Visualizzazione di SARS-CoV-2 utilizzando l'ibridazione immuno RNA-fluorescenza in situ

Riepilogo

Qui descriviamo un metodo semplice che combina la fluorescenza dell'RNA nell'ibridazione situ (RNA-FISH) con l'immunofluorescenza per visualizzare l'RNA della sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Questo protocollo può aumentare la comprensione delle caratteristiche molecolari delle interazioni RNA-host SARS-CoV-2 a livello di singola cellula.

Abstract

Questo manoscritto fornisce un protocollo per la reazione a catena di ibridazione in situ (HCR) accoppiato con immunofluorescenza per visualizzare la sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA in linea cellulare e colture tridimensionali (3D) dell'epitelio delle vie aeree umane. Il metodo consente una visualizzazione altamente specifica e sensibile dell'RNA virale affidandosi all'HCR avviato dalla localizzazione della sonda. Le sonde split-initiator aiutano ad amplificare il segnale con amplificatori etichettati fluorescentmente, con conseguente trascurabile fluorescenza di fondo nella microscopia confocale. L'etichettatura di amplificatori con diversi coloranti fluorescenti facilita il riconoscimento simultaneo di vari bersagli. Questo, a sua volta, consente la mappatura dell'infezione nei tessuti per comprendere meglio la patogenesi virale e la replicazione a livello di singola cellula. L'accoppiamento di questo metodo con l'immunofluorescenza può facilitare una migliore comprensione delle interazioni ospite-virus, compresa l'alternanza dell'epigenoma ospite e delle vie di risposta immunitaria. Grazie alla tecnologia HCR sensibile e specifica, questo protocollo può anche essere utilizzato come strumento diagnostico. È anche importante ricordare che la tecnica può essere modificata facilmente per consentire il rilevamento di qualsiasi RNA, inclusi gli RNA non codificanti e i virus dell'RNA che potrebbero emergere in futuro.

Introduzione

SARS-CoV-2 è un nuovo betacoronavirus umano emerso alla fine del 2019, causando una pandemia senza precedenti pochi mesi dopo. Poiché il virus è nuovo per la scienza, gran parte della sua biologia e il suo impatto sulle cellule ospiti rimangono sconosciuti. Pertanto, la mappatura del tropismo virus-cellula e-tessuto durante l'infezione è importante se si vengono comprese le sue caratteristiche biologiche di base e i suoi effetti sull'ospite. Diverse tecniche sono utilizzate per esaminare l'interazione virus-ospite tra cui saggi biochimici, biologici e fisici. L'ibridazione in situ è un metodo comune che utilizza sonde di DNA, RNA o acido nucleico modificate etichettate, che si localizzano in specifiche sequenze di DNA o RNA in una cellula o tessuto.

È stato sviluppato un nuovo metodo di ibridazione in situ fluorescente RNA (RNA-FISH) che incorpora modifiche per aumentare la sensibilità amplificando il rapporto segnale-rumore tramite un HCR¹. L'HCR consente lo studio della localizzazione dell'RNA a livello di singola cellula. Grazie alla sua elevata specificità, sensibilità e risoluzione, questo metodo è utile non solo per gli studi scientifici di base, ma anche per i progetti di applicatori, ad esempio la diagnostica. Recentemente, è stata dimostrata la fattibilità di questo metodo per rilevare l'RNA SARS-CoV-2 localizzato nelle cellule ciliate all'interno di colture di epitelio delle vie aeree umane 3D (HAE) completamente differenziate². Le colture hae costituiscono uno degli strumenti più avanzati utilizzati per studiare l'infezione virale nel contesto del microambiente "infezione^{naturale" 3,4}.

Diversi rapporti sui coronavirus umani (HCoV), tra cui SARS-CoV-2, evidenziano l'importanza delle modifiche epigenetiche rispetto all'infezione da HCoV e alla fisiopatologia [recensito in ⁵], ad esempio il modello di metilazione del gene che codifica per il recettore dell'enzima di conversione dell'angiotensina 2 (ACE-2)^6,7. È interessante notare che lo screening spettrometrico di massa ha identificato diversi fattori epigenetici che interagiscono con il proteoma SARS-CoV-2⁸. Più specificamente, la proteina non strutturale 5 (NSP5) si lega al regolatore epigenetico, alla deacetilasi istonica 2 e l'NSP5 cataliticamente inattivo (C145A) interagisce con il tRNA metiltransferasi 1 (24). Inoltre, l'attività della metiltransferasi NSP16 è bloccata dall'inibitore della metiltransferasi, sinefungina⁹. Tuttavia, il ruolo esatto di questi fattori epigenetici nel COVID-19 rimane poco chiaro. La replicazione dell'HCoV avviene nel citoplasma della cellula infetta e innesca risposte infiammatorie regolate da modifiche epigenetiche¹⁰.

