JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы описываем простой метод, который сочетает в себе РНК флуоресценции на месте гибридизации (РНК-ФИШ) с иммунофторесценцией для визуализации тяжелой острой коронавируса респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) РНК. Этот протокол может повысить понимание молекулярных характеристик взаимодействий РНК-хозяина SARS-CoV-2 на одноклеточном уровне.

Аннотация

Эта рукопись содержит протокол для на месте гибридизации цепной реакции (HCR) в сочетании с иммунофлюоресценцией для визуализации тяжелой острой коронавируса респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) РНК в клеточной линии и трехмерных (3D) культур эпителия дыхательных путей человека. Метод позволяет высокоспецифическую и чувствительную визуализацию вирусной РНК, опираясь на HCR, инициированный локализацией зонда. Сплит-инициатор зонды помогают усилить сигнал флуоресцентно помечены усилители, в результате чего незначительные фоновые флуоресценции в конфокальной микроскопии. Маркировка усилителей различными флуоресцентными красителями облегчает одновременное распознавание различных целей. Это, в свою очередь, позволяет картировать инфекцию в тканях, чтобы лучше понять вирусный патогенез и репликацию на одноклеточном уровне. Соединение этого метода с иммунофлуоресценцией может способствовать лучшему пониманию взаимодействий между принимающей вирусом, включая чередование эпигенома хозяина и путей иммунного ответа. Благодаря чувствительной и специфической технологии УВКБ этот протокол также может использоваться в качестве диагностического инструмента. Важно также помнить, что метод может быть легко изменен, чтобы позволить обнаружение любой РНК, в том числе некодирующих РНК и РНК вирусов, которые могут возникнуть в будущем.

Введение

ТОРС-КоВ-2 — новый бетакоронавирус человека, возникший в конце 2019 года, вызвав беспрецедентную пандемию несколько месяцев спустя. Поскольку вирус является новым для науки, большая часть его биологии и его влияние на клетки-хозяина остаются неизвестными. Таким образом, картирование вирус-клеток и ткани тропизма во время инфекции имеет важное значение, если его основные биологические характеристики и его влияние на хозяина должны быть поняты. Для изучения взаимодействия вирусов и принимающих вирусов используется несколько методов, включая биохимические, биологические и физические анализы. На месте гибридизации является распространенным методом, который использует помечены дополнительные ДНК, РНК, или модифицированные зонды нуклеиновой кислоты, которые локализуются в конкретных последовательностей ДНК или РНК в клетке или ткани.

Разработан новый метод гибридизации РНК на месте (RNA-FISH), который включает в себя модификации для повышения чувствительности путем усиления соотношения сигнала к шуму черезHCR 1. HCR позволяет изучать локализацию РНК на уровне одноклеточных. Благодаря высокой специфичности, чувствительности и разрешению этот метод полезен не только для фундаментальных научных исследований, но и для аппликативных проектов, например, диагностики. Недавно была продемонстрирована осуществимость этого метода для обнаружения РНК SARS-CoV-2, локализованной на цилиированных клетках в полностью дифференцированных 3D эпителия дыхательных путей человека (HAE)культур 2. HaE культуры представляют собой один из самых передовых инструментов, используемых для изучения вирусной инфекции в контексте "естественной инфекции"микроокниронии 3,4.

В нескольких докладах о коронавирусах человека (HCoV), в том числе ОРВИ-КоВ-2, подчеркивается важность эпигенетических модификаций в отношении инфекции HCoV и патофизиологии (рассмотрена в 5,например, метилирование модели гена, кодирующей ангиотензин-конвертирующий фермент 2 (ACE-2)рецептор 6,7. Интересно, что масс-спектрометрический скрининг выявил несколько эпигенетических факторов, которые взаимодействуют с протеомом ТОРС-КоВ-28. В частности, неструктурный белок 5 (NSP5) связывается с эпигенетическим регулятором, дицетилазой 2 гистона 2, а каталитически неактивный NSP5 (C145A) взаимодействует с тРНК метилтрансферазой 1 (24). Кроме того, активность метилтрансферазы NSP16 блокируется ингибитором метилтрансферазы, синефунгином9. Однако точная роль этих эпигенетических факторов в COVID-19 остается неясной. Репликация HCoV происходит в цитоплазме инфицированной клетки, и вызывает воспалительные реакции, которые регулируются эпигенетических модификаций10.

Например, HCoV-229E тонко настраивает ядерный фактор-каппа B сигнализации и глубоко перепрограммирует ландшафт хозяина клеточного хроматина за счет увеличения ацетилирования H3K36 и H4K5 в некоторыхрегионах 11. Коронавирусная инфекция, связанная с ближневосточным респираторным синдромом, повышает уровень H3K27me3 и истощает H3K4me3 в промоутерской области подмножественно конкретных чувствительных к интерферонугенов 12. Кроме того, вирусная РНК вызывает иммунные реакции клеток, как попродемонстрированодля флавивирусов 13,ретровирусов 14,15икоронавирусов 16. Эпигенетические маркеры вирусной РНК могут играть определенную роль в распознавании клеточными датчиками, как показано на m7A метилировании вируса иммунодефицита человека-1РНК 17. Тем не менее, остаются вопросы: Каково влияние SARS-CoV-2 РНК на иммунный ответ, и эпигенетические знаки участие?

Здесь описан оптимизированный метод РНК-ФИШ в сочетании с иммунофлуоресценцией клеточной линии и 3D тканей (полностью дифференцированный HAE). Хотя цитологические методы, такие как FISH и иммунофлуоресценция, широко используются, этот метод гибридизации на месте нового поколения, основанный на HCR, никогда не использовался для обнаружения вирусов (за исключением недавнейпубликации) 2. В целом, иммуностай и FISