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Résumé

Ici, nous décrivons une méthode simple qui combine l’hybridation in situ de fluorescence d’ARN (ARN-POISSON) avec l’immunofluorescence pour visualiser l’ARN du coronavirus 2 (SARS-CoV-2) du syndrome respiratoire aigu sévère. Ce protocole peut améliorer la compréhension des caractéristiques moléculaires des interactions ARN-hôte du SARS-CoV-2 au niveau unicellulaire.

Résumé

Ce manuscrit fournit un protocole pour l’hybridation in situ de la réaction en chaîne (HCR) couplée à l’immunofluorescence pour visualiser l’ARN du coronavirus 2 (SARS-CoV-2) du syndrome respiratoire aigu sévère dans la lignée cellulaire et les cultures tridimensionnelles (3D) de l’épithélium des voies respiratoires humaines. La méthode permet une visualisation très spécifique et sensible de l’ARN viral en s’appuyant sur HCR initié par la localisation de sonde. Les sondes à initiateurs fendus aident à amplifier le signal par des amplificateurs marqués par fluorescence fluorescente, ce qui entraîne une fluorescence de fond négligeable en microscopie confocale. Le étiquetage des amplificateurs avec différents colorants fluorescents facilite la reconnaissance simultanée de diverses cibles. Ceci, à son tour, permet la cartographie de l’infection dans les tissus pour mieux comprendre la pathogenèse virale et la réplication au niveau unicellulaire. Le couplage de cette méthode avec l’immunofluorescence peut faciliter une meilleure compréhension des interactions hôte-virus, y compris l’alternance de l’épigénome de l’hôte et des voies de réponse immunitaire. Grâce à une technologie HCR sensible et spécifique, ce protocole peut également être utilisé comme outil de diagnostic. Il est également important de se rappeler que la technique peut être modifiée facilement pour permettre la détection de tout ARN, y compris les ARN non codants et les virus à ARN qui pourraient émerger à l’avenir.

Introduction

Le SARS-CoV-2 est un nouveau bêtacoronavirus humain apparu fin 2019, provoquant une pandémie sans précédent quelques mois plus tard. Parce que le virus est nouveau pour la science, une grande partie de sa biologie et de son impact sur les cellules hôtes restent inconnus. Par conséquent, la cartographie du tropisme des cellules virales et des tissus pendant l’infection est importante si l’on veut comprendre ses caractéristiques biologiques de base et ses effets sur l’hôte. Plusieurs techniques sont utilisées pour examiner l’interaction virus-hôte, y compris les essais biochimiques, biologiques et physiques. L’hybridation in situ est une méthode courante qui utilise des sondes d’ADN, d’ARN ou d’acides nucléiques modifiés complémentaires marqués, qui se localisent à des séquences d’ADN ou d’ARN spécifiques dans une cellule ou un tissu.

Une nouvelle méthode d’hybridation in situ fluorescente de l’ARN (ARN-FISH) a été développée qui intègre des modifications pour augmenter la sensibilité en amplifiant le rapport signal/bruit via un HCR1. HCR permet l’étude de la localisation de l’ARN au niveau unicellulaire. En raison de sa grande spécificité, sensibilité et résolution, cette méthode est utile non seulement pour les études scientifiques fondamentales, mais aussi pour les projets applicatifs, par exemple, le diagnostic. Récemment, la faisabilité de cette méthode a été démontrée pour détecter l’ARN du SARS-CoV-2 localisé sur des cellules ciliées dans des cultures 3D entièrement différenciées de l’épithélium des voies respiratoires humaines (AH)2. Les cultures d’AHH constituent l’un des outils les plus avancés utilisés pour étudier l’infection virale dans le contexte du microenvironnement « infection naturelle »3,4.

Plusieurs rapports sur les coronavirus humains (HCoV), y compris le SARS-CoV-2, soulignent l’importance des modifications épigénétiques en ce qui concerne l’infection à HCoV et la physiopathologie [examinés en 5],par exemple, le modèle de méthylation du gène codant pour le récepteur 6 de l’enzyme de conversion de l’angiotensine2 (ACE-2) 6,7. Fait intéressant, le criblage par spectrométrie de masse a identifié plusieurs facteurs épigénétiques qui interagissent avec le protéome du SARS-CoV-28. Plus précisément, la protéine non structurale 5 (NSP5) se lie au régulateur épigénétique, l’histone désacétylase 2, et la NSP5 catalytiquement inactive (C145A) interagit avec l’ARNt méthyltransférase 1 (24). De plus, l’activité de la méthyltransférase NSP16 est bloquée par l’inhibiteur de la méthyltransférase, la sinefungine9. Cependant, le rôle exact de ces facteurs épigénétiques dans la COVID-19 reste incertain. La réplication du HCoV a lieu dans le cytoplasme de la cellule infectée et déclenche des réponses inflammatoires régulées par des modifications épigénétiques10.

Par exemple, HCoV-229E affine la signalisation du facteur nucléaire-kappa B et reprogramme profondément le paysage de la chromatine cellulaire hôte en augmentant l’acétylation de H3K36 et H4K5 dans certaines régions11. L’infection à coronavirus liée au syndrome respiratoire du Moyen-Orient augmente les niveaux de H3K27me3 et épuise H3K4me3 dans les régions promotrices de sous-ensembles de gènes spécifiques sensibles à l’interféron12. De plus, l’ARN viral déclenche des réponses immunitaires cellulaires, comme démontré pour les flavivirus13,les rétrovirus14,15et les coronavirus16. Les marqueurs épigénétiques sur l’ARN viral peuvent jouer un rôle dans la reconnaissance par les capteurs cellulaires, comme le montre la méthylation m7A de l’ARN 17 du virus de l’immunodéficiencehumaine-1. Cependant, des questions demeurent : quel est l’impact de l’ARN du SARS-CoV-2 sur la réponse immunitaire, et les marques épigénétiques sont-elles impliquées ?

Ici, une méthode RNA-FISH optimisée couplée à l’analyse d’immunofluorescence des lignées cellulaires et des tissus 3D (AHS entièrement différencié) a été décrite. Bien que les méthodes cytologiques, telles que FISH et l’immunofluorescence, soient largement utilisées, cette méthode d’hybridation in situ de nouvelle génération basée sur HCR n’a jamais été utilisée pour la détection de virus (sauf dans une publication récente)2. En général, l’immunomarquage et le FISH nécessitent les étapes suivantes: perméabilisation pour permettre la pénétration de sondes ou d’anticorps; fixation dans laquelle le matériel cellulaire est fixé et préservé; détection dans laquelle des anticorps ou des sondes d’acides nucléiques sont appliqués; et enfin, le montage des échantillons pour la visualisation.

Bien que les protocoles existants partagent ces caractéristiques générales, ils varient considérablement en ce qui concerne les paramètres impliqués. Ici, un protocole immuno-ARN-FISH optimisé et simple a été décrit pour détecter l’ARN du SARS-CoV-2 dans les cultures d’AH et les cellules Vero. La technique comprend les étapes suivantes : (1) fixation des cellules avec du paraformaldéhyde ; 2° perméabilisation au détergent ou au méthanol (MeOH); (3) réhydratation par une série graduée de solutions de MeOH (cultures d’AOH seulement); 4° la détection; (5) amplification à l’aide de la technologie HCR pour détecter l’ARN du SARS-CoV-2; (6) immunomarquage ; et (7) imagerie sous un microscope confocal.

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Protocole

1. Préparation de la mémoire tampon

  1. Pour 500 mL de tampon 2x PHEM, combiner 18,14 g d’acide pipériazine-N,N′-bis(2-éthanesulfonique) (PIPES), 6,5 g d’acide éthanesulfonique (HEPES) de 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine, 3,8 g d’acide tétraacétique d’éthylène glycol (EGTA) et 0,99 g de sulfate de magnésium(MgSO4). Porter le volume jusqu’à ~400 mL avec de l’eau distillée (dH2O), remuer et ajuster le pH à 7,0 en utilisant de l’hydroxyde de potassium 10 M (KOH) ou de l’hydroxyde de sodium (NaOH). Faire le volume final jusqu’à 500 mL, puis diviser en aliquotes de 50 mL. Conserver à -20 °C jusqu’à ce que nécessaire.
    Remarque : la mémoire tampon ne sera pas claire jusqu’à ce que le pH atteint 7,0.
  2. Préparer une solution mère de 37 % p/v de paraformaldéhyde (PFA). Pendant 50 mL, mélanger 18,5 g de PFA et 35 mL dedH2O dans une bouteille en verre. Placez la bouteille sur un agitateur magnétique avec chauffage. Ajouter 900 μL de 1 M KOH ou NaOH et agiter jusqu’à ce que la solution devienne claire. Laisser refroidir et transférer dans un tube de centrifugation conique de 50 mL; compléter jusqu’à 50 mL avec dH2O. La solution peut être conservée à -20 °C jusqu’à ce que cela soit nécessaire.
    NOTA : Le formaldéhyde doit être manipulé dans une hotte tout en portant des gants de protection et un sarrau de laboratoire.
  3. Préparer le tampon de fixation (3,7% PFA tamponné avec PHEM). Pour 50 mL, combiner 5 mL de solution de PFA à 37 %, 25 mL de tampon PHEM 2x et 20 mL dedH2O dans un tube de centrifugation conique de 50 mL. Conserver à -20 °C jusqu’à ce que nécessaire.
    REMARQUE: Après la décongélation, le tampon peut être conservé à 4 ° C jusqu’à 3 mois.
  4. Préparer le PBST (0,1 % tween-20 dans 1 fois la solution saline tamponnée au phosphate [PBS]). Pour 50 mL, ajouter 50 μL de Tween-20 à 100 % à 50 mL de PBS 1x et bien mélanger.
    REMARQUE: La solution peut être stockée à température ambiante (RT).
  5. Préparer les tampons de réhydratation en combinant MeOH/PBST dans des rapports de 3:1, 1:1 et 1:3 (volume final de 100 mL de chacun; voir tableau 1).
    REMARQUE: MeOH est très toxique et inflammable. Comme il peut endommager le nerf optique, il doit être manipulé dans une hotte en évitant toute flamme nue. Comme le mélange de MeOH et de PBST génère une réaction exothermique, combiner les solutions sur la glace.
  6. Pour 1000 mL de 20x SSC, mélanger 175,3 g de chlorure de sodium (NaCl) et 88,2 g de citrate de sodium dans un bécher, et remplir avec 800 mL de dH2O. Agiter jusqu’à dissolution, et ajuster le pH à 7,2 en utilisant NaOH. Ajouter dH2O à un volume total de 1000 mL, et autoclaver ou filtrer à travers un filtre de 0,22 μm dans une bouteille autoclavée.
  7. Pour 50 mL de 5x SSCT, combiner 12,5 mL de tampon SSC 20x avec 37,5 mL de dH2O, et ajouter 50 μL de Tween-20 à 100 %. Bien mélanger.
  8. Pour 50 mL de 50 % de SSCT 5x/PBST à 50 %, combiner 25 mL de 5x SSCT avec 25 mL de PBST.
  9. Pour 50 mL de 2x SSC, combiner 5 mL de tampon SSC 10x avec 45 mL dedH2O. Bien mélanger.
    REMARQUE : Tous les tampons SSC doivent être stockés à RT dans l’obscurité.

2. Définition de la cible, sondes et amplificateurs

  1. Utilisez les outils disponibles sur le site Web du fabricant pour concevoir des amplificateurs et des sondes. S’assurer que les sondes sont complémentaires au brin d’ADN inverse du gène N du SARS-CoV-2(figure supplémentaire 1).
  2. Déterminez la meilleure taille d’ensemble de sondes (un ensemble de 20 sondes est suffisant pour la visualisation).
  3. Réglez les amplificateurs utilisés pour la détection de l’ARN cible.
    1. Utilisez l’amplificateur HCR B1 étiqueté avec Alexa Fluor 647.
      REMARQUE: Un amplificateur HCR comprend des épingles à cheveux HCR métastables h1 et h2. Les expériences multiplexées peuvent être conçues à l’aide de ce protocole. Si cela est prévu, choisissez un amplificateur HCR différent (B1, B2, ...) pour chaque ARN cible à imager dans le même échantillon (par exemple, amplificateur B1 pour la cible 1, amplificateur B2 pour la cible 2, ...).

3. Culture cellulaire et infection par le SARS-CoV-2

  1. Culture de cellules Vero (cellules épithéliales du rein de singe) dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco contenant 5% de sérum fœtal bovin.
    1. Ensemencez 50 000 cellules sur des lamelle (no 1, 15 × 15 mm) dans une plaque de 12 puits.
  2. Préparer des cultures d’AHH entièrement différenciées comme décrit18 sur des supports d’insertion Transwell perméables avec une membrane (diamètre = 6,5 mm) et une culture dans un milieu de croissance épithélial bronchique jusqu’à ce qu’il soit entièrement confluent.
  3. Infection virale
    1. Inoculer des cellules atteintes du SARS-CoV-2 à une dose infectieuse de culture tissulaire médiane (TCID50)par ml
    2. Incuber les cellules pendant 2 h à 37 °C.
    3. Laver les cellules deux fois avec du PBS pour éliminer le virus non lié.
    4. Cellules de culture pendant 48 h.

4. ARN-POISSON du SARS-CoV-2 dans des cellules Vero cultivées sur des lamelles

JOUR 1

  1. Fixation et perméabilisation des cellules
    1. Fixer les cellules infectées avec 3,7% p / v solution PFA pendant 1 h à RT.
    2. Aspirez la solution de PFA à 3,7% et lavez les cellules deux fois à l’aide de 1x PBS.
    3. Perméabiliser les cellules avec la solution de PBST pendant 10 min à droite avec agitation.
    4. Aspirez le PBST et lavez les cellules deux fois avec 1x PBS.
  2. détection
    1. Aspirez la solution pbs 1x et lavez les cellules deux fois avec 2x SSC à DROITE.
    2. Aspirer la solution 2x SSC et préhybridiser les échantillons en ajoutant au moins 300 μL de tampon d’hybridation de sonde. Couvrir les puits contenant les cellules et incuber à 37 °C pendant 30 min.
    3. Préparer la solution de sonde en ajoutant 1,2 pmol de mélange de sonde au tampon d’hybridation de la sonde.
      1. Utiliser 1,2 μL du stock de sonde de 1 μM pour préparer 300 μL de stock de travail.
    4. Retirez la solution de préhybridisation et transférez les lamaux de couverture dans une chambre humidifiée.
      1. Pipetter 30-50 μL de solution de sonde sur parafilm pour former des gouttelettes individuelles.
    5. Incuber les échantillons pendant la nuit (12-18 h) à 37 °C.

      JOUR 2
    6. Relévérer les lamèdes dans une plaque de 12 puits et éliminer l’excès de solution de sonde en lavant pendant 4 x 5 min avec 400 μL de tampon de lavage de sonde à 37 °C.
      NOTA : Comme solution de rechange à la mise en place de 30 à 50 μl d’aliquotes sur le parafilm et sous des lamphes de couverture pour l’incubation, ajouter 300 μL de solution de sonde directement aux lamphes dans une plaque de 12 puits. Cette procédure est plus simple, mais nécessite des quantités substantielles de réactifs. Chauffer le tampon de lavage de la sonde à 37 °C avant utilisation. Calculez la quantité de tampon nécessaire et transférez-la dans un tube de centrifugation conique de 15 mL.
    7. Laver les échantillons pendant 2 x 5 min avec 5x SSCT à RT.
    8. Remplacer la solution 5x SSCT par 1x PBS et stocker les échantillons à 4 °C jusqu’à l’amplification.
  3. amplification
    1. Retirez la solution pbs 1x des puits et ajoutez au moins 300 μL de tampon d’amplification à chaque puits. Incuber les échantillons pendant 30 min à TA.
    2. Préparez chaque épingle à cheveux HCR (h1 et h2) en refroidissant le volume souhaité dans des tubes séparés.
      1. Pour préparer 300 μL de solution d’amplification, utilisez 18 pmol de chaque épingle à cheveux (p. ex., pour 300 μL, utilisez 6 μL d’une solution d’épingle à cheveux mère de 3 μM).
      2. Transférer la solution d’épingle à cheveux dans des tubes.
      3. Incuber à 95 °C pendant 90 s.
      4. Refroidir à RT pendant 30 min dans l’obscurité.
    3. Préparez un mélange d’épingle à cheveux en ajoutant les épingles à cheveux « h1 » et « h2 » refroidies par pression au tampon d’amplification.
    4. Placer des gouttes de 30-50 μL de mélange d’épingle à cheveux sur du parafilm.
    5. Incuber les échantillons pendant la nuit (12-18 h) dans l’obscurité à RT.

      JOUR 3
    6. Transférer les lamaux de couverture dans la plaque de 12 puits, et enlever l’excès d’épingles à cheveux en lavant pendant 5 x 5 min avec 5x SSCT à RT avec agitation.
    7. Aspirez la mémoire tampon SSCT 5x et remplacez-la par 1x PBS.
      NOTA : Au besoin, utiliser les échantillons d’ARN-FISH dans un essai d’immunofluorescence standard, suivi d’une coloration des noyaux (voir la section 5).
  4. Coloration nucléaire et montage sur glissière
    1. Aspirer la solution de PBS 1x et la remplacer par du 4′,6-diamidino-2-phénylélindole (DAPI, 0,2 μg/mL) dans une solution de PBS 1x.
    2. Incuber les échantillons pendant 10 min à TA dans l’obscurité.
    3. Aspirez la solution de DAPI et lavez les cellules deux fois avec 1x PBS.
    4. Placer deux gouttes de 10 μL chacune du milieu de montage; s’assurer que les gouttes sont suffisamment séparées pour permettre à deux lamelle de couverture d’être placées sur une seule lame.
    5. Retirez l’excès de liquide en tapant les lamaux sur une serviette propre, puis placez-les dans un support de montage antifade avec les cellules tournées vers le bas.
    6. Placez les échantillons montés sur une surface sèche et plane dans l’obscurité et laissez-les durcir.
    7. Après le durcissement, sceller les bords des lamelle avec du scellant VALAP ou du vernis à ongles pour empêcher les échantillons de se dessécher.

5. ARN-POISSON du SARS-CoV-2 dans les cultures d’AHH

JOUR 1

  1. Fixer et perméabiliser la culture de l’AH
    1. Aspirer le milieu et fixer les cellules infectées à l’aide d’une solution de PFA à 3,7% pendant 1 h à TA.
    2. Aspirer la solution de PFA à 3,7% et laver les cellules deux fois avec 1x PBS.
      1. Remplacez la solution PFA à 3,7 % par un PBS 1x sous un insert Transwell.
    3. Jeter le PBS et déshydrater les échantillons à l’aide de lavages de 2 x 5 min avec 100 % de MeOH préchilled à -20 °C.
    4. Après le deuxième lavage, remplacez le tampon par du MeOH frais et réfrigéré pour la perméabilisation sous l’insert Transwell. Conserver la nuit à -20 °C.

JOUR 2

  1. réhydratation
    Réhydrater les échantillons au moyen d’une série graduée de solutions MeOH/PBST (chacune pendant 5 min) sur la glace : 75 % MeOH/25 % PBST, 50 % MeOH/PBST 50 %, 25 % MeOH/PBTS 75 % et 100 % PBST (deux fois).
    1. Laver les cellules pendant 5 min sur de la glace avec 50% 5x SSCT / 50% PBST.
    2. Laver les cellules pendant 5 min sur glace avec 5x SSCT.
    3. Remplacez la mémoire tampon SSCT 5x par 1x PBS.
  2. détection
    1. Incuber les cellules (à l’intérieur de l’insert Transwell) pendant 5 min sur la glace avec 100 μL de tampon d’hybridation de sonde. Ensuite, transférer la plaque dans l’incubateur pendant 30 min à 37 °C (préhybridisation).
      NOTA : Le tampon d’hybridation de la sonde doit être préchauffé à 37 °C avant utilisation. Calculez le volume requis : 100 μL sont nécessaires pour un seul insert Transwell.
    2. Préparez la solution de sonde. Comme 1 mL de solution de sonde nécessite 4 pmol de sonde, ajoutez 4 μL de solution mère de sonde de 1 μM à 1 mL de tampon d’hybridation de sonde et mélangez bien.
      REMARQUE: Pour la détection de l’ARN, utilisez 100 μL de solution de sonde par insert Transwell. Laisser la solution de la sonde sur la glace jusqu’à la fin de l’étape de préhybridisation.
    3. Retirez la solution de préhybridisation et ajoutez la solution de sonde.
    4. Incuber les cellules pendant la nuit (12-18 h) à 37 °C.

      JOUR 3
    5. Retirer l’excès de sonde en lavant pendant 4 x 15 min avec 100 μL de tampon de lavage de sonde à 37 °C.
    6. Laver les échantillons pendant 2 x 5 min avec 5x SSCT à RT.
    7. Remplacez le SSCT 5x par un PBS 1x et stockez les échantillons à 4 °C jusqu’à l’amplification.
  3. amplification
    1. Préamplifier les échantillons en les incubant avec un tampon d’amplification pendant 30 min à TA.
    2. Préparez chaque épingle à cheveux en refroidissant les volumes souhaités dans des tubes séparés.
      1. Pour préparer 500 μL de solution d’amplification, utilisez 30 pmol de chaque épingle à cheveux (p. ex., pour 500 μL, utilisez 10 μL de solution d’épingle à cheveux mère de 3 μM).
      2. Transférer la solution d’épingle à cheveux dans les tubes.
      3. Incuber à 95 °C pendant 90 s.
      4. Refroidir à RT pendant 30 min dans l’obscurité.
    3. Préparez la solution d’épingle à cheveux en ajoutant toutes les épingles à cheveux refroidies par pression à 500 μL de tampon d’amplification à RT.
    4. Retirez la solution de préamplification et ajoutez la solution complète en épingle à cheveux.
    5. Incuber les échantillons pendant la nuit (12-18 h) à RT dans l’obscurité.
    6. Enlever l’excès d’épingles à cheveux en lavant avec 5x SSCT à RT comme suit: 2 x 5 min, 2 x 15 min et 1 x 5 min.
    7. Remplacez la solution 5x SSCT par 1x PBS et conservez-la à 4 °C pendant 2-3 jours au plus ou passez directement à la coloration nucléaire.
      NOTA : Au besoin, utiliser les échantillons d’ARN-FISH dans un essai d’immunofluorescence standard, suivi d’une coloration nucléaire (voir la section 6).
  4. Coloration nucléaire et montage sur glissière
    1. Aspirer la solution 1x PBS et la remplacer par une solution DAPI (0,2 μg/mL) dans 1x PBS.
    2. Incuber les échantillons pendant 10 min à TA dans l’obscurité.
    3. Aspirez la solution de DAPI et lavez les cellules deux fois avec 1x PBS.
    4. Placez la membrane découpée des inserts Transwell sur 10 μL de milieu de montage antifade avec les cellules tournées vers le haut, et ajoutez un milieu de montage supplémentaire (5 μL) à la membrane.
    5. Couvrez les membranes avec des lamaux de couverture.
    6. Durcir les échantillons montés sur une surface sèche et plane dans l’obscurité.
    7. Après le durcissement, sceller les bords des lamelle avec du scellant VALAP ou du vernis à ongles pour empêcher les échantillons de se dessécher.

6. Analyse par immunofluorescence des cellules Vero et des cultures d’AHH

REMARQUE : Effectuez le test d’immunofluorescence le jour 3 pour les lignées cellulaires ou le jour 4 pour les cultures d’AHH. Utilisez une approche différente pour chaque modèle. Toutes les différences sont clairement indiquées.

  1. Aspirez la solution PBS 1x des puits.
  2. Bloquer les échantillons par incubation avec 1 % p/v d’albumine sérique bovine dans une solution de PBST pendant 30 min à 37 °C.
  3. Préparer les anticorps primaires en préparant les dilutions appropriées dans une solution bloquante et incuber.
    1. Pour les cellules Vero sur les lamelles:
      1. Placer des gouttes (30-50 μL) de solution d’anticorps sur du parafilm dans une chambre d’humidité.
      2. Placez des lamelle sur les gouttes d’anticorps avec les cellules vers le bas.
    2. Pour l’AH, remplacer l’agent bloquant dans les inserts par une solution d’anticorps (100 μL) et incuber les échantillons dans une chambre humidifiée.
      REMARQUE: Ajustez le temps et la température pour chaque incubation avec des anticorps primaires. Les paramètres typiques sont 2 h à TA ou une nuit à 4 °C.
  4. Laver les échantillons pendant 3 x 5 min avec du PBST.
    1. Pour les cellules sur des lamelle, transférer sur une plaque de 12 puits et ajouter une solution de PBST.
    2. Pour les cultures d’AHH, remplacer la solution d’anticorps par une solution de PBST.
  5. Vérifiez les sources lumineuses et les filtres disponibles pour le microscope confocal.
  6. Choisissez des anticorps secondaires en fonction de l’espèce hôte. Choisissez les paramètres des fluorophores (longueurs d’onde d’excitation et d’émission, largeur du spectre et efficacité d’excitation en fonction de la source lumineuse disponible).
    REMARQUE : Les paramètres spectraux peuvent être modélisés à l’aide d’outils en ligne (voir la table des matériaux).
  7. Préparer des solutions d’anticorps secondaires appropriées en les diluant avec une solution bloquante.
  8. Incuber avec des anticorps secondaires (comme au point 6.3), mais incuber pendant 1 h à 37 °C.
  9. Laver les échantillons comme à l’étape 6.4.
  10. Coloration nucléaire et montage sur glissière
    1. Pour les cellules sur les lamelle
      1. Aspirer le PBST et le remplacer par du DAPI (0,2 μg/mL) dans une solution 1x pbs.
      2. Incuber les échantillons pendant 10 min à TA dans l’obscurité.
      3. Aspirez la solution de DAPI et lavez les cellules deux fois avec 1x PBS.
      4. Placez les lamaux sur des gouttes de 10 μL de milieu de montage avec les cellules tournées vers le bas.
      5. Scellez les lamaux avec du vernis à ongles.
    2. Pour les cultures d’AHH
      1. Aspirer le PBST 1x et le remplacer par du DAPI (0,2 μg/mL) dans une solution 1x PBS.
      2. Incuber les échantillons pendant 10 min à TA dans l’obscurité.
      3. Aspirez la solution de DAPI et lavez les cellules deux fois avec 1x PBS.
      4. Placez les membranes découpées sur des gouttes de 10 μL de milieu de montage avec les cellules vers le haut, et ajoutez du milieu de montage supplémentaire (5 μL) à la membrane.
      5. Couvrez les membranes avec des lamaux de couverture.
      6. Scellez les lamaux avec du vernis à ongles.

7. Microscopie confocale

  1. Définissez les pistes en spécifiant les fluorophores utilisés.
  2. Choisissez le mode de numérisation et la vitesse.
  3. Ajustez la puissance laser, le gain et les valeurs de décalage pour chaque fluorophore en les comparant avec les contrôles négatifs respectifs: pour les cellules infectées par le virus, les cellules infectées par des simulacres; pour les protéines cellulaires, échantillons colorés avec des anticorps de contrôle isotype provenant d’un hôte approprié.
  4. Pour acquérir une image 3D, activez le mode z-stack et définissez les limites supérieure et inférieure. Définissez la taille/le nombre d’étapes.
    REMARQUE: Pour plus de détails sur l’imagerie du coronavirus, voir19.

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Résultats

Le protocole immuno-ARN-FISH décrit dans ce manuscrit a été réalisé utilisant deux systèmes cellulaires : une variété de cellule de Vero et une culture 3D d’AHH. Les principales étapes pour les deux modèles cellulaires sont présentées dans le tableau 2. Le protocole ARN-FISH pour la visualisation du SARS-CoV-2 dans les cultures d’AOH comprend des étapes typiques des échantillons de tissus, c’est-à-dire la perméabilisation avec 100% MeOH et la réhydr...

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Discussion

Immuno-RNA-FISH est une méthode fiable pour la double coloration de l’ARN et des protéines cellulaires. Ici, un protocole immuno-ARN-FISH modifié a été décrit qui permet la détection de l’ARN du SARS-CoV-2 et des protéines cellulaires dans les lignées cellulaires et les cultures d’AHH. Ce protocole peut être adapté pour une utilisation dans différents modèles cellulaires, y compris des monocouches cellulaires ou des tissus spécifiques. La méthode repose sur le concept d’un HCR initié par la locali...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le ministère des Sciences et de l’Enseignement supérieur pour la recherche sur le SARS-CoV-2, et par des subventions du Centre national des sciences (subventions UMO2017/27/B/NZ6/02488 à K.P. et UMO-2018/30/E/NZ1/00874 à A.K.-P.).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Confocal Microscope LSM 880ZEISS
Grant Bio, Mini Rocker- ShakerFisher Scientific12965501
Incubator Galaxy170RNew BrunswickCO170R-230-1000
Thermomixer ComfortEppendorf5355 000 011
Materials
15 mm x 15 mm NO. 1 coverslipsLabSolute7695022
1.5 mL tubesFL-MEDICAL5.350.023.053
12-well plateTTP92412
Conical centrifuge tubeSarstedt5.332.547.254
parafilmSigmaP7793-1EA
serological pipetsVWR Collection612-5523P, 612-5827P
slide glassPTH CHEMLAND04-296.202.03
Transwell ThinCertsGrainer bio-one665641
Reagents
Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies Invitrogen
β5-tubulin Santa Cruz Biotechnology sc-134234
DAPIThermo ScientificD1306
Disodium phosphateSigmaS51136-500G
EGTABioShopEGT101.25
HCR Amplification BufferMolecular Instruments, Inc.BAM01522Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information
HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647Molecular Instruments, Inc.S013922
HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647Molecular Instruments, Inc.S012522
HCR Probe Hybridization BufferMolecular Instruments, Inc.BPH03821Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information
HCR probe set for SARS-CoV-2 NcapsidMolecular Instruments, Inc.PRE134
HCR Probe Wash BufferMolecular Instruments, Inc.BPW01522Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information
HEPESBioShopHEP001.100
Magnesium sulfate heptahydrateSigma63138-250G
MethanolSigma32213-1L-M
Monopotassium phosphateSigmaP5655-100G
ParaformaldehydeSigmaP6148-1KG
PIPESBioShopPIP666.100
Potassium ChlorideSigmaP5405-250G
Prolong Diamond Antifade Mounting MediumInvitrogenP36970
Sodium ChlorideBioShopSOD001.5
Trisodium Citrate 2-hydratePOCH 6132-04-3
Tween-20BioShopTWN580.500
Software
Fluorescence SpectraviewerModeling spectral parameters
ImageJ FijiAcquiring and processing z-stack images

Références

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