Ad esempio, HCoV-229E sintonizza finemente la segnalazione del fattore nucleare-kappa B e riprogramma profondamente il paesaggio della cromatina cellulare ospite aumentando l'acetilazione di H3K36 e H4K5 in alcune regioni¹¹. L'infezione da coronavirus correlata alla sindrome respiratoria in Medio Oriente aumenta i livelli di H3K27me3 e esaurisce h3K4me3 nelle regioni promotrice di sottoinsiemi di specifici geni sensibili all'interferone¹². Inoltre, l'RNA virale innesca risposte immunitarie cellulari, come dimostrato per flavivirus^{13,retrovirus 14,15}e coronavirus¹⁶. I marcatori epigenetici sull'RNA virale possono svolgere un ruolo nel riconoscimento da parte dei sensori cellulari, come mostrato per la metilazione m7A del virus dell'immunodeficienza umana-1 RNA¹⁷. Tuttavia, rimangono domande: qual è l'impatto dell'RNA SARS-CoV-2 sulla risposta immunitaria e sono coinvolti segni epigenetici?

Qui è stato descritto un metodo RNA-FISH ottimizzato abbinato all'analisi dell'immunofluorescenza delle linee cellulari e dei tessuti 3D (HAE completamente differenziato). Sebbene i metodi citologici, come FISH e immunofluorescenza, siano ampiamente utilizzati, questo metodo di ibridazione in situ di nuova generazione basato sull'HCR non è mai stato utilizzato per il rilevamento di virus (tranne in una recente pubblicazione)². In generale, l'immunostaining e il FISH richiedono i seguenti passaggi: permeabilizzazione per consentire la penetrazione di sonde o anticorpi; fissazione in cui il materiale cellulare è fissato e conservato; individuazione in cui vengono applicati anticorpi o sonde di acido nucleico; e infine, il montaggio dei campioni per la visualizzazione.

Sebbene i protocolli esistenti consevidano queste caratteristiche generali, variano notevolmente rispetto ai parametri coinvolti. Qui, è stato descritto un protocollo ottimizzato, semplice, immuno-RNA-FISH per rilevare l'RNA SARS-CoV-2 nelle colture HAE e nelle cellule Vero. La tecnica comprende i seguenti passaggi: (1) fissazione di cellule con paraformaldeide; 2) permeabilità con detergente o metanolo (MeOH); (3) reidratazione attraverso una serie graduata di soluzioni MeOH (solo colture HAE); 4) individuazione; (5) amplificazione mediante tecnologia HCR per rilevare l'RNA SARS-CoV-2; 6) immunosocienza; e (7) imaging al microscopio confocale.

Protocollo

1. Preparazione del tampone

1. Per 500 mL di tampone PHEM 2x, combinare 18,14 g di piperazina-N,N′-bis(acido 2-etanosolfonico) (PIPES), 6,5 g di 4-(2-idrossietile)-1 1-piperazina acido etanosolfonico (HEPES), 3,8 g di acido tetraacetico glicole etilenico (EGTA) e 0,99 g di solfato di magnesio (MgSO₄). Far mescolare il volume fino a ~400 mL con acqua distillata (dH₂O), mescolare e regolare il pH a 7,0 utilizzando idrossido di potassio da 10 M (KOH) o idrossido di sodio (NaOH). Fare il volume finale fino a 500 mL, quindi dividere in 50 mL aliquote. Conservare a -20 °C fino a quando necessario.
   NOTA: Il buffer non sarà chiaro fino a quando il pH non raggiunge 7.0.
2. Preparare una soluzione stock del 37% con paraformaldeide (PFA). Per 50 mL, mescolare 18,5 g di PFA e 35 mL di dH₂O in una bottiglia di vetro. Posizionare la bottiglia su un agitatore magnetico con riscaldamento. Aggiungere 900 μL di 1 M KOH o NaOH e mescolare fino a quando la soluzione diventa chiara. Lasciare raffreddare e trasferire in un tubo di centrifuga conica da 50 ml; fino a 50 mL con dH₂O. La soluzione può essere conservata a -20 °C fino a quando necessario.
   NOTA: La formaldeide deve essere maneggiata in un cappuccio dei fumi mentre indossa guanti protettivi e un camice da laboratorio.
3. Preparare il buffer di fissazione (3,7% di PFA memorizzato nel buffer con PHEM). Per 50 mL, combinare 5 ml di soluzione DI PFA al 37%, 25 ml di tampone PHEM 2x e 20 ml di dH₂O in un tubo di centrifuga conico da 50 ml. Conservare a -20 °C fino a quando necessario.
   NOTA: Dopo lo scongelamento, il tampone può essere conservato a 4 °C per un massimo di 3 mesi.
4. Preparare PBST (0,1% Tween-20 in 1x soluzione salina tamponata da fosfati [PBS]). Per 50 mL, aggiungere 50 μL di Tween-20-50% 10% di 1x PBS e mescolare bene.
   NOTA: La soluzione può essere conservata a temperatura ambiente (RT).
5. Preparare i buffer di reidratazione combinando MeOH/PBST in rapporti di 3:1, 1:1 e 1:3 (volume finale di 100 mL di ciascuno; vedi tabella 1).
   NOTA: Il MeOH è molto tossico e infiammabile. Poiché può danneggiare il nervo ottico, dovrebbe essere maneggiato in una cappa aspirante evitando fiamme libere. Poiché la miscelazione di MeOH e PBST genera una reazione esotermica, combinare le soluzioni sul ghiaccio.
6. Per 1000 mL di 20x SSC, combinare 175,3 g di cloruro di sodio (NaCl) e 88,2 g di citrato di sodio in un bicchiere, e riempire con 800 mL di dH₂O. Mescolare fino a quando non si scioglie, e regolare il pH a 7,2 usando NaOH. Aggiungere dH₂O a un volume totale di 1000 mL e autoclave o filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm in una bottiglia autoclavata.
7. Per 50 mL di 5x SSCT, combinare 12,5 mL di tampone SSC 20x con 37,5 mL di dH₂O e aggiungere 50 μL di 100% Tween-20. Mescolare bene.
8. Per 50 mL di 50% 5x SSCT/50% PBST, combinare 25 mL di 5x SSCT con 25 mL di PBST.
9. Per 50 mL di 2x SSC, combinare 5 mL di tampone SSC 10x con 45 mL di dH₂O. Mescolare bene.
   NOTA: tutti i buffer SSC devono essere memorizzati in RT al buio.

2. Definizione del bersaglio, sonde e amplificatori

1. Utilizzare gli strumenti disponibili sul sito web del produttore per progettare amplificatori e sonde. Assicurarsi che le sonde siano complementari al filamento di DNA inverso del gene SARS-CoV-2 N (Figura complementare 1).
2. Determinare la dimensione migliore del set di sonde (un set di 20 sonde è sufficiente per la visualizzazione).
3. Impostare gli amplificatori utilizzati per il rilevamento dell'RNA di destinazione.
   1. Utilizzare l'amplificatore HCR B1 etichettato con Alexa Fluor 647.
      NOTA: Un amplificatore HCR comprende forcine HCR metastabile h1 e h2. Gli esperimenti multiplexed possono essere progettati utilizzando questo protocollo. Se questo è pianificato, scegli un amplificatore HCR diverso (B1, B2, ...) per ogni RNA bersaglio da imaged all'interno dello stesso campione (ad esempio, amplificatore B1 per il bersaglio 1, amplificatore B2 per il bersaglio 2, ...).

3. Coltura cellulare e infezione da SARS-CoV-2

1. Cellule di coltura Vero (cellule epiteliali renali di scimmia) nel mezzo aquila modificato di Dulbecco contenente il 5% di siero bovino fetale.
   1. Semina 50.000 cellule su copertine (n. 1, 15 × 15 mm) in una piastra da 12 pota.
2. Preparare colture HAE completamente differenziate come^{descritto 18} su supporti permeabili di inserti Transwell con membrana (diametro = 6,5 mm) e coltura in mezzo di crescita epiteliale bronchiale fino a completo confluenza.
3. Infezione da virus
   1. Inoculare le cellule con SARS-CoV-2 a 1000x di coltura mediana del tessuto in coltura infettiva (TCID₅₀) per mL
   2. Incubare le cellule per 2 ore a 37 °C.
   3. Lavare le cellule due volte con PBS per rimuovere il virus non associato.
   4. Cellule di coltura per 48 ore.

4. SARS-CoV-2 RNA-FISH in cellule vero coltivate su coverlips

GIORNO 1

1. Cellule di fissaggio e permeabilizzazione
   1. Correggere le cellule infette con soluzione PFA 3.7% w/v per 1 h a RT.
   2. Aspirare la soluzione di PFA al 3,7% e lavare le celle due volte utilizzando 1x PBS.
   3. Permeabilizzare le cellule con soluzione PBST per 10 minuti a RT con agitazione.
   4. Aspirare il PBST e lavare le cellule due volte con 1x PBS.
2. scoperta
   1. Aspirare la soluzione 1x PBS e lavare le celle due volte con 2x SSC a RT.
   2. Aspirare la soluzione SSC 2x e preibridizzare i campioni aggiungendo almeno 300 μL di tampone di ibridazione della sonda. Coprire i pozzi contenenti le cellule e incubare a 37 °C per 30 minuti.
   3. Preparare la soluzione sonda aggiungendo 1,2 pmol di miscela di sonda al buffer di ibridazione della sonda.
      1. Utilizzare 1,2 μL del materiale della sonda da 1 μM per preparare 300 μL di materiale di lavoro.
   4. Rimuovere la soluzione di preibridizzazione e trasferire i copripavimenti in una camera umidificata.
      1. Pipetta 30-50 μL di soluzione di sonda su parafilm per formare singole goccioline.
   5. Incubare i campioni durante la notte (12-18 ore) a 37 °C.
      
      GIORNO 2
   6. Trasferire i coprispalla in una piastra da 12 pozzetti e rimuovere la soluzione di sonda in eccesso lavandosi per 4 x 5 minuti con 400 μL di tampone di lavaggio della sonda a 37 °C.
      NOTA: In alternativa al posizionamento di aliquote di 30-50 μl su parafilm e sotto le coperture per l'incubazione, aggiungere 300 μL di soluzione di sonda direttamente alle coperture in una piastra da 12 pozza. Questa procedura è più semplice, ma richiede notevoli quantità di reagenti. Riscaldare il tampone di lavaggio della sonda a 37 °C prima dell'uso. Calcola la quantità di tampone necessaria e trasferiscila in un tubo di centrifuga conica da 15 ml.
   7. Lavare i campioni per 2 x 5 minuti con 5x SSCT a RT.
   8. Sostituire la soluzione SSCT 5x con 1x PBS e conservare i campioni a 4 °C fino all'amplificazione.
3. amplificazione
   1. Rimuovere la soluzione 1x PBS dai pozzali e aggiungere almeno 300 μL di tampone di amplificazione ad ogni pozzo. Incubare i campioni per 30 minuti presso RT.
   2. Preparare ogni tornante HCR (h1 e h2) raffreddando a scatto il volume desiderato in tubi separati.
      1. Per preparare 300 μL di soluzione di amplificazione, utilizzare 18 pmol di ogni forcina (ad esempio, per 300 μL, utilizzare 6 μL di una soluzione di forcine stock da 3 μM).
      2. Trasferire la soluzione di forcine in tubi.
      3. Incubare a 95 °C per 90 s.
      4. Fresco a RT per 30 minuti al buio.
   3. Preparare una miscela di forcine aggiungendo i tornanti "h1" e "h2" raffreddati a scatto al tampone di amplificazione.
   4. Posizionare gocce di 30-50 μL di miscela di forcine sul parafilm.
   5. Incubare i campioni durante la notte (12-18 ore) al buio a RT.
      
      GIORNO 3
   6. Trasferire di nuovo i copricapo nella piastra del pozzo 12 e rimuovere i tornanti in eccesso lavandosi per 5 x 5 minuti con 5x SSCT a RT con agitazione.
   7. Aspirare il buffer SSCT 5x e sostituirlo con 1x PBS.
      NOTA: Se necessario, utilizzare i campioni di RNA-FISH in un saggio standard di immunofluorescenza, seguito dalla colorazione dei nuclei (vedere sezione 5).
4. Colorazione nucleare e montaggio a scorrimento
   1. Aspirare la soluzione 1x PBS e sostituirla con 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI, 0,2 μg/mL) in soluzione PBS 1x.
   2. Incubare i campioni per 10 minuti a RT al buio.
   3. Aspirare la soluzione DAPI e lavare le celle due volte con 1x PBS.
   4. Posizionare due gocce di 10 μL ciascuna di mezzo di montaggio; assicurarsi che le gocce siano separate in modo sufficiente per consentire di posizionare due copripasci su un singolo scivolo.
   5. Rimuovere il liquido in eccesso toccando i copripasci su un asciugamano pulito, quindi posizionarli in un mezzo di montaggio antifade con le celle rivolte verso il basso.
   6. Posizionare i campioni montati su una superficie asciutta e piatta al buio e lasciarli curare.
   7. Dopo la polimerizzazione, sigillare i bordi dei copripavimenti con sigillante VALAP o smalto per unghie per evitare che i campioni si asciughino.

5. SARS-CoV-2 RNA-FISH nelle colture di ENE

GIORNO 1

1. Fissaggio e permeabilità della cultura HAE
   1. Aspirare il mezzo e fissare le cellule infette utilizzando la soluzione PFA al 3,7% per 1 h a RT.
   2. Aspirare la soluzione di PFA al 3,7% e lavare le celle due volte con 1x PBS.
      1. Sostituire la soluzione PFA al 3,7% con 1 PBS sotto un inserto Transwell.
   3. Scartare il PBS e disidratare i campioni utilizzando lavaggi da 2 x 5 minuti con meOH al 100% prechilled a -20 °C.
   4. Dopo il secondo lavaggio, sostituire il tampone con MeOH fresco e refrigerato per la permeabilizzazione sotto l'inserto Transwell. Conservare durante la notte a -20 °C.

GIORNO 2

2. reidratazione
   Reidratare i campioni attraverso una serie graduata di soluzioni MeOH/PBST (ciascuna per 5 min) su ghiaccio: 75% MeOH/25% PBST, 50% MeOH/50% PBST, 25% MeOH/75% PBTS e 100% PBST (due volte).
   1. Lavare le celle per 5 minuti sul ghiaccio con 50% 5x SSCT/50% PBST.
   2. Lavare le celle per 5 minuti sul ghiaccio con 5x SSCT.
   3. Sostituire il buffer SSCT 5x con 1x PBS.
3. scoperta
   1. Incubare le cellule (all'interno dell'inserto Transwell) per 5 minuti sul ghiaccio con 100 μL di tampone di ibridazione della sonda. Successivamente, trasferire la piastra nell'incubatore per 30 minuti a 37 °C (preibridizzazione).
      NOTA: Il buffer di ibridazione della sonda deve essere preriscaldato a 37 °C prima dell'uso. Calcolare il volume richiesto: è necessario 100 μL per un singolo inserto Transwell.
   2. Preparare la soluzione della sonda. Poiché 1 mL di soluzione di sonda richiede 4 pmol di sonda, aggiungere 4 μL di soluzione stock di sonda da 1 μM a 1 mL di buffer di ibridazione della sonda e mescolare bene.
      NOTA: Per il rilevamento dell'RNA, utilizzare 100 μL di soluzione di sonda per inserto Transwell. Lasciare la soluzione della sonda sul ghiaccio fino alla fine della fase di preibridizzazione.
   3. Rimuovere la soluzione di preibridizzazione e aggiungere la soluzione sonda.
   4. Incubare le cellule durante la notte (12-18 h) a 37 °C.
      
      GIORNO 3
   5. Rimuovere la sonda in eccesso lavando per 4 x 15 minuti con 100 μL di tampone di lavaggio della sonda a 37 °C.
   6. Lavare i campioni per 2 x 5 min con 5x SSCT a RT.
   7. Sostituire l'SSCT 5x con 1x PBS e conservare i campioni a 4 °C fino all'amplificazione.
4. amplificazione
   1. Preamplificare i campioni incubandoli con tampone di amplificazione per 30 minuti a RT.
   2. Preparare ogni tornante raffreddando a scatto i volumi desiderati in tubi separati.
      1. Per preparare 500 μL di soluzione di amplificazione, utilizzare 30 pmol di ogni forcina (ad esempio, per 500 μL, utilizzare 10 μL di soluzione di forcine stock da 3 μM).
      2. Trasferire la soluzione di forcine ai tubi.
      3. Incubare a 95 °C per 90 s.
      4. Fresco a RT per 30 minuti al buio.
   3. Preparare la soluzione di forcine aggiungendo tutti i tornanti raffreddati a scatto a 500 μL di tampone di amplificazione a RT.
   4. Rimuovere la soluzione di preamplificazione e aggiungere la soluzione completa di forcine.
   5. Incubare i campioni durante la notte (12-18 h) a RT al buio.
   6. Rimuovere i tornanti in eccesso lavandosi con 5x SSCT a RT come segue: 2 x 5 min, 2 x 15 min e 1 x 5 min.
   7. Sostituire la soluzione 5x SSCT con 1x PBS e conservare a 4 °C per non più di 2-3 giorni o procedere direttamente alla colorazione nucleare.
      NOTA: Se necessario, utilizzare i campioni di RNA-FISH in un saggio standard di immunofluorescenza, seguito da colorazione nucleare (vedi sezione 6).
5. Colorazione nucleare e montaggio a scorrimento
   1. Aspirare la soluzione 1x PBS e sostituirla con una soluzione DAPI (0,2 μg/mL) in 1x PBS.
   2. Incubare i campioni per 10 minuti a RT al buio.
   3. Aspirare la soluzione DAPI e lavare le celle due volte con 1x PBS.
   4. Posizionare la membrana ritagliata dagli inserti Transwell su 10 μL di mezzo di montaggio antifade con le celle rivolte verso l'alto e aggiungere un mezzo di montaggio aggiuntivo (5 μL) alla membrana.
   5. Coprire le membrane con coverlips.
   6. Polimerizza i campioni montati su una superficie asciutta e piatta al buio.
   7. Dopo la polimerizzazione, sigillare i bordi dei copripavimenti con sigillante VALAP o smalto per unghie per evitare che i campioni si asciughino.

6. Analisi dell'immunofluorescenza delle cellule Vero e delle colture HAE

NOTA: Eseguire il test di immunofluorescenza il giorno 3 per le linee cellulari o il giorno 4 per le colture HAE. Utilizzare un approccio diverso per ogni modello. Tutte le differenze sono indicate chiaramente.

1. Aspirare la soluzione 1x PBS dai pozzi.
2. Bloccare i campioni per incubazione con albumina di siero bovino 1% con albumina di siero bovino in soluzione PBST per 30 min a 37 °C.
3. Preparare gli anticorpi primari preparando diluizioni appropriate nella soluzione di blocco e incubare.
   1. Per le celle Vero sui coverslips:
      1. Posizionare gocce (30-50 μL) di soluzione anticorpale su parafilm in una camera di umidità.
      2. Posizionare le gocce di copra sulle gocce di anticorpo con le cellule rivolte verso il basso.
   2. Per HAE, sostituire l'agente bloccante negli inserti con soluzione anticorpale (100 μL) e incubare i campioni in una camera umidificata.
      NOTA: Regolare il tempo e la temperatura per ogni incubazione con anticorpo primario. I parametri tipici sono 2 ore a RT o durante la notte a 4 °C.
4. Lavare i campioni per 3 x 5 minuti con PBST.
   1. Per le celle su coverlips, trasferire su una piastra da 12 po 'e aggiungere la soluzione PBST.
   2. Per le colture HAE, sostituire la soluzione anticorpale con la soluzione PBST.
5. Controllare le sorgenti luminose e i filtri disponibili per il microscopio confocale.
6. Scegli gli anticorpi secondari in base alla specie ospite. Scegli i parametri del fluoroforo (lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione, larghezza dello spettro ed efficienza di eccitazione in base alla sorgente luminosa disponibile).
   NOTA: i parametri spettrali possono essere modellati utilizzando strumenti online (vedere Tabella dei materiali).
7. Preparare soluzioni anticorpali secondarie appropriate diluendole con soluzione di blocco.
8. Incubare con anticorpi secondari (come in 6.3), ma incubare per 1 h a 37 °C.
9. Lavare i campioni come nel passaggio 6.4.
10. Colorazione nucleare e montaggio a scorrimento
    1. Per le celle su coverlips
       1. Aspirare il PBST e sostituirlo con DAPI (0,2 μg/mL) in soluzione PBS 1x.
       2. Incubare i campioni per 10 minuti a RT al buio.
       3. Aspirare la soluzione DAPI e lavare le celle due volte con 1x PBS.
       4. Posizionare i copripasci su gocce di 10 μL di mezzo di montaggio con le celle rivolte verso il basso.
       5. Sigillare le copertine con smalto per unghie.
    2. Per le culture HAE
       1. Aspirare il PBST 1x e sostituirlo con DAPI (0,2 μg/mL) in soluzione PBS 1x.
       2. Incubare i campioni per 10 minuti a RT al buio.
       3. Aspirare la soluzione DAPI e lavare le celle due volte con 1x PBS.
       4. Posizionare le membrane ritagliate su gocce di 10 μL di mezzo di montaggio con le celle rivolte verso l'alto e aggiungere un supporto di montaggio extra (5 μL) alla membrana.
       5. Coprire le membrane con coverlips.
       6. Sigillare le copertine con smalto per unghie.

7. Microscopia confocale

1. Definite le tracce specificando i fluorofori utilizzati.
2. Scegli la modalità di scansione e la velocità.
3. Regolare i valori di potenza, guadagno e offset laser per ogni fluoroforo confrontandoli con i rispettivi controlli negativi: per virus, cellule finte; per le proteine cellulari, campioni macchiati di anticorpi di controllo dell'isotipo da un ospite appropriato.
4. Per acquisire un'immagine 3D, attiva la modalità z-stack e imposta i limiti superiore e inferiore. Impostare la dimensione/numero del passaggio.
   NOTA: Per maggiori dettagli sull'imaging del coronavirus, vedi¹⁹.

Risultati

Il protocollo immuno-RNA-FISH descritto in questo manoscritto è stato effettuato utilizzando due sistemi cellulari: una linea cellulare Vero e una coltura HAE 3D. I passaggi principali per entrambi i modelli cellulari sono riportati nella tabella 2. Il protocollo RNA-FISH per la visualizzazione di SARS-CoV-2 nelle colture HAE include passaggi tipici per i campioni di tessuto, cioè la permeabilizzazione con meOH al 100% e la reidratazione attraverso una serie graduata di...

Discussione

Immuno-RNA-FISH è un metodo affidabile per la doppia colorazione di RNA e proteine cellulari. Qui è stato descritto un protocollo immuno-RNA-FISH modificato che consente il rilevamento di RNA SARS-CoV-2 e proteine cellulari nelle linee cellulari e nelle colture HAE. Questo protocollo può essere adattato per l'uso in diversi modelli cellulari tra cui monostrati cellulari o tessuti specifici. Il metodo si basa sul concetto di HCR avviato da una localizzazione del probe appropriata. Successivamente, l'uso di sonde split-...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Confocal Microscope LSM 880	ZEISS
Grant Bio, Mini Rocker- Shaker	Fisher Scientific	12965501
Incubator Galaxy170R	New Brunswick	CO170R-230-1000
Thermomixer Comfort	Eppendorf	5355 000 011
Materials
15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips	LabSolute	7695022
1.5 mL tubes	FL-MEDICAL	5.350.023.053
12-well plate	TTP	92412
Conical centrifuge tube	Sarstedt	5.332.547.254
parafilm	Sigma	P7793-1EA
serological pipets	VWR Collection	612-5523P, 612-5827P
slide glass	PTH CHEMLAND	04-296.202.03
Transwell ThinCerts	Grainer bio-one	665641
Reagents
Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies	Invitrogen
β5-tubulin	Santa Cruz Biotechnology	sc-134234
DAPI	Thermo Scientific	D1306
Disodium phosphate	Sigma	S51136-500G
EGTA	BioShop	EGT101.25
HCR Amplification Buffer	Molecular Instruments, Inc.	BAM01522	Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information
HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647	Molecular Instruments, Inc.	S013922
HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647	Molecular Instruments, Inc.	S012522
HCR Probe Hybridization Buffer	Molecular Instruments, Inc.	BPH03821	Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information
HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid	Molecular Instruments, Inc.	PRE134
HCR Probe Wash Buffer	Molecular Instruments, Inc.	BPW01522	Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information
HEPES	BioShop	HEP001.100
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma	63138-250G
Methanol	Sigma	32213-1L-M
Monopotassium phosphate	Sigma	P5655-100G
Paraformaldehyde	Sigma	P6148-1KG
PIPES	BioShop	PIP666.100
Potassium Chloride	Sigma	P5405-250G
Prolong Diamond Antifade Mounting Medium	Invitrogen	P36970
Sodium Chloride	BioShop	SOD001.5
Trisodium Citrate 2-hydrate	POCH	6132-04-3
Tween-20	BioShop	TWN580.500
	Software
Fluorescence Spectraviewer			Modeling spectral parameters
ImageJ Fiji			Acquiring and processing z-stack images