلايا فيرو. وتتألف هذه التقنية من الخطوات التالية: (1) تثبيت الخلايا بالبارافورمالديهايد؛ (2) تثبيت الخلايا بالبارافورمالديهايد؛ (2) تثبيت الخلايا مع الخلايا ذات الخلايا الخافية؛ (2) تثبيت الخلايا بالخلايا ذات الخلايا اللولبة؛ ( (2) البيرميلات باستخدام المنظفات أو الميثانول (MeOH)؛ (3) الإماهة من خلال سلسلة متدرج من حلول MeOH (ثقافات HAE فقط)؛ (4) الكشف؛ (5) التضخيم باستخدام تكنولوجيا HCR للكشف عن الحمض النووي الريبي سارس-CoV-2؛ (6) اللطغى المناعي؛ و (7) التصوير تحت المجهر confocal.

Protocol

1. إعداد المخزن المؤقت

  1. ل500 مل من المخزن المؤقت PHEM 2x، الجمع بين 18.14 غرام من piperazine -N ، N′-بيس (2 - ethanesulfonic حامض) (PIPES) ، 6.5 غرام من 4 -(2 هيدروكسي إيثيل)-1 - حمض الإيثانسولفونيزين (HEPES)، 3.8 غرام من حمض إيثيلين غليكول رباعي الأسيت (EGTA)، و 0.99 غرام من كبريتات المغنيسيوم (MgSO4). جعل حجم يصل إلى ~ 400 مل مع الماء المقطر (DH2O)، ويحرك، وضبط درجة الحموضة إلى 7.0 باستخدام هيدروكسيد البوتاسيوم 10 M (KOH) أو هيدروكسيد الصوديوم (NaOH). جعل حجم النهائي يصل إلى 500 مل، ومن ثم تقسيمها إلى 50 مل aliquots. يخزن عند -20 درجة مئوية حتى يلزم.
    ملاحظة: المخزن المؤقت لن يكون واضحا حتى تصل إلى 7.0 pH.
  2. إعداد حل الأسهم من 37٪ ث / الخامس بارافورمالديهايد (PFA). ل50 مل، مزيج 18.5 غرام من PFA و 35 مل من DH2O في زجاجة. ضع الزجاجة على ستيرر مغناطيسي مع التدفئة. أضف 900 ميكرولتر من 1 M KOH أو NaOH، وحرك حتى يصبح الحل واضحا. السماح لتبرد ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي مخروطي 50 مل; تصل إلى 50 مل مع DH2O. يمكن تخزين الحل عند -20 درجة مئوية حتى يتم الانتهاء من ذلك.
    ملاحظة: يجب التعامل مع الفورمالديهايد في غطاء الدخان أثناء ارتداء قفازات واقية ومعطف المختبر.
  3. إعداد المخزن المؤقت التثبيت (3.7٪ PFA المخزنة مؤقتا مع PHEM). ل50 مل, الجمع بين 5 مل من 37٪ PFA الحل, 25 مل من 2x PHEM العازلة, و 20 مل من DH2O في أنبوب الطرد المركزي المخروطي 50 مل. يخزن عند -20 درجة مئوية حتى يلزم.
    ملاحظة: بعد thawing المخزن المؤقت يمكن تخزين عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
  4. إعداد PBST (0.1٪ توين-20 في 1x الفوسفات العازلة المالحة [PBS]). ل50 مل، إضافة 50 ميكرولتر من 100٪ توين-20 إلى 50 مل من برنامج تلفزيوني 1x وتخلط جيدا.
    ملاحظة: يمكن تخزين الحل في درجة حرارة الغرفة (RT).
  5. إعداد مخازن الإماهة المؤقتة عن طريق الجمع بين MeOH/PBST بنسب 3:1 و 1:1 و 1:3 (الحجم النهائي من 100 مل لكل منها؛ انظر الجدول 1).
    ملاحظة: MeOH سامة جدا و قابلة للاشتعال. كما يمكن أن تلحق الضرر العصب البصري، ينبغي التعامل معها في غطاء الدخان تجنب أي لهيب مفتوح. كما خلط MeOH وPBST يولد رد فعل طارد للحرارة، والجمع بين الحلول على الجليد.
  6. ل1000 مل من 20x SSC، والجمع بين 175.3 غرام من كلوريد الصوديوم (NaCl) و 88.2 غرام من سترات الصوديوم في كوب، وملء مع 800 مل من DH2O. اثارة حتى يذوب، وضبط درجة الحموضة إلى 7.2 باستخدام NaOH. أضف dH2O إلى حجم إجمالي قدره 1000 مل، وإلى الأوتوكلاف أو الفلتر من خلال فلتر 0.22 ميكرومتر في زجاجة معلبة تلقائيا.
  7. ل50 مل من 5x SSCT، والجمع بين 12.5 مل من 20x SSC العازلة مع 37.5 مل من DH2O، وإضافة 50 ميكرولتر من 100٪ توين-20. تخلط جيدا.
  8. ل50 مل من 50٪ 5x SSCT/50٪ PBST, الجمع بين 25 مل من 5x SSCT مع 25 مل من PBST.
  9. ل50 مل من 2x SSC، والجمع بين 5 مل من 10x SSC العازلة مع 45 مل من DH2O. ميكس جيدا.
    ملاحظة: يجب تخزين كافة المخازن المؤقتة SSC في RT في الظلام.

2. تعريف الهدف ، والتحقيقات ، ومكبرات الصوت

  1. استخدم الأدوات المتوفرة على موقع الشركة المصنعة لتصميم مكبرات الصوت والتحقيقات. تأكد من أن المسابير مكملة لخيط الحمض النووي العكسي لجين سارس-كوف-2 ن(الشكل التكميلي 1).
  2. تحديد حجم مجموعة التحقيق أفضل (مجموعة من 20 تحقيقات كافية للتصور).
  3. تعيين مكبرات الصوت المستخدمة للكشف عن الحمض النووي الريبي الهدف.
    1. استخدام مكبر للصوت HCR B1 المسمى مع اليكسا فلور 647.
      ملاحظة: يتكون مكبر للصوت HCR من دبابيس الشعر HCR القابلة للتكييف h1 و h2. يمكن تصميم التجارب متعددة المضاعفات باستخدام هذا البروتوكول. إذا كان هذا المخطط لها، واختيار مكبر للصوت HCR مختلفة (B1، B2، ...) لكل هدف الجيش الملكي النيبالي ليتم تصويرها داخل نفس العينة (على سبيل المثال، مكبر للصوت B1 للهدف 1، مكبر للصوت B2 للهدف 2، ...).

3. زراعة الخلايا والعدوى بالسارس-CoV-2

  1. ثقافة فيرو (خلايا ظهارية الكلى القرد) الخلايا في دولبيكو تعديل النسر المتوسطة التي تحتوي على 5٪ مصل البقر الجنين.
    1. البذور 50،000 الخلايا على الأغطية (رقم 1، 15 × 15 ملم) في لوحة من 12 بئرا.
  2. إعداد الثقافات HAE متباينة تماما كما هو موضح18 على إدراج Transwell نفاذية يدعم مع غشاء (قطرها = 6.5 ملم) والثقافة في متوسط النمو الظهاري القصبي حتى التقاء تماما.
  3. عدوى الفيروس
    1. تلقيح الخلايا مع سارس-CoV-2 في 1000x متوسط الأنسجة ثقافة الجرعة المعدية (TCID50) لكل مل
    2. احتضان الخلايا لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية.
    3. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني لإزالة الفيروس غير منضم.
    4. خلايا الثقافة لمدة 48 ساعة.

4. سارس-CoV-2 RNA-FISH في خلايا فيرو المستزرعة على coverlips

اليوم الأول

  1. إصلاح الخلايا وتغلغلها
    1. إصلاح الخلايا المصابة مع 3.7٪ ث / v PFA الحل لمدة 1 ساعة في RT.
    2. يستنشق محلول PFA بنسبة 3.7٪، ويغسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني 1x.
    3. Permeabilize الخلايا مع حل PBST لمدة 10 دقيقة في RT مع التحريض.
    4. يستنشق برنامج تلفزيوني ، وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني 1x.
  2. الكشف
    1. يستنشق حل برنامج تلفزيوني 1x ، وغسل الخلايا مرتين مع 2x SSC في RT.
    2. أسبيرات الحل 2x SSC، وprehybridize العينات بإضافة ما لا يقل عن 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت التهجين التحقيق. تغطية الآبار التي تحتوي على الخلايا، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    3. إعداد حل التحقيق عن طريق إضافة 1.2 pmol من خليط التحقيق إلى المخزن المؤقت التهجين التحقيق.
      1. استخدم 1.2 ميكرولتر من مخزون المسبار 1 ميكرومتر لإعداد 300 ميكرولتر من المخزون العامل.
    4. إزالة محلول ما قبل الترطيب، ونقل الأغطية إلى غرفة رطبة.
      1. ماصة 30-50 ميكرولتر من محلول التحقيق على parafilm لتشكيل قطرات الفردية.
    5. احتضان العينات بين عشية وضحاها (12-18 ساعة) في 37 درجة مئوية.

      اليوم الثاني
    6. نقل الأغطية مرة أخرى إلى لوحة 12 جيدا، وإزالة محلول التحقيق الزائد عن طريق الغسيل لمدة 4 × 5 دقائق مع 400 ميكرولتر من العازلة غسل التحقيق في 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: كبديل لوضع 30-50 ميكرولتر aliquots على parafilm وتحت coverlips لاحتضان، إضافة 300 ميكرولتر من محلول التحقيق مباشرة إلى coverlips في لوحة 12 بئرا. هذا الإجراء أبسط، ولكنه يتطلب كميات كبيرة من الكواشف. سخني المخزن المؤقت لغسل المسبار إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. حساب مقدار العازلة اللازمة، ونقله إلى أنبوب الطرد المركزي المخروطي 15 مل.
    7. غسل العينات لمدة 2 × 5 دقائق مع 5x SSCT في RT.
    8. استبدل حل 5x SSCT ب 1x PBS ، وخزن العينات عند 4 درجات مئوية حتى التضخيم.
  3. التضخيم
    1. إزالة حل برنامج تلفزيوني 1x من الآبار، وإضافة ما لا يقل عن 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت التضخيم إلى كل بئر. احتضان العينات لمدة 30 دقيقة في RT.
    2. إعداد كل دبوس الشعر HCR (h1 و h2) عن طريق المفاجئة التبريد حجم المطلوب في أنابيب منفصلة.
      1. لإعداد 300 ميكرولتر من محلول التضخيم، استخدم 18 pmol من كل دبوس شعر (على سبيل المثال، ل 300 ميكرولتر، استخدم 6 ميكرولتر من محلول دبوس شعر 3 ميكرومتر).
      2. نقل محلول دبوس الشعر إلى أنابيب.
      3. حضانة عند 95 درجة مئوية لمدة 90 s.
      4. بارد إلى RT لمدة 30 دقيقة في الظلام.
    3. إعداد خليط دبوس الشعر عن طريق إضافة المفاجئة تبريد "h1" و "h2" دبابيس الشعر إلى المخزن المؤقت تضخيم.
    4. مكان قطرات من 30-50 ميكرولتر من خليط دبوس الشعر على parafilm.
    5. احتضان العينات بين عشية وضحاها (12-18 ساعة) في الظلام في RT.

      اليوم الثالث
    6. نقل الأغطية مرة أخرى إلى لوحة بئر 12، وإزالة دبابيس الشعر الزائدة عن طريق الغسيل لمدة 5 × 5 دقائق مع 5x SSCT في RT مع التحريض.
    7. يستنشق المخزن المؤقت SSCT 5x، واستبداله مع برنامج تلفزيوني 1x.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، استخدم عينات RNA-FISH في فحص immunofluorescence القياسي، متبوعا بتلطيخ النوى (انظر القسم 5).
  4. تلطيخ النووية وتصاعد الشريحة
    1. أسبيرات الحل 1X برنامج تلفزيوني، واستبداله مع 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 0.2 ميكروغرام/مل) في 1x حل برنامج تلفزيوني.
    2. احتضان العينات لمدة 10 دقائق في RT في الظلام.
    3. يستنشق حل DAPI، وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني 1x.
    4. وضع قطرتين من 10 ميكرولتر لكل من تصاعد المتوسطة; تأكد من أن يتم فصل قطرات بما فيه الكفاية للسماح اثنين من coverlips أن توضع على شريحة واحدة.
    5. إزالة السائل الزائد عن طريق النقر على coverlips على منشفة نظيفة، ومن ثم وضعها في المتوسط تصاعد antifade مع الخلايا التي تواجه أسفل.
    6. ضع العينات المثبتة على سطح جاف ومسطح في الظلام ودعهم يشفون.
    7. بعد المعالجة، ختم حواف الأغطية مع مانع التسرب VALAP أو طلاء الأظافر لمنع العينات من الجفاف.

5. سارس-CoV-2 RNA-FISH في ثقافات HAE

اليوم الأول

  1. إصلاح ثقافة HAE وتدبيرها
    1. يستنشق المتوسط، وإصلاح الخلايا المصابة باستخدام محلول PFA 3.7٪ لمدة ساعة واحدة في RT.
    2. يستنشق محلول PFA بنسبة 3.7٪، ويغسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني 1x.
      1. استبدال الحل PFA 3.7٪ مع برنامج تلفزيوني 1x تحت إدراج ترانسويل.
    3. تجاهل برنامج تلفزيوني، وتجفيف العينات باستخدام يغسل 2 × 5 دقيقة مع 100٪ MeOH prechilled إلى -20 درجة مئوية.
    4. بعد الغسيل الثاني، استبدل العازلة ب MeOH الطازجة المبردة للبيرمابيلية تحت إدراج Transwell. يخزن طوال الليل عند -20 درجة مئوية.

اليوم الثاني

  1. الاماهه
    إعادة ترطيب العينات من خلال سلسلة متدرج من حلول MeOH / PBST (لكل منها لمدة 5 دقائق) على الجليد: 75٪ MeOH/25٪ PBST، 50٪ MeOH/50٪ PBST، 25٪ MeOH/75٪ PBTS، و 100٪ PBST (مرتين).
    1. غسل الخلايا لمدة 5 دقائق على الجليد مع 50٪ 5x SSCT/50٪ PBST.
    2. غسل الخلايا لمدة 5 دقائق على الجليد مع 5x SSCT.
    3. استبدال المخزن المؤقت SSCT 5x مع برنامج تلفزيوني 1x.
  2. الكشف
    1. احتضان الخلايا (داخل إدراج Transwell) لمدة 5 دقائق على الجليد مع 100 ميكرولتر من العازلة التهجين التحقيق. بعد ذلك، نقل لوحة إلى حاضنة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية (ما قبل الترطيب).
      ملاحظة: يجب أن يكون المخزن المؤقت للتهجين المسبار مسبقا إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. حساب حجم المطلوبة: هناك حاجة إلى 100 ميكرولتر لإدراج ترانسويل واحد.
    2. إعداد حل التحقيق. كما 1 مل من حل التحقيق يتطلب 4 pmol من التحقيق، إضافة 4 ميكرولتر من 1 ميكرومتر حل الأسهم التحقيق إلى 1 مل من المخزن المؤقت التهجين التحقيق، وتخلط بشكل جيد.
      ملاحظة: للكشف عن الحمض النووي الريبي، استخدم 100 ميكرولتر من محلول المسبار لكل إدراج ترانسويل. اترك محلول المسبار على الجليد حتى نهاية خطوة ما قبل الترطيب.
    3. إزالة الحل prehybridization، وإضافة حل التحقيق.
    4. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها (12-18 ساعة) في 37 درجة مئوية.

      اليوم الثالث
    5. إزالة المسبار الزائد عن طريق الغسيل لمدة 4 × 15 دقيقة مع 100 ميكرولتر من العازلة غسل التحقيق في 37 درجة مئوية.
    6. غسل العينات لمدة 2 × 5 دقائق مع 5X SSCT في RT.
    7. استبدل SSCT 5x ب 1x PBS ، وخزن العينات عند 4 درجات مئوية حتى التضخيم.
  3. التضخيم
    1. Preamplify العينات عن طريق احتضان لهم مع عازلة تضخيم لمدة 30 دقيقة في RT.
    2. إعداد كل دبوس الشعر عن طريق المفاجئة التبريد وحدات التخزين المطلوبة في أنابيب منفصلة.
      1. لإعداد 500 ميكرولتر من محلول التضخيم، استخدم 30 pmol من كل دبوس شعر (على سبيل المثال، ل 500 ميكرولتر، استخدم 10 ميكرولتر من محلول دبوس شعر الأسهم 3 ميكرومتر).
      2. نقل محلول دبوس الشعر إلى الأنابيب.
      3. حضانة عند 95 درجة مئوية لمدة 90 s.
      4. بارد إلى RT لمدة 30 دقيقة في الظلام.
    3. قم بإعداد محلول دبوس الشعر بإضافة جميع دبابيس الشعر المبردة إلى 500 ميكرولتر من حاجز التضخيم في RT.
    4. إزالة الحل preamplification، وإضافة حل دبوس الشعر كاملة.
    5. احتضان العينات بين عشية وضحاها (12-18 ساعة) في RT في الظلام.
    6. إزالة دبابيس الشعر الزائدة عن طريق الغسيل مع 5x SSCT في RT على النحو التالي: 2 × 5 دقائق، 2 × 15 دقيقة، و 1 × 5 دقائق.
    7. استبدال حل SSCT 5x مع برنامج تلفزيوني 1x، وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 2-3 أيام أو المضي قدما مباشرة إلى تلطيخ النووية.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، استخدم عينات RNA-FISH في مقايسة مناعة قياسية، متبوعة بالتلوين النووي (انظر القسم 6).
  4. تلطيخ النووية وتصاعد الشريحة
    1. يستنشق حل برنامج تلفزيوني 1x ، واستبداله مع حل DAPI (0.2 ميكروغرام / مل) في برنامج تلفزيوني 1x.
    2. احتضان العينات لمدة 10 دقائق في RT في الظلام.
    3. يستنشق حل DAPI، وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني 1x.
    4. ضع الغشاء المقطوع من إدراج Transwell على 10 ميكرولتر من وسيط التركيب المضاد للفيد مع الخلايا التي تواجه الأعلى ، وإضافة وسيط تصاعد إضافي (5 ميكرولتر) إلى الغشاء.
    5. تغطية الأغشية مع coverlips.
    6. علاج العينات المركبة على سطح جاف ومسطح في الظلام.
    7. بعد المعالجة، ختم حواف الأغطية مع مانع التسرب VALAP أو طلاء الأظافر لمنع العينات من الجفاف.

6. تحليل immunofluorescence من خلايا فيرو و HAE الثقافات

ملاحظة: إجراء الفحص immunofluorescence في اليوم 3 لخطوط الخلية أو اليوم 4 لثقافات HAE. استخدم أسلوبا مختلفا لكل طراز. جميع الاختلافات مبينة بوضوح.

  1. يستنشق حل برنامج تلفزيوني 1x من الآبار.
  2. منع العينات عن طريق الحضانة مع 1٪ ث / الخامس الألبومين مصل البقري في حل PBST لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
  3. إعداد الأجسام المضادة الأولية عن طريق إعداد المخففات المناسبة في حل الحجب ، واحتضان.
    1. لخلايا Vero على الأغطية:
      1. مكان قطرات (30-50 ميكرولتر) من محلول الأجسام المضادة على parafilm في غرفة الرطوبة.
      2. مكان coverlips على الجسم المضاد يسقط مع الخلايا التي تواجه أسفل.
    2. بالنسبة ل HAE، استبدل عامل الحجب في الإدراج بمحلول الأجسام المضادة (100 ميكرولتر)، واحتضن العينات في غرفة مرطبة.
      ملاحظة: ضبط الوقت ودرجة الحرارة لكل حضانة مع الأجسام المضادة الأولية. المعلمات النموذجية هي 2 ساعة في RT أو بين عشية وضحاها عند 4 درجة مئوية.
  4. غسل العينات لمدة 3 × 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني.
    1. للخلايا على coverlips، نقل إلى لوحة 12 جيدا وإضافة حل PBST.
    2. بالنسبة لثقافات HAE ، استبدل حل الأجسام المضادة بحل PBST.
  5. تحقق من مصادر الضوء والمرشحات المتاحة للمجهر الكونفوجكال.
  6. اختيار الأجسام المضادة الثانوية وفقا للأنواع المضيفة. اختر معلمات الفلوروفوري (الإثارة والأطوال الموجية للانبعاثات، وعرض الطيف، وكفاءة الإثارة وفقا لمصدر الضوء المتاح).
    ملاحظة: يمكن تصميم المعلمات الطيفية باستخدام أدوات عبر الإنترنت (انظر جدول المواد).
  7. إعداد حلول الأجسام المضادة الثانوية المناسبة عن طريق تمييعها بمحلول الحجب.
  8. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية (كما هو الحال في 6.3)، ولكن احتضان لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية.
  9. غسل العينات كما هو الحال في الخطوة 6.4.
  10. تلطيخ النووية وتصاعد الشريحة
    1. للخلايا على الأغطية
      1. يستنشق برنامج تلفزيوني ، واستبداله DAPI (0.2 ميكروغرام / مل) في 1x PBS الحل.
      2. احتضان العينات لمدة 10 دقائق في RT في الظلام.
      3. يستنشق حل DAPI، وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني 1x.
      4. ضع الأغطية على قطرات من 10 ميكرولتر من المتوسط المتصاعد مع الخلايا التي تواجه لأسفل.
      5. ختم الأغطية مع طلاء الأظافر.
    2. لثقافات HAE
      1. اسبير 1x PBST ، واستبداله DAPI (0.2 ميكروغرام / مل) في 1x PBS الحل.
      2. احتضان العينات لمدة 10 دقائق في RT في الظلام.
      3. يستنشق حل DAPI، وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني 1x.
      4. ضع الأغشية المقطوعة على قطرات من 10 ميكرولتر من المتوسط المتصاعد مع مواجهة الخلايا لأعلى ، وإضافة متوسطة إضافية (5 ميكرولتر) إلى الغشاء.
      5. تغطية الأغشية مع coverlips.
      6. ختم الأغطية مع طلاء الأظافر.

7. المجهر كونفوجال

  1. حدد المسارات عن طريق تحديد الفلوروفوريس المستخدمة.
  2. اختر وضع المسح الضوئي وسرعته.
  3. ضبط قوة الليزر، وكسب، وقيم الإزاحة لكل الفلوروفور بمقارنتها مع الضوابط السلبية ذات الصلة: للفيروسات، والخلايا الوهمية المصابة؛ للبروتينات الخلوية، عينات ملطخة بالأجسام المضادة للتحكم بالنمط المتساوي من مضيف مناسب.
  4. للحصول على صورة ثلاثية الأبعاد، قم بتنشيط وضع المكدس z، وقم بتعيين الحدود العلوية والسفلية. تعيين حجم الخطوة/رقم.
    ملاحظة: لمزيد من التفاصيل حول تصوير الفيروس التاجي، راجع19.

النتائج

تم تنفيذ بروتوكول IMMUNO-RNA-FISH الموصوف في هذه المخطوطة باستخدام نظامين خلويتين: خط خلايا Vero وثقافة HAE ثلاثية الأبعاد. تظهر الخطوات الرئيسية لكلا الطرازين الخلويين في الجدول 2. بروتوكول RNA-FISH التصور من سارس-CoV-2 في الثقافات HAE يتضمن الخطوات التي هي نموذجية لعينات الأنسج...

Discussion

Immuno-RNA-FISH هو طريقة موثوقة لتلطيخ الحمض النووي الريبي والبروتينات الخلوية. هنا، تم وصف بروتوكول معدل مناعي الحمض النووي الريبي-FISH يسمح بالكشف عن الحمض النووي الريبي سارس-كوف-2 والبروتينات الخلوية في خطوط الخلايا وثقافات HAE. يمكن تكييف هذا البروتوكول للاستخدام في نماذج الخلايا المختلفة بما ?...

Disclosures

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يعلنانه.

Acknowledgements

وقد دعمت وزارة العلوم والتعليم العالي هذا العمل في مجال البحوث المتعلقة بالسارس-CoV-2، ومنح من المركز الوطني للعلوم (المنح UMO2017/27/B/NZ6/02488 إلى K.P. وUMO-2018/30/E/NZ1/00874 إلى A.K.-P.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Confocal Microscope LSM 880ZEISS
Grant Bio, Mini Rocker- ShakerFisher Scientific12965501
Incubator Galaxy170RNew BrunswickCO170R-230-1000
Thermomixer ComfortEppendorf5355 000 011
Materials
15 mm x 15 mm NO. 1 coverslipsLabSolute7695022
1.5 mL tubesFL-MEDICAL5.350.023.053
12-well plateTTP92412
Conical centrifuge tubeSarstedt5.332.547.254
parafilmSigmaP7793-1EA
serological pipetsVWR Collection612-5523P, 612-5827P
slide glassPTH CHEMLAND04-296.202.03
Transwell ThinCertsGrainer bio-one665641
Reagents
Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies Invitrogen
β5-tubulin Santa Cruz Biotechnology sc-134234
DAPIThermo ScientificD1306
Disodium phosphateSigmaS51136-500G
EGTABioShopEGT101.25
HCR Amplification BufferMolecular Instruments, Inc.BAM01522Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information
HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647Molecular Instruments, Inc.S013922
HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647Molecular Instruments, Inc.S012522
HCR Probe Hybridization BufferMolecular Instruments, Inc.BPH03821Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information
HCR probe set for SARS-CoV-2 NcapsidMolecular Instruments, Inc.PRE134
HCR Probe Wash BufferMolecular Instruments, Inc.BPW01522Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information
HEPESBioShopHEP001.100
Magnesium sulfate heptahydrateSigma63138-250G
MethanolSigma32213-1L-M
Monopotassium phosphateSigmaP5655-100G
ParaformaldehydeSigmaP6148-1KG
PIPESBioShopPIP666.100
Potassium ChlorideSigmaP5405-250G
Prolong Diamond Antifade Mounting MediumInvitrogenP36970
Sodium ChlorideBioShopSOD001.5
Trisodium Citrate 2-hydratePOCH 6132-04-3
Tween-20BioShopTWN580.500
Software
Fluorescence SpectraviewerModeling spectral parameters
ImageJ FijiAcquiring and processing z-stack images

References

  1. Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145, (2018).
  2. Milewska, A., et al. Replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 in human respiratory epithelium. Journal of Virology. 94, (2020).
  3. Banach, B. S., et al. Human airway epithelial cell culture to identify new respiratory viruses: coronavirus NL63 as a model. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 19-26 (2009).
  4. Milewska, A., et al. Entry of human coronavirus NL63 into the cell. Journal of Virology. 92, (2018).
  5. El Baba, R., Herbein, G. Management of epigenomic networks entailed in coronavirus infections and COVID-19. Clinical Epigenetics. 12, 118 (2020).
  6. Pinto, B. G. G., et al. ACE2 expression is increased in the lungs of patients with comorbidities associated with severe COVID-19. Journal of Infectious Diseases. 222 (4), 556-563 (2020).
  7. Verdecchia, P., Cavallini, C., Spanevello, A., Angeli, F. The pivotal link between ACE2 deficiency and SARS-CoV-2 infection. European Journal of Internal Medicine. 76, 14-20 (2020).
  8. Gordon, D. E., et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature. 583, 459-468 (2020).
  9. Ferron, F., Decroly, E., Selisko, B., Canard, B. The viral RNA capping machinery as a target for antiviral drugs. Antiviral Research. 96 (1), 21-31 (2012).
  10. Mehta, S., Jeffrey, K. L. Beyond receptors and signaling: epigenetic factors in the regulation of innate immunity. Immunology and Cell Biology. 93 (3), 233-244 (2015).
  11. Poppe, M., et al. The NF-kappaB-dependent and -independent transcriptome and chromatin landscapes of human coronavirus 229E-infected cells. PLoS Pathogens. 13, 1006286 (2017).
  12. Schafer, A., Baric, R. S. Epigenetic landscape during coronavirus infection. Pathogens. 6 (1), 8 (2017).
  13. Carletti, T., et al. Viral priming of cell intrinsic innate antiviral signaling by the unfolded protein response. Nature Communications. 10, 3889 (2019).
  14. Heil, F., et al. Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8. Science. 303 (5663), 1526-1529 (2004).
  15. Sze, A., et al. Host restriction factor SAMHD1 limits human T cell leukemia virus type 1 infection of monocytes via STING-mediated apoptosis. Cell Host and Microbe. 14 (4), 422-434 (2013).
  16. Kikkert, M. Innate immune evasion by human respiratory RNA viruses. Journal of Innate Immunity. 12, 4-20 (2020).
  17. Kennedy, E. M., et al. Posttranscriptional m(6)A editing of HIV-1 mRNAs enhances viral gene expression. Cell Host and Microbe. 22 (6), 830 (2017).
  18. Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Human Cell Culture Protocols in Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).
  19. Milewska, A., Owczarek, K., Szczepanski, A., Pyrc, K. Visualizing coronavirus entry into cells. Methods in Molecular Biology. 2203, 241-261 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

166 2 immunofluorescence HAE Permeabilization Confocal

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved