Visualización Del SARS-CoV-2 Usando Inmuno ARN-Fluorescencia Hibridación In Situ

Resumen

Aquí, describimos un método simple que combina el hibridación in situ de la fluorescencia del ARN (RNA-PESCADO) con la inmunofluorescencia para visualizar el ARN agudo severo del coronavirus 2 del coronavirus del síndrome respiratorio (SARS-CoV-2). Este protocolo puede aumentar la comprensión de las características moleculares de las interacciones ARN-huésped SARS-CoV-2 a nivel unicelular.

Resumen

Este manuscrito proporciona un protocolo para la reacción en cadena in situ del hibridación (HCR) juntada con inmunofluorescencia para visualizar el ARN agudo severo del coronavirus 2 del coronavirus (SARS-CoV-2) del síndrome respiratorio agudo en variedades de células y culturas tridimensionales (3D) del epitelio humano de la vía aérea. El método permite la visualización altamente específica y sensible del ARN viral confiando en el HCR iniciado por la localización de la punta de prueba. Las sondas de iniciador dividido ayudan a amplificar la señal mediante amplificadores marcados fluorescentemente, lo que resulta en una fluorescencia de fondo insignificante en la microscopía confocal. El etiquetado de amplificadores con diferentes colorantes fluorescentes facilita el reconocimiento simultáneo de varios objetivos. Esto, a su vez, permite el mapeo de la infección en los tejidos para comprender mejor la patogénesis viral y la replicación a nivel unicelular. El acoplamiento de este método con la inmunofluorescencia puede facilitar una mejor comprensión de las interacciones huésped-virus, incluida la alternancia del epigenoma del huésped y las vías de respuesta inmune. Debido a la tecnología sensible y específica del HCR, este protocolo también se puede utilizar como herramienta de diagnóstico. También es importante recordar que la técnica puede modificarse fácilmente para permitir la detección de cualquier ARN, incluidos los ARN no codificantes y los virus de ARN que puedan surgir en el futuro.

Introducción

El SARS-CoV-2 es un nuevo betacoronavirus humano que surgió a finales de 2019, causando una pandemia sin precedentes unos meses después. Debido a que el virus es nuevo para la ciencia, gran parte de su biología y su impacto en las células huésped siguen siendo desconocidos. Por lo tanto, el mapeo del tropismo virus-célula y -tejido durante la infección es importante si se quieren entender sus características biológicas básicas y sus efectos sobre el huésped. Varias técnicas se utilizan para examinar la interacción virus-huésped incluyendo análisis bioquímicos, biológicos, y físicos. El hibridación in situ es un método común que emplea la DNA complementaria etiquetada, el ARN, o las puntas de prueba modificadas del ácido nucleico, que localizan a las secuencias específicas de la DNA o del ARN en una célula o un tejido.

Se ha desarrollado un nuevo método de hibridación in situ fluorescente de ARN (RNA-FISH) que incorpora modificaciones para aumentar la sensibilidad mediante la amplificación de la relación señal/ruido a través de un HCR^1. HCR permite el estudio de la localización del ARN a nivel unicelular. Debido a su alta especificidad, sensibilidad y resolución, este método es útil no solo para estudios de ciencias básicas, sino también para proyectos de aplicación, por ejemplo, diagnósticos. Recientemente, se demostró la viabilidad de este método para la detección de ARN del SARS-CoV-2 localizado en células ciliadas dentro de cultivos de epitelio de vía aérea humana (AE) 3D totalmente diferenciados^2. Los cultivos de AE constituyen una de las herramientas más avanzadas utilizadas para estudiar la infección viral en el contexto del microambiente de "infección natural"^3,4.

Varios informes sobre coronavirus humanos (HCoV), incluido el SARS-CoV-2, destacan la importancia de las modificaciones epigenéticas con respecto a la infección por HCoV y la fisiopatología [revisada en ^5],por ejemplo, el patrón de metilación del gen que codifica el receptor de la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE-2)^6,7. Curiosamente, el cribado espectrométrico de masas identificó varios factores epigenéticos que interactúan con el proteoma SARS-CoV-2^8. Más específicamente, la proteína no estructural 5 (NSP5) se une al regulador epigenético, la histona desacetilasa 2, y la NSP5 catalíticamente inactiva (C145A) interactúa con la ARNt metiltransferasa 1 (24). Además, la actividad de la metiltransferasa NSP16 es bloqueada por el inhibidor de la metiltransferasa, la sinefungina^9. Sin embargo, el papel exacto de estos factores epigenéticos en el COVID-19 sigue sin estar claro. La replicación del VHCo tiene lugar en el citoplasma de la célula infectada, y desencadena respuestas inflamatorias que son reguladas por modificaciones epigenéticas¹⁰.

Por ejemplo, HCoV-229E ajusta la señalización nuclear del factor-kappa B y reprograma profundamente el paisaje de la cromatina celular del huésped aumentando la acetilación de H3K36 y H4K5 en ciertas regiones¹¹. La infección por coronavirus relacionada con el síndrome respiratorio de Oriente Medio aumenta los niveles de H3K27me3 y agota el H3K4me3 en las regiones promotoras de subconjuntos de genes específicos sensibles al interferón¹². Además, el ARN viral desencadena respuestas inmunitarias celulares, como se ha demostrado para los flavivirus^13,retrovirus^14,15y coronavirus^16. Los marcadores epigenéticos en el ARN viral pueden desempeñar un papel en el reconocimiento por los sensores celulares, como se muestra para la metilación m7A del ARN 17 del virus de la inmunodeficiencia^humana-1. Sin embargo, quedan preguntas: ¿Cuál es el impacto del ARN del SARS-CoV-2 en la respuesta inmune, y están involucradas las marcas epigenéticas?

Aquí, un método optimizado del ARN-PESCADO juntado con el análisis de la inmunofluorescencia de variedades de células y de tejidos 3D (HAE totalmente distinguido) se ha descrito. Aunque los métodos citológicos, como fish e inmunofluorescencia, se utilizan ampliamente, este método de hibridación in situ de nueva generación basado en el HCR nunca se ha utilizado para la detección de virus (excepto en una publicación reciente)². En general, la inmunotensación y fish requieren los siguientes pasos: permeabilización para permitir la penetración de sondas o anticuerpos; fijación en la que el material celular se fija y se conserva; detección en la que se aplican anticuerpos o sondas de ácido nucleico; y por último, montaje de las muestras para su visualización.

Aunque los protocolos existentes comparten estas características generales, varían notablemente con respecto a los parámetros implicados. Aquí, un protocolo optimizado, simple, inmuno-ARN-FISH se ha descrito para detectar el ARN sars-CoV-2 en cultivos de AE y células Vero. La técnica comprende los pasos siguientes: (1) fijación de células con paraformacionaldehído; (2) permeabilización con detergente o metanol (MeOH); (3) rehidratación a través de una serie graduada de soluciones MeOH (cultivos AE solamente); (4) detección; (5) amplificación utilizando la tecnología HCR para detectar el ARN del SARS-CoV-2; (6) immunostaining; y (7) proyección de imagen debajo de un microscopio confocal.

Protocolo

1. Preparación del tampón

1. Para 500 mL de tampón 2x PHEM, combine 18,14 g de piperazina-N,N′-bis(ácido 2-etanosulfónico) (PIPES), 6,5 g de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina etanesulfónico (HEPES), 3,8 g de ácido tetraacético de etilenglicol (EGTA) y 0,99 g de sulfato de magnesio (MgSO_4). Haga el volumen hasta ~ 400 mL con agua destilada (dH₂O), revuelva y ajuste el pH a 7.0 usando hidróxido de potasio (KOH) de 10 M o hidróxido de sodio (NaOH). Haga el volumen final hasta 500 mL, y luego divida en alícuotas de 50 mL. Conservar a -20 °C hasta que sea necesario.
   Nota : el búfer no estará claro hasta que el pH alcanza 7.0.
2. Prepare una solución común de paraformadehído al 37% p/v (PFA). Para 50 mL, mezclar 18,5 g de PFA y 35 mL de dH₂O en una botella de vidrio. Coloque la botella en un agitador magnético con calefacción. Añadir 900 μL de 1 M KOH o NaOH, y remover hasta que la solución quede clara. Dejar enfriar y transferir a un tubo de centrífuga cónica de 50 mL; hasta 50 mL con dH₂O. La solución se puede almacenar a -20 °C hasta que sea necesario.
   NOTA: El formaldehído debe manipularse con una capucha de humos mientras se usan guantes protectores y una bata de laboratorio.
3. Prepare el almacenador intermediario de la fijación (3,7% PFA almacenado en búfer con PHEM). Para 50 mL, combine 5 mL de solución de PFA al 37%, 25 mL de tampón PHEM 2x y 20 mL de dH₂O en un tubo de centrífuga cónica de 50 mL. Conservar a -20 °C hasta que sea necesario.
   NOTA: Después de la descongelación, el tampón se puede almacenar a 4 °C durante un hasta 3 meses.
4. Preparar PBST (0,1% Tween-20 en 1x solución salina tamponada con fosfato [PBS]). Para 50 mL, añadir 50 μL de 100% Tween-20 a 50 mL de 1x PBS y mezclar bien.
   NOTA: La solución se puede almacenar a temperatura ambiente (RT).
5. Preparar tampones de rehidratación combinando MeOH/PBST en proporciones de 3:1, 1:1 y 1:3 (volumen final de 100 mL de cada uno; ver Tabla 1).
   NOTA: MeOH es muy tóxico e inflamable. Como puede dañar el nervio óptico, debe manipularse en una campana extractora evitando cualquier llama abierta. Como mezclar MeOH y PBST genera una reacción exotérmica, combine las soluciones en hielo.
6. Para 1000 mL de 20x SSC, combine 175.3 g de cloruro de sodio (NaCl) y 88.2 g de citrato de sodio en un beaker, y llene con 800 mL de dH₂O. Revuelva hasta que se disuelva, y ajuste el pH a 7.2 usando NaOH. Agregue dH₂O a un volumen total de 1000 mL, y autoclave o filtre a través de un filtro de 0.22 μm en una botella en autoclave.
7. Para 50 mL de 5x SSCT, combine 12,5 mL de tampón SSC 20x con 37,5 mL de dH₂O, y agregue 50 μL de Tween-20 100%. Mezclar bien.
8. Para 50 mL de 50% 5x SSCT/50% PBST, combine 25 mL de 5x SSCT con 25 mL de PBST.
9. Para 50 mL de 2x SSC, combine 5 mL de 10x buffer SSC con 45 mL de dH₂O. Mezclar bien.
   Nota : todos los búferes SSC deben almacenarse en RT en la oscuridad.

2. Definición de objetivo, sondas y amplificadores

1. Utilice las herramientas disponibles en el sitio web del fabricante para diseñar amplificadores y sondas. Asegúrese de que las sondas sean complementarias a la cadena de ADN inversa del gen SARS-CoV-2 N (Figura suplementaria 1).
2. Determine el mejor tamaño del conjunto de sondeos (un conjunto de 20 sondeos es suficiente para la visualización).
3. Establezca los amplificadores utilizados para la detección de ARN objetivo.
   1. Utilice el amplificador HCR B1 etiquetado con Alexa Fluor 647.
      NOTA: Un amplificador HCR comprende horquillas HCR metaestables h1 y h2. Los experimentos multiplexados se pueden diseñar usando este protocolo. Si esto está planeado, elija un amplificador HCR diferente (B1, B2, ...) para cada ARN objetivo que se va a fotor dentro de la misma muestra (por ejemplo, amplificador B1 para el objetivo 1, amplificador B2 para el objetivo 2, ...).

3. Cultivo celular e infección por SARS-CoV-2

1. Cultivo de células Vero (células epiteliales de riñón de mono) en el medio eagle modificado de Dulbecco que contiene 5% de suero bovino fetal.
   1. Sembrar 50.000 células en cubrebocas (No. 1, 15 × 15 mm) en una placa de 12 pozos.
2. Preparar cultivos de AME totalmente diferenciados como se describe¹⁸ en soportes de inserto Transwell permeables con una membrana (diámetro = 6,5 mm) y cultivo en medio de crecimiento epitelial bronquial hasta que sea completamente confluente.
3. Infección por el virus
   1. Inocular las células con SARS-CoV-2 a 1000x dosis infeccioso mediana de cultivo tisular (TCID₅₀₎por mL
   2. Incubar las células durante 2 h a 37 °C.
   3. Lave las células dos veces con PBS para eliminar el virus no unidos.
   4. Células de cultivo para 48 h.

4. SARS-CoV-2 ARN-FISH en células Vero cultivadas en cubrebocas

DÍA 1

1. Fijación y permeabilización de células
   1. Fije las células infectadas con la solución de PFA del 3.7% w/v por 1 h en el RT.
   2. Aspire la solución de PFA al 3,7% y lave las células dos veces usando 1x PBS.
   3. Permeabilizar las células con solución de PBST durante 10 min a RT con agitación.
   4. Aspirar el PBST, y lavar las células dos veces con 1x PBS.
2. detección
   1. Aspire la solución de PBS 1x y lave las células dos veces con 2x SSC en RT.
   2. Aspirar la solución 2x SSC y prehibridizar las muestras añadiendo al menos 300 μL de tampón de hibridación de sonda. Cubra los pozos que contienen las células e incube a 37 °C durante 30 min.
   3. Prepare la solución de la sonda añadiendo 1,2 pmol de mezcla de sonda al tampón de hibridación de la sonda.
      1. Utilice 1,2 μL de la culata de sonda de 1 μM para preparar 300 μL de material de trabajo.
   4. Retire la solución de prehbridización y transfiera las tapas a una cámara humidificada.
      1. Pipetee 30-50 μL de solución de sonda en parafilm para formar gotitas individuales.
   5. Incubar las muestras durante la noche (12-18 h) a 37 °C.
      
      DÍA 2
   6. Transfiera las tapas de nuevo a una placa de 12 pozos y elimine el exceso de solución de la sonda lavándose durante 4 x 5 min con 400 μL de tampón de lavado de la sonda a 37 °C.
      NOTA: Como alternativa a la colocación de alícuotas de 30-50 μl en parafilm y debajo de las cubiertas para la incubación, agregue 300 μL de solución de sonda directamente a los cubrebocas en una placa de 12 pozos. Este procedimiento es más simple, pero requiere cantidades sustanciales de reactivos. Caliente el tampón de lavado de la sonda a 37 °C antes de usarlo. Calcule la cantidad de tampón necesario y transfiéralo a un tubo de centrífuga cónica de 15 mL.
   7. Lave las muestras durante 2 x 5 min con 5x SSCT en RT.
   8. Substituya la solución 5x SSCT por 1x PBS y almacene las muestras a 4 °C hasta la amplificación.
3. amplificación
   1. Retire la solución de PBS 1x de los pozos y agregue al menos 300 μL de tampón de amplificación a cada pozo. Incubar las muestras durante 30 min en RT.
   2. Prepare cada horquilla HCR (h1 y h2) enfriando a presión el volumen deseado en tubos separados.
      1. Para preparar 300 μL de solución de amplificación, use 18 pmol de cada horquilla (por ejemplo, para 300 μL, use 6 μL de una solución de horquilla común de 3 μM).
      2. Transfiera la solución de horquilla en tubos.
      3. Incubar a 95 °C durante 90 s.
      4. Enfriar a RT durante 30 min en la oscuridad.
   3. Prepare una mezcla de horquilla agregando las horquillas "h1" y "h2" enfriadas a presión al tampón de amplificación.
   4. Coloque gotas de 30-50 μL de mezcla de horquilla en parafilm.
   5. Incubar las muestras durante la noche (12-18 h) en la oscuridad en RT.
      
      DÍA 3
   6. Transfiera las cubiertas de nuevo a la placa de 12 pozos y elimine el exceso de horquillas lavando durante 5 x 5 min con 5x SSCT en RT con agitación.
   7. Aspire el buffer 5x SSCT, y substituyalo por 1x PBS.
      NOTA: Si es necesario, utilice las muestras de ARN-FISH en un ensayo de inmunofluorescencia estándar, seguido de tinción de núcleos (consulte la sección 5).
4. Tinción nuclear y montaje portaobjetos
   1. Aspirar la solución de PBS 1x, y reemplazarla con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 0.2 μg/mL) en 1x solución de PBS.
   2. Incubar las muestras durante 10 min en RT en la oscuridad.
   3. Aspire la solución DAPI y lave las células dos veces con 1x PBS.
   4. Colocar dos gotas de 10 μL cada una del medio de montaje; asegúrese de que las gotas estén lo suficientemente separadas como para permitir que se coloquen dos cubrebocas en una sola diapositiva.
   5. Retire el exceso de líquido tocando los cubrebocas en una toalla limpia, y luego colóquelos en el medio de montaje antifade con las celdas hacia abajo.
   6. Coloque las muestras montadas en una superficie seca y plana en la oscuridad y deje que se curen.
   7. Después del curado, selle los bordes de las cubiertas con sellador VALAP o esmalte de uñas para evitar que las muestras se sequen.

5. SARS-CoV-2 ARN-FISH en cultivos de AE

DÍA 1

1. Fijación y permeabilización del cultivo de AME
   1. Aspirar el medio, y fijar las células infectadas usando la solución de PFA del 3.7% por 1 h en el RT.
   2. Aspire la solución de PFA al 3,7% y lave las células dos veces con 1x PBS.
      1. Substituya la solución de PFA al 3,7% por 1x PBS debajo de un inserto Transwell.
   3. Deseche el PBS y deshidrate las muestras utilizando lavados de 2 x 5 min con 100% MeOH prechilled a -20 °C.
   4. Después del segundo lavado, reemplace el tampón con MeOH fresco y refrigerado para la permeabilización debajo del inserto Transwell. Conservar durante la noche a -20 °C.

DÍA 2

2. rehidratación
   Rehidrate las muestras a través de una serie graduada de soluciones MeOH/PBST (cada una durante 5 min) en hielo: 75% MeOH/25% PBST, 50% MeOH/50% PBST, 25% MeOH/75% PBTS y 100% PBST (dos veces).
   1. Lave las células durante 5 minutos sobre hielo con 50% 5x SSCT/50% PBST.
   2. Lave las células durante 5 minutos en hielo con 5x SSCT.
   3. Substituya el buffer 5x SSCT por 1x PBS.
3. detección
   1. Incubar las células (dentro del inserto Transwell) durante 5 min en hielo con 100 μL de tampón de hibridación de sonda. A continuación, transfiera la placa a la incubadora durante 30 min a 37 °C (prehbridización).
      NOTA: El tampón de hibridación de la sonda debe precalentarse a 37 °C antes de su uso. Calcule el volumen requerido: se necesitan 100 μL para un solo inserto Transwell.
   2. Prepare la solución de sondeo. Como 1 mL de solución de sonda requiere 4 pmol de sonda, agregue 4 μL de solución de culata de sonda de 1 μM a 1 mL de tampón de hibridación de sonda y mezcle bien.
      NOTA: Para la detección de ARN, utilice 100 μL de solución de sonda por inserto Transwell. Deje la solución de la sonda en el hielo hasta el final de la etapa de prehbridización.
   3. Quite la solución de prehbridización y agregue la solución de sondeo.
   4. Incubar las células durante la noche (12-18 h) a 37 °C.
      
      DÍA 3
   5. Retire el exceso de sonda lavando durante 4 x 15 min con 100 μL de tampón de lavado de sonda a 37 °C.
   6. Lave las muestras durante 2 x 5 min con 5x SSCT en RT.
   7. Substituya el 5x SSCT por 1x PBS y almacene las muestras a 4 °C hasta la amplificación.
4. amplificación
   1. Preamplificar las muestras incubando con tampón de amplificación durante 30 min en RT.
   2. Prepare cada horquilla enfriando a presión los volúmenes deseados en tubos separados.
      1. Para preparar 500 μL de solución de amplificación, use 30 pmol de cada horquilla (por ejemplo, para 500 μL, use 10 μL de solución de horquilla común de 3 μM).
      2. Transfiera la solución de horquilla a los tubos.
      3. Incubar a 95 °C durante 90 s.
      4. Enfriar a RT durante 30 min en la oscuridad.
   3. Prepare la solución de horquilla agregando todas las horquillas enfriadas a presión a 500 μL de tampón de amplificación en RT.
   4. Retire la solución de preamplificación y agregue la solución completa de horquilla.
   5. Incubar las muestras durante la noche (12-18 h) en RT en la oscuridad.
   6. Retire el exceso de horquillas lavando con 5x SSCT en RT de la siguiente manera: 2 x 5 min, 2 x 15 min y 1 x 5 min.
   7. Substituya la solución 5x SSCT por 1x PBS, y guárdela a 4 °C durante no más de 2-3 días o proceda directamente a la tinción nuclear.
      NOTA: Si es necesario, utilice las muestras de ARN-FISH en un ensayo de inmunofluorescencia estándar, seguido de tinción nuclear (consulte la sección 6).
5. Tinción nuclear y montaje portaobjetos
   1. Aspire la solución de PBS 1x y reemplácela por una solución DAPI (0,2 μg/mL) en 1x PBS.
   2. Incubar las muestras durante 10 min en RT en la oscuridad.
   3. Aspire la solución DAPI y lave las células dos veces con 1x PBS.
   4. Coloque la membrana de corte de las inserciones Transwell en 10 μL de medio de montaje antifado con las células hacia arriba, y agregue un medio de montaje adicional (5 μL) a la membrana.
   5. Cubra las membranas con cubrebocas.
   6. Cure las muestras montadas en una superficie seca y plana en la oscuridad.
   7. Después del curado, selle los bordes de las cubiertas con sellador VALAP o esmalte de uñas para evitar que las muestras se sequen.

6. Análisis de inmunofluorescencia de células Vero y cultivos de AHA

NOTA: Realice el análisis de inmunofluorescencia el día 3 para las líneas celulares o el día 4 para los cultivos de AE. Utilice un enfoque diferente para cada modelo. Todas las diferencias se indican claramente.

1. Aspirar la solución de PBS 1x de los pozos.
2. Bloquear las muestras por incubación con albúmina sérica bovina al 1% p/v en solución de PBST durante 30 min a 37 °C.
3. Prepare los anticuerpos primarios preparando diluciones apropiadas en la solución de bloqueo, e incube.
   1. Para las celdas de Vero en los cubrebocas:
      1. Coloque gotas (30-50 μL) de solución de anticuerpos en parafilm en una cámara de humedad.
      2. Coloque los cubrebocas sobre las gotas de anticuerpos con las células hacia abajo.
   2. Para el AE, substituya el agente bloqueador en los insertos con una solución de anticuerpos (100 μL) e incube las muestras en una cámara humidificada.
      NOTA: Ajuste el tiempo y la temperatura de cada incubación con anticuerpos primarios. Los parámetros típicos son 2 h a RT o durante la noche a 4 °C.
4. Lavar las muestras durante 3 x 5 min con PBST.
   1. Para las células en los cubrebocas, transferir a una placa de 12 pozos y añadir solución de PBST.
   2. Para los cultivos de AE, reemplace la solución de anticuerpos con una solución de PBST.
5. Compruebe las fuentes de luz y los filtros disponibles para el microscopio confocal.
6. Elija anticuerpos secundarios según la especie huésped. Elija los parámetros del fluoróforo (longitudes de onda de excitación y emisión, ancho de espectro y eficiencia de excitación de acuerdo con la fuente de luz disponible).
   NOTA: Los parámetros espectrales se pueden modelar utilizando herramientas en línea (consulte Tabla de materiales).
7. Prepare soluciones de anticuerpos secundarios apropiadas diluyéndolas con una solución de bloqueo.
8. Incubar con anticuerpos secundarios (como en 6.3), pero incubar durante 1 h a 37 °C.
9. Lave las muestras como en el paso 6.4.
10. Tinción nuclear y montaje portaobjetos
    1. Para celdas en coverslips
       1. Aspirar el PBST y sustituirlo por DAPI (0,2 μg/mL) en 1x solución de PBS.
       2. Incubar las muestras durante 10 min en RT en la oscuridad.
       3. Aspire la solución DAPI y lave las células dos veces con 1x PBS.
       4. Coloque los cubrebocas sobre gotas de 10 μL de medio de montaje con las celdas hacia abajo.
       5. Selle las tapas con esmalte de uñas.
    2. Para cultivos hae
       1. Aspirar el PBST 1x y sustituirlo por DAPI (0,2 μg/mL) en solución de PBS 1x.
       2. Incubar las muestras durante 10 min en RT en la oscuridad.
       3. Aspire la solución DAPI y lave las células dos veces con 1x PBS.
       4. Coloque las membranas de corte sobre gotas de 10 μL de medio de montaje con las células hacia arriba, y agregue un medio de montaje adicional (5 μL) a la membrana.
       5. Cubra las membranas con cubrebocas.
       6. Selle las tapas con esmalte de uñas.

7. Microscopía confocal

1. Defina las pistas especificando los fluoróforos utilizados.
2. Elija el modo de escaneo y la velocidad.
3. Ajuste los valores de potencia, ganancia y desplazamiento del láser para cada fluoróforo comparándolos con los respectivos controles negativos: para virus, células infectadas por simulacros; para las proteínas celulares, muestras teñidas con anticuerpos de control de isotipo de un huésped apropiado.
4. Para adquirir una imagen 3D, active el modo z-stack y establezca los límites superior e inferior. Establezca el tamaño/número del paso.
   NOTA: Para obtener más detalles sobre las imágenes de coronavirus, consulte¹⁹.

Resultados

El protocolo inmuno-ARN-FISH descrito en este manuscrito se llevó a cabo utilizando dos sistemas celulares: una línea celular Vero y un cultivo de AICH 3D. Los pasos principales para ambos modelos celulares se muestran en la Tabla 2. El protocolo RNA-FISH para la visualización del SARS-CoV-2 en cultivos de AHAE incluye pasos típicos para muestras de tejido, es decir, permeabilización con MeOH al 100% y rehidratación a través de una serie graduada de soluciones meOH...

Discusión

Immuno-RNA-FISH es un método confiable para la doble-coloración del ARN y de las proteínas celulares. Aquí, se ha descrito un protocolo modificado de inmuno-ARN-FISH que permite la detección de ARN sars-CoV-2 y proteínas celulares en líneas celulares y cultivos de AE. Este protocolo se puede adaptar para su uso en diferentes modelos celulares, incluyendo monocapas celulares o tejidos específicos. El método se basa en el concepto de un HCR iniciado por la localización apropiada de la sonda. A continuación, el u...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Confocal Microscope LSM 880	ZEISS
Grant Bio, Mini Rocker- Shaker	Fisher Scientific	12965501
Incubator Galaxy170R	New Brunswick	CO170R-230-1000
Thermomixer Comfort	Eppendorf	5355 000 011
Materials
15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips	LabSolute	7695022
1.5 mL tubes	FL-MEDICAL	5.350.023.053
12-well plate	TTP	92412
Conical centrifuge tube	Sarstedt	5.332.547.254
parafilm	Sigma	P7793-1EA
serological pipets	VWR Collection	612-5523P, 612-5827P
slide glass	PTH CHEMLAND	04-296.202.03
Transwell ThinCerts	Grainer bio-one	665641
Reagents
Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies	Invitrogen
β5-tubulin	Santa Cruz Biotechnology	sc-134234
DAPI	Thermo Scientific	D1306
Disodium phosphate	Sigma	S51136-500G
EGTA	BioShop	EGT101.25
HCR Amplification Buffer	Molecular Instruments, Inc.	BAM01522	Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information
HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647	Molecular Instruments, Inc.	S013922
HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647	Molecular Instruments, Inc.	S012522
HCR Probe Hybridization Buffer	Molecular Instruments, Inc.	BPH03821	Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information
HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid	Molecular Instruments, Inc.	PRE134
HCR Probe Wash Buffer	Molecular Instruments, Inc.	BPW01522	Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information
HEPES	BioShop	HEP001.100
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma	63138-250G
Methanol	Sigma	32213-1L-M
Monopotassium phosphate	Sigma	P5655-100G
Paraformaldehyde	Sigma	P6148-1KG
PIPES	BioShop	PIP666.100
Potassium Chloride	Sigma	P5405-250G
Prolong Diamond Antifade Mounting Medium	Invitrogen	P36970
Sodium Chloride	BioShop	SOD001.5
Trisodium Citrate 2-hydrate	POCH	6132-04-3
Tween-20	BioShop	TWN580.500
	Software
Fluorescence Spectraviewer			Modeling spectral parameters
ImageJ Fiji			Acquiring and processing z-stack images