JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, şiddetli akut solunum sendromu coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA'yı görselleştirmek için RNA floresan in situ hibridizasyonunu (RNA-FISH) immünofluoresans ile birleştiren basit bir yöntemi açıklıyoruz. Bu protokol, SARS-CoV-2 RNA konakçı etkileşimlerinin moleküler özelliklerinin tek hücre düzeyinde anlaşılmasını artırabilir.

Özet

Bu makale, hücre hattında şiddetli akut solunum sendromu coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA'sını ve insan hava yolu epitelinin üç boyutlu (3D) kültürlerini görselleştirmek için immünofluoresans ile birlikte in situ hibridizasyon zincir reaksiyonu (HCR) için bir protokol sunmaktadır. Yöntem, prob lokalizasyonu tarafından başlatılan HCR'ye güvenerek viral RNA'nın son derece spesifik ve hassas görselleştirilmesine izin verir. Bölünmüş başlatıcı problar, floresan etiketli amplifikatörler tarafından sinyalin güçlendirilmiş hale gelir ve konfokal mikroskopide ihmal edilebilir arka plan floresan ile sonuçlanır. Amplifikatörlerin farklı floresan boyalarla etiketlenerek çeşitli hedeflerin aynı anda tanınmasını kolaylaştırır. Bu da, dokulardaki enfeksiyonun haritalandırılmasının viral patogenez ve replikasyonunu tek hücre düzeyinde daha iyi anlamasını sağlar. Bu yöntemin immünofluoresans ile birleşmesi, konak epigenomunun değişimi ve immün yanıt yolları da dahil olmak üzere konak-virüs etkileşimlerinin daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırabilir. Hassas ve spesifik HCR teknolojisi sayesinde, bu protokol bir tanı aracı olarak da kullanılabilir. Tekniğin, gelecekte ortaya çıkabilecek kodlamayan RNA'lar ve RNA virüsleri de dahil olmak üzere herhangi bir RNA'nın algılanmasını sağlamak için kolayca değiştirilebileceğini hatırlamak da önemlidir.

Giriş

SARS-CoV-2, 2019'un sonunda ortaya çıkan ve birkaç ay sonra benzeri görülmemiş bir pandemiye neden olan yeni bir insan betakoronavirüsüdür. Virüs bilimde yeni olduğu için biyolojisinin çoğu ve konak hücreler üzerindeki etkisi bilinmemektedir. Bu nedenle, temel biyolojik özellikleri ve konak üzerindeki etkileri anlaşılacaksa, enfeksiyon sırasında virüs-hücre ve -doku tromizminin haritalandırılması önemlidir. Biyokimyasal, biyolojik ve fiziksel tahliller de dahil olmak üzere virüs konak etkileşimlerini incelemek için çeşitli teknikler kullanılır. In situ hibridizasyon, bir hücre veya dokudaki belirli DNA veya RNA dizilerine lokalize olan etiketli tamamlayıcı DNA, RNA veya değiştirilmiş nükleik asit probları kullanan yaygın bir yöntemdir.

Bir HCR1ile sinyal-gürültü oranını yükselterek hassasiyeti artırmak için değişiklikler içeren yeni bir RNA floresan in situ hibridizasyon (RNA-FISH) yöntemi geliştirilmiştir. HCR, RNA lokalizasyonunun tek hücre düzeyinde incelenmesine izin verir. Yüksek özgüllüğü, duyarlılığı ve çözünürlüğü nedeniyle, bu yöntem sadece temel bilim çalışmaları için değil, aynı zamanda uygulama projeleri için de yararlıdır, örneğin teşhis. Son zamanlarda, bu yöntemin fizibilitesi, tamamen farklılaştırılmış 3D insan hava yolu epitel (HAE) kültürleri içinde siliated hücrelere lokalize SARS-CoV-2 RNA'sını tespit etmek için gösterilmiştir2. HAE kültürleri, "doğal enfeksiyon" mikroçevrimiz3,4bağlamında viral enfeksiyonu incelemek için kullanılan en gelişmiş araçlardan birini oluşturur.

SARS-CoV-2 de dahil olmak üzere insan koronavirüsleri (HCoV) hakkında çeşitli raporlar, HCoV enfeksiyonu ve patofizyolojisi açısından epigenetik değişikliklerin önemini vurgulamaktadır [5'tegözden geçirilmiştir ], örneğin, anjiyotensin dönüştürücü enzim 2 (ACE-2) reseptörü6,7'yikodlayan genin metilasyon deseni. İlginçtir ki, kütle spektrometrik taraması SARS-CoV-2 proteom8ile etkileşime giren birkaç epigenetik faktör tanımladı. Daha spesifik olarak, yapısal olmayan protein 5 (NSP5) epigenetik regülatöre bağlanır, histone deacetylaz 2 ve katalitik olarak inaktif NSP5 (C145A) tRNA metiltransfeaz 1 (24) ile etkileşime girer. Ek olarak, NSP16 metiltransferaz aktivitesi metiltransferaz inhibitörü, sinefungin9tarafından engellenir. Ancak bu epigenetik faktörlerin COVID-19'daki kesin rolü belirsizliğini korumaktadır. HCoV replikasyonu enfekte hücrenin sitoplazmında gerçekleşir ve epigenetik değişikliklerle düzenlenen enflamatuar yanıtları tetikler10.

Örneğin, HCoV-229E nükleer faktör-kappa B sinyalini ince ayarlar ve belirli bölgelerde H3K36 ve H4K5'in asetilasyonını artırarak konak hücresel kromatin manzarasını derinden yeniden programlar11. Orta Doğu solunum sendromuna bağlı koronavirüs enfeksiyonu H3K27me3 seviyelerini arttırır ve spesifik interferon duyarlı genlerin alt kümelerinin promotör bölgelerinde H3K4me3'ün tükenmesi12. Ek olarak, viral RNA, flavivirüsler13, retrovirüsler 14,15ve koronavirüsler16için gösterildiği gibi hücre immün yanıtlarını tetikler. Viral RNA'daki epigenetik belirteçler, insan immün yetmezlik virüsünün m7A metilasyonunda gösterildiği gibi hücresel sensörler tarafından tanınmada rol oynayabilir-1 RNA17. Bununla birlikte, sorular devam etmektedir: SARS-CoV-2 RNA'nın bağışıklık yanıtı üzerindeki etkisi nedir ve epigenetik izler söz konusu mudur?

Burada, hücre hatlarının ve 3D dokuların (tamamen farklılaştırılmış HAE) immünofluoresans analizi ile birlikte optimize edilmiş bir RNA-FISH yöntemi tanımlanmıştır. FISH ve immunofluorescence gibi sitolojik yöntemler yaygın olarak kullanılsa da, HCR tabanlı bu yeni nesil in situ hibridizasyon yöntemi hiçbir zaman virüs tespiti için kullanılmamıştır (yeni bir yayın hariç)2. Genel olarak, immünostaining ve FISH aşağıdaki adımları gerektirir: probların veya antikorların penetrasyonunu sağlamak için permeabilizasyon; hücresel malzemenin sabit ve korunduğu sabitleme; antikorların veya nükleik asit problarının uygulandığı tespit; ve son olarak, görselleştirme için örneklerin montajı.

Mevcut protokoller bu genel özellikleri paylaşsa da, ilgili parametrelere göre belirgin bir şekilde değişir. Burada, HAE kültürlerinde ve Vero hücrelerinde SARS-CoV-2 RNA'sını tespit etmek için optimize edilmiş, basit, immün-RNA-FISH protokolü tanımlanmıştır. Teknik aşağıdaki adımları içerir: (1) paraformaldehitli hücrelerin sabitlenmesi; (2) deterjan veya metanol (MeOH) ile permeabilizasyon; (3) dereceli bir dizi MeOH çözümü ile rehidrasyon (yalnızca HAE kültürleri); (4) algılama; (5) SARS-CoV-2 RNA'yı tespit etmek için HCR teknolojisini kullanarak amplifikasyon; (6) immünostaining; ve (7) konfokal mikroskop altında görüntüleme.

Protokol

1. Tampon hazırlığı

  1. 500 mL 2x PHEM tampon için, 18,14 g piperazin-N,N′-bis(2-etanesülfonic asit) (PIPES), 6,5 g 4-(2-hidroksyetil)-1-piperazine etanesülfonic asit (HEPES), 3.8 g etilen glikol tetraasetik asit (EGTA) ve 0.99 g magnezyum sülfat (MgSO4). Damıtılmış su (dH2O) ile hacmi ~400 mL'ye kadar yapın, karıştırın ve 10 M potasyum hidroksit (KOH) veya sodyum hidroksit (NaOH) kullanarak pH'ı 7,0'ye ayarlayın. Son sesi 500 mL'ye kadar yapın ve ardından 50 mL aliquots'a bölün. Gerekli olana kadar -20 °C'de saklayın.
    NOT: pH 7.0'a ulaşana kadar arabellek temiz olmayacaktır.
  2. %37 w/v paraformaldehit (PFA) stok çözeltisi hazırlayın. 50 mL için, bir cam şişede 18,5 g PFA ve 35 mL dH2O karıştırın. Şişeyi ısıtmalı manyetik bir karıştırıcıya yerleştirin. 900 μL 1 M KOH veya NaOH ekleyin ve çözelti netleşene kadar karıştırın. Soğumaya bırakın ve 50 mL konik santrifüj tüpüne aktarın; dH2O ile 50 mL'ye kadar yükleme. Çözelti gerekli olana kadar -20 °C'de saklanabilir.
    NOT: Formaldehit, koruyucu eldiven ve laboratuvar önlüğü giyerken duman kaputunda ele alınmalıdır.
  3. Fiksasyon tamponunu hazırlayın (%3,7 PFA PHEM ile arabelleğe alındı). 50 mL için, 50 mL konik santrifüj tüpünde 5 mL% 37 PFA çözeltisi, 25 mL 2x PHEM tamponu ve20mL dH 2 O'nu birleştirin. Gerekli olana kadar -20 °C'de saklayın.
    NOT: Çözdükten sonra tampon 4 °C'de 3 aya kadar saklanabilir.
  4. PBST'i hazırlayın (1x fosfat tamponlu salinde [PBS]) %0,1 Ara-20). 50 mL için, 50 μL% 100 Ara-20 ila 50 mL 1x PBS ekleyin ve iyice karıştırın.
    NOT: Çözelti oda sıcaklığında (RT) saklanabilir.
  5. MeOH/PBST'yi 3:1, 1:1 ve 1:3 oranlarında birleştirerek rehidrasyon tamponları hazırlayın (her birinin 100 mL'lik son hacmi; bkz. Tablo 1).
    NOT: MeOH çok toksik ve yanıcıdır. Optik sinire zarar verebildiğinden, herhangi bir açık alevden kaçınarak duman kaputunda ele alınmalıdır. MeOH ve PBST'nin karıştırılması eksotermik reaksiyon oluşturduğundan, çözeltileri buz üzerinde birleştirin.
  6. 1000 mL 20x SSC için, 175,3 g sodyum klorür (NaCl) ve 88,2 g sodyum sitratını bir beherde birleştirin ve çözünene kadar 800 mL dH2O. Stir ile doldurun ve NaOH kullanarak pH'ı 7,2'ye ayarlayın. Toplam 1000 mL hacme dH2O ekleyin ve 0,22 μm'lik bir filtreden otomatik kapatılmış bir şişeye otoklavlayın veya filtreleyin.
  7. 50 mL 5x SSCT için, 12,5 mL 20x SSC tamponu 37,5 mL dH2O ile birleştirin ve %100 Ara-20'nin 50 μL'sini ekleyin. İyice karıştırın.
  8. %50 5x SSCT/%50 PBST'nin 50 mL'si için, 5x SSCT'nin 25 mL'sini 25 mL PBST ile birleştirin.
  9. 50 mL 2x SSC için, 5 mL 10x SSC tamponu 45 mL dH2O ile birleştirin.
    NOT: Tüm SSC arabellekleri karanlıkta RT'de saklanmalıdır.

2. Hedef tanımı, problar ve amplifikatörler

  1. Amplifikatörler ve problar tasarlamak için üreticinin web sitesinde bulunan araçları kullanın. Probların SARS-CoV-2 N geninin ters DNA ipliğini tamamlayıcı olduğundan emin olun (Ek Şekil 1).
  2. En iyi prob kümesi boyutunu belirleyin (görselleştirme için 20 prob kümesi yeterlidir).
  3. Hedef RNA algılaması için kullanılan amplifikatörleri ayarlayın.
    1. Alexa Fluor 647 etiketli HCR amplifikatörü B1 kullanın.
      NOT: Bir HCR amplifikatörü, h1 ve h2'nin metastable HCR saç tokalarından oluşur. Çoklayıcılı denemeler bu protokol kullanılarak tasarlanabilir. Bu planlanmışsa, her hedef RNA'nın aynı örnek içinde görüntülenecek farklı bir HCR amplifikatörü (B1, B2, ...) seçin (örneğin, hedef 1 için amplifikatör B1, hedef 2 için amplifikatör B2, ...).

3. Hücre kültürü ve SARS-CoV-2 ile enfeksiyon

  1. Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında %5 fetal sığır serumu içeren Kültür Vero (maymun böbrek epitel hücreleri) hücreleri.
    1. 12 kuyulu bir tabakta kapak örtülerine (No. 1, 15 × 15 mm) 50.000 hücre tohumu.
  2. Geçirgen Transwell kesici uç desteklerinde18 olarak tanımlandığı gibi tamamen farklılaştırılmış HAE kültürlerini bir membran (çap = 6,5 mm) ve bronşiyal epitel büyüme ortamında tamamen birleştiğinde kültür hazırlayın.
  3. Virüs enfeksiyonu
    1. ML başına 1000x ortanca doku kültürü enfeksiyöz dozunda (TCID50)SARS-CoV-2 ile hücreleri aşıla
    2. Hücreleri 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatır.
    3. İlişkisiz virüsü temizlemek için hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.
    4. 48 saat boyunca kültür hücreleri.

4. Kapaklar üzerinde kültürlenmiş Vero hücrelerinde SARS-CoV-2 RNA-FISH

1. GÜN

  1. Hücreleri sabitleme ve nüfuz etme
    1. RT'de 1 saat boyunca %3,7 w/v PFA çözümü ile enfekte olmuş hücreleri düzeltin.
    2. %3,7 PFA çözeltisini emiş ve hücreleri 1x PBS kullanarak iki kez yıkayın.
    3. RT'de 10 dakika pbst çözeltisi ile hücreleri ajitasyon ile permeabilize edin.
    4. PBST'yi aspire edin ve hücreleri 1x PBS ile iki kez yıkayın.
  2. Algılama
    1. 1x PBS çözeltisini epire edin ve hücreleri RT'de 2x SSC ile iki kez yıkayın.
    2. 2x SSC çözeltisini epire edin ve en az 300 μL prob hibridizasyon tamponu ekleyerek numuneleri önceden dengeler. Hücreleri içeren kuyuları örtün ve 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. Prob hibridizasyon tamponuna 1,2 pmol prob karışımı ekleyerek prob çözümünü hazırlayın.
      1. 300 μL çalışma stoğu hazırlamak için 1 μM prob stoğunun 1,2 μL'sini kullanın.
    4. Prehidrizasyon çözeltisini çıkarın ve kapakları nemlendirilmiş bir odaya aktarın.
      1. Pipet 30-50 μL prob çözeltisi parafilm üzerine bireysel damlacıklar oluşturmak için.
    5. Numuneleri 37 °C'de bir gecede (12-18 saat) kuluçkaya yatırın.

      2. GÜN
    6. Kapakları tekrar 12 kuyulu bir tabağa aktarın ve 37 °C'de 400 μL prob yıkama tamponu ile 4 x 5 dakika yıkayarak fazla prob çözeltisini çıkarın.
      NOT: 30-50 μl aliquots'u parafilme ve kuluçka için kapak altlarına yerleştirmeye alternatif olarak, 12 kuyulu bir plakadaki kapaklara doğrudan 300 μL prob çözeltisi ekleyin. Bu prosedür daha basittir, ancak önemli miktarda reaktif gerektirir. Kullanmadan önce prob yıkama tamponu 37 °C'ye ısıtın. Gereken tampon miktarını hesaplayın ve 15 mL konik santrifüj tüpüne aktarın.
    7. RT'de 5x SSCT ile numuneleri 2 x 5 dakika yıkayın.
    8. 5x SSCT solüsyonunun yerine 1x PBS kullanın ve numuneleri amplifikasyona kadar 4 °C'de saklayın.
  3. Amplifikasyon
    1. 1x PBS çözeltisini kuyulardan çıkarın ve her kuyuya en az 300 μL amplifikasyon tamponu ekleyin. RT'de örnekleri 30 dakika kuluçkaya yatırın.
    2. İstediğiniz hacmi ayrı tüplerde snap soğutma ile her bir HCR saç tokasını (h1 ve h2) hazırlayın.
      1. 300 μL amplifikasyon çözeltisi hazırlamak için her saç tokasının 18 pmolünü kullanın (örneğin, 300 μL için 3 μM stok saç tokası çözeltisinin 6 μL'sini kullanın).
      2. Saç tokası çözeltisini tüplere aktarın.
      3. 90 sn için 95 °C'de kuluçkaya yatır.
      4. Karanlıkta 30 dakika RT'ye soğutun.
    3. Ek soğutmalı "h1" ve "h2" saç tokalarını amplifikasyon tamponuna ekleyerek bir saç tokası karışımı hazırlayın.
    4. Parafilm üzerine 30-50 μL saç tokası karışımı damlaları yerleştirin.
    5. RT'de örnekleri karanlıkta bir gecede (12-18 saat) kuluçkaya yatırın.

      3. GÜN
    6. Kapakları tekrar 12 kuyu plakasına aktarın ve RT'de 5x SSCT ile 5 x 5 dakika boyunca ajitasyonla yıkayarak fazla saç tokalarını çıkarın.
    7. 5x SSCT arabelleğini aspire edin ve 1x PBS ile değiştirin.
      NOT: Gerekirse, RNA-FISH örneklerini standart bir immünofluoresans testinde kullanın, ardından çekirdeklerin lekelenmesini takip edin (bkz. bölüm 5).
  4. Nükleer boyama ve kayma montajı
    1. 1x PBS çözeltisini epire edin ve 1x PBS çözeltisinde 4′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI, 0.2 μg / mL) ile değiştirin.
    2. Karanlıkta RT'de örnekleri 10 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. DAPI çözeltisini epire edin ve hücreleri 1x PBS ile iki kez yıkayın.
    4. Montaj ortamının her birine 10 μL'lik iki damla yerleştirin; damlaların tek bir kaydırağa iki kapaklı yerleştirilmesine izin vermek için yeterince ayrıldığından emin olun.
    5. Kapakları temiz bir havluya dokunarak fazla sıvıyı çıkarın ve ardından hücreler aşağı bakacak şekilde antifade montaj ortamına yerleştirin.
    6. Monte edilen numuneleri karanlıkta kuru, düz bir yüzeye yerleştirin ve tedavi etmelerine izin verin.
    7. Kürlemenin ardından, numunelerin kurumasını önlemek için kapak kapaklarının kenarlarını VALAP dolgu macun veya oje ile kapatın.

5. HAE kültürlerinde SARS-CoV-2 RNA-FISH

1. GÜN

  1. HAE kültürünü sabitleme ve permeabilizasyon
    1. Ortamı aspire edin ve RT'de 1 saat boyunca% 3.7 PFA çözeltisi kullanarak enfekte hücreleri sabitle.
    2. %3,7 PFA çözeltisini epire edin ve hücreleri 1x PBS ile iki kez yıkayın.
      1. Transwell kesici ucun altında %3,7 PFA çözümünü 1x PBS ile değiştirin.
    3. PBS'yi atın ve %100 MeOH önsezikli -20 °C'ye kadar 2 x 5 dakikalık yıkamalar kullanarak numuneleri susuz verin.
    4. İkinci yıkamadan sonra, Transwell kesici ucun altında permeabilizasyon için tamponu taze, soğutulmuş MeOH ile değiştirin. Gece boyunca -20 °C'de saklayın.

2. GÜN

  1. Rehidrasyon
    Numuneleri buz üzerinde dereceli bir dizi MeOH/PBST çözeltisi (her biri 5 dakika boyunca) ile yeniden sulendir: %75 MeOH/%25 PBST, %50 MeOH/%50 PBST, %25 MeOH/%75 PBTS ve %100 PBST (iki kez).
    1. Hücreleri % 50 5x SSCT / % 50 PBST ile buzda 5 dakika yıkayın.
    2. Hücreleri 5x SSCT ile buzda 5 dakika yıkayın.
    3. 5x SSCT arabelleği 1x PBS ile değiştirin.
  2. Algılama
    1. Hücreleri (Transwell kesici ucunun içinde) 100 μL prob hibridizasyon tamponu ile buz üzerinde 5 dakika kuluçkaya yatırın. Ardından, plakayı 37 °C'de (prehidrizasyon) 30 dakika boyunca inkübatöre aktarın.
      NOT: Prob hibridizasyon tamponu kullanılmadan önce önceden 37 °C'ye ısıtılmalıdır. Gerekli hacmi hesaplayın: Tek bir Transwell kesici uç için 100 μL gereklidir.
    2. Prob çözeltisini hazırlayın. 1 mL prob çözeltisi 4 pmol prob gerektirdiğinden, 1 mL prob hibridizasyon tamponuna 4 μL 1 μM prob stok çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın.
      NOT: RNA algılama için Transwell kesici uç başına 100 μL prob çözeltisi kullanın. Prob çözeltisini önhidrizasyon adımının sonuna kadar buzda bırakın.
    3. Prehidrizasyon çözeltisini çıkarın ve prob çözeltisini ekleyin.
    4. Hücreleri 37 °C'de bir gecede (12-18 saat) kuluçkaya yatırın.

      3. GÜN
    5. Fazla probu 37 °C'de 100 μL prob yıkama tamponu ile 4 x 15 dakika yıkayarak çıkarın.
    6. Rt'de 5x SSCT ile numuneleri 2 x 5 dakika yıkayın.
    7. 5x SSCT'yi 1x PBS ile değiştirin ve numuneleri amplifikasyona kadar 4 °C'de saklayın.
  3. Amplifikasyon
    1. Rt'de 30 dakika boyunca amplifikasyon tamponu ile inkübe ederek numuneleri önceden örnekle.
    2. İstediğiniz hacimleri ayrı tüplerde soğutarak her saç tokasını hazırlayın.
      1. 500 μL amplifikasyon çözeltisi hazırlamak için, her saç tokasının 30 pmolunu kullanın (örneğin, 500 μL için 10 μL 3 μM stok saç tokası çözeltisi kullanın).
      2. Saç tokası çözeltisini tüplere aktarın.
      3. 90 sn için 95 °C'de kuluçkaya yatır.
      4. Karanlıkta 30 dakika RT'ye soğutun.
    3. RT'de 500 μL amplifikasyon tamponuna tüm snap soğutmalı saç tokalarını ekleyerek saç tokası çözümünü hazırlayın.
    4. Önamplifikasyon çözümünü çıkarın ve tam saç tokası çözeltisini ekleyin.
    5. Karanlıkta RT'de numuneleri gece boyunca (12-18 saat) kuluçkaya yatırın.
    6. RT'de 5x SSCT ile yıkayarak fazla saç tokalarını şu şekilde çıkarın: 2 x 5 dk, 2 x 15 dk ve 1 x 5 dk.
    7. 5x SSCT solüsyonunun yerine 1x PBS kullanın ve 4 °C'de 2-3 günden fazla saklamayın veya doğrudan nükleer lekeleme işlemine geçin.
      NOT: Gerekirse, RNA-FISH örneklerini standart bir immünofluoresans testinde ve ardından nükleer boyamada kullanın (bkz. bölüm 6).
  4. Nükleer boyama ve kayma montajı
    1. 1x PBS çözeltisini epire edin ve 1x PBS'de DAPI çözeltisi (0,2 μg/mL) ile değiştirin.
    2. Karanlıkta RT'de örnekleri 10 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. DAPI çözeltisini epire edin ve hücreleri 1x PBS ile iki kez yıkayın.
    4. Transwell kesici uçlardan kesilen membranı, hücreler yukarı bakacak şekilde 10 μL antifade montaj ortamına yerleştirin ve membrana ekstra montaj ortamı (5 μL) ekleyin.
    5. Zarları kapakçıklarla örtün.
    6. Monte edilen numuneleri karanlıkta kuru ve düz bir yüzeyde iyileştirin.
    7. Kürlemenin ardından, numunelerin kurumasını önlemek için kapak kapaklarının kenarlarını VALAP dolgu macun veya oje ile kapatın.

6. Vero hücrelerinin ve HAE kültürlerinin immünoresans analizi

NOT: Hücre hatları için 3. günde veya HAE kültürleri için 4. günde immünofluoresans testini gerçekleştirin. Her model için farklı bir yaklaşım kullanın. Tüm farklılıklar açıkça belirtilmiştir.

  1. Kuyulardan 1x PBS çözeltisini epire edin.
  2. PBST çözeltisinde %1 w/v sığır serum albümin ile örnekleri 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübasyonla engelleyin.
  3. Blokaj çözeltisinde uygun seyreltmeler hazırlayarak birincil antikorları hazırlayın ve kuluçkaya yatırın.
    1. Kapaklardaki Vero hücreleri için:
      1. Antikor çözeltisinin damlalarını (30-50 μL) bir nem odasında parafilmin üzerine yerleştirin.
      2. Kapakları, hücreler aşağı bakacak şekilde antikor damlalarının üzerine yerleştirin.
    2. HAE için kesici uçlardaki blokaj maddesini antikor çözeltisi (100 μL) ile değiştirin ve numuneleri nemlendirilmiş bir odada kuluçkaya yatırın.
      NOT: Birincil antikor ile her inkübasyon için zamanı ve sıcaklığı ayarlayın. Tipik parametreler RT'de 2 saat veya 4 °C'de bir gecededir.
  4. Örnekleri PBST ile 3 x 5 dakika yıkayın.
    1. Kapaklardaki hücreler için 12 kuyulu bir tabağa aktarın ve PBST çözeltisi ekleyin.
    2. HAE kültürleri için antikor çözeltisini PBST çözeltisi ile değiştirin.
  5. Konfokal mikroskop için mevcut ışık kaynaklarını ve filtreleri kontrol edin.
  6. Konak türlerine göre ikincil antikorları seçin. Florofor parametrelerini seçin (mevcut ışık kaynağına göre heyecan ve emisyon dalga boyları, spektrum genişliği ve heyecan verimliliği).
    NOT: Spektral parametreler çevrimiçi araçlar kullanılarak modellenebilir (bkz. Malzeme Tablosu).
  7. Uygun ikincil antikor çözeltilerini blokaj çözeltisi ile seyrelterek hazırlayın.
  8. sekonder antikorlarla kuluçkaya yatırın (6.3'te olduğu gibi), ancak 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
  9. Örnekleri adım 6.4'teki gibi yıkayın.
  10. Nükleer boyama ve kayma montajı
    1. Kapaklardaki hücreler için
      1. PBST'yi aspire edin ve 1x PBS çözeltisinde DAPI (0,2 μg/mL) ile değiştirin.
      2. Karanlıkta RT'de örnekleri 10 dakika kuluçkaya yatırın.
      3. DAPI çözeltisini epire edin ve hücreleri 1x PBS ile iki kez yıkayın.
      4. Kapakları, hücreler aşağı bakacak şekilde 10 μL montaj ortamı damlalarına yerleştirin.
      5. Kapakları oje ile kapatın.
    2. HAE kültürleri için
      1. 1x PBST'yi aspire edin ve 1x PBS çözeltisinde DAPI (0,2 μg/mL) ile değiştirin.
      2. Karanlıkta RT'de örnekleri 10 dakika kuluçkaya yatırın.
      3. DAPI çözeltisini epire edin ve hücreleri 1x PBS ile iki kez yıkayın.
      4. Kesme zarlarını hücreler yukarı bakacak şekilde 10 μL montaj ortamının damlalarına yerleştirin ve zara ekstra (5 μL) montaj ortamı ekleyin.
      5. Zarları kapakçıklarla örtün.
      6. Kapakları oje ile kapatın.

7. Konfokal mikroskopi

  1. Kullanılan floroforları belirterek parçaları tanımlayın.
  2. Tarama modunu ve hızını seçin.
  3. Her florofor için lazer gücünü, kazancını ve ofset değerlerini ilgili negatif kontrollerle karşılaştırarak ayarlayın: virüs, sahte enfekte hücreler için; hücresel proteinler için, uygun bir konaktan izotip kontrol antikorları ile lekelenmiş örnekler.
  4. 3B görüntü elde etmek için z yığını modunu etkinleştirin ve üst ve alt sınırları ayarlayın. Adım boyutunu/numarasını ayarlayın.
    NOT: Koronavirüs görüntüleme hakkında dahafazla bilgi için, bkz.

Sonuçlar

Bu yazıda açıklanan immün-RNA-FISH protokolü iki hücresel sistem kullanılarak gerçekleştirilmiştir: Bir Vero hücre hattı ve 3D HAE kültürü. Her iki hücresel model için ana adımlar Tablo 2. SARS-CoV-2'nin HAE kültürlerinde görselleştirilmesi için RNA-FISH protokolü, doku örnekleri için tipik olan adımları içerir, yani% 100 MeOH ile permeabilizasyon ve dereceli bir Dizi MeOH-PBS ve% 0.1 Ara çözeltisi ile rehidrasyon. RNA-FISH tamamlandıktan s...

Tartışmalar

Immuno-RNA-FISH, RNA ve hücresel proteinlerin çift boyanma için güvenilir bir yöntemdir. Burada, hücre hatlarında ve HAE kültürlerinde SARS-CoV-2 RNA ve hücresel proteinlerin tespit edilmesine izin veren değiştirilmiş bir immün-RNA-FISH protokolü tanımlanmıştır. Bu protokol, hücre monolayerleri veya belirli dokular dahil olmak üzere farklı hücre modellerinde kullanılmak üzere uyarlanabilir. Yöntem, uygun prob yerelleştirmesi tarafından başlatılan bir HCR kavramına dayanır. Daha sonra, siny...

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma SARS-CoV-2 ile ilgili araştırmalar için Bilim ve Yükseköğretim Bakanlığı tarafından ve Ulusal Bilim Merkezi'nden hibelerle desteklendi (UMO2017/27/B/NZ6/02488'i K.P.'ye ve UMO-2018/30/E/NZ1/00874'ü A.K.-P.'ye verir).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Confocal Microscope LSM 880ZEISS
Grant Bio, Mini Rocker- ShakerFisher Scientific12965501
Incubator Galaxy170RNew BrunswickCO170R-230-1000
Thermomixer ComfortEppendorf5355 000 011
Materials
15 mm x 15 mm NO. 1 coverslipsLabSolute7695022
1.5 mL tubesFL-MEDICAL5.350.023.053
12-well plateTTP92412
Conical centrifuge tubeSarstedt5.332.547.254
parafilmSigmaP7793-1EA
serological pipetsVWR Collection612-5523P, 612-5827P
slide glassPTH CHEMLAND04-296.202.03
Transwell ThinCertsGrainer bio-one665641
Reagents
Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies Invitrogen
β5-tubulin Santa Cruz Biotechnology sc-134234
DAPIThermo ScientificD1306
Disodium phosphateSigmaS51136-500G
EGTABioShopEGT101.25
HCR Amplification BufferMolecular Instruments, Inc.BAM01522Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information
HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647Molecular Instruments, Inc.S013922
HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647Molecular Instruments, Inc.S012522
HCR Probe Hybridization BufferMolecular Instruments, Inc.BPH03821Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information
HCR probe set for SARS-CoV-2 NcapsidMolecular Instruments, Inc.PRE134
HCR Probe Wash BufferMolecular Instruments, Inc.BPW01522Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information
HEPESBioShopHEP001.100
Magnesium sulfate heptahydrateSigma63138-250G
MethanolSigma32213-1L-M
Monopotassium phosphateSigmaP5655-100G
ParaformaldehydeSigmaP6148-1KG
PIPESBioShopPIP666.100
Potassium ChlorideSigmaP5405-250G
Prolong Diamond Antifade Mounting MediumInvitrogenP36970
Sodium ChlorideBioShopSOD001.5
Trisodium Citrate 2-hydratePOCH 6132-04-3
Tween-20BioShopTWN580.500
Software
Fluorescence SpectraviewerModeling spectral parameters
ImageJ FijiAcquiring and processing z-stack images

Referanslar

  1. Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145, (2018).
  2. Milewska, A., et al. Replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 in human respiratory epithelium. Journal of Virology. 94, (2020).
  3. Banach, B. S., et al. Human airway epithelial cell culture to identify new respiratory viruses: coronavirus NL63 as a model. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 19-26 (2009).
  4. Milewska, A., et al. Entry of human coronavirus NL63 into the cell. Journal of Virology. 92, (2018).
  5. El Baba, R., Herbein, G. Management of epigenomic networks entailed in coronavirus infections and COVID-19. Clinical Epigenetics. 12, 118 (2020).
  6. Pinto, B. G. G., et al. ACE2 expression is increased in the lungs of patients with comorbidities associated with severe COVID-19. Journal of Infectious Diseases. 222 (4), 556-563 (2020).
  7. Verdecchia, P., Cavallini, C., Spanevello, A., Angeli, F. The pivotal link between ACE2 deficiency and SARS-CoV-2 infection. European Journal of Internal Medicine. 76, 14-20 (2020).
  8. Gordon, D. E., et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature. 583, 459-468 (2020).
  9. Ferron, F., Decroly, E., Selisko, B., Canard, B. The viral RNA capping machinery as a target for antiviral drugs. Antiviral Research. 96 (1), 21-31 (2012).
  10. Mehta, S., Jeffrey, K. L. Beyond receptors and signaling: epigenetic factors in the regulation of innate immunity. Immunology and Cell Biology. 93 (3), 233-244 (2015).
  11. Poppe, M., et al. The NF-kappaB-dependent and -independent transcriptome and chromatin landscapes of human coronavirus 229E-infected cells. PLoS Pathogens. 13, 1006286 (2017).
  12. Schafer, A., Baric, R. S. Epigenetic landscape during coronavirus infection. Pathogens. 6 (1), 8 (2017).
  13. Carletti, T., et al. Viral priming of cell intrinsic innate antiviral signaling by the unfolded protein response. Nature Communications. 10, 3889 (2019).
  14. Heil, F., et al. Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8. Science. 303 (5663), 1526-1529 (2004).
  15. Sze, A., et al. Host restriction factor SAMHD1 limits human T cell leukemia virus type 1 infection of monocytes via STING-mediated apoptosis. Cell Host and Microbe. 14 (4), 422-434 (2013).
  16. Kikkert, M. Innate immune evasion by human respiratory RNA viruses. Journal of Innate Immunity. 12, 4-20 (2020).
  17. Kennedy, E. M., et al. Posttranscriptional m(6)A editing of HIV-1 mRNAs enhances viral gene expression. Cell Host and Microbe. 22 (6), 830 (2017).
  18. Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Human Cell Culture Protocols in Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).
  19. Milewska, A., Owczarek, K., Szczepanski, A., Pyrc, K. Visualizing coronavirus entry into cells. Methods in Molecular Biology. 2203, 241-261 (2020).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 166SARS CoV 2RNA FISHHibridizasyon zinciri reaksiyonumm nofluoresansHuman Airway Epitel HAEPermeabilizasyonKonfokal mikroskopi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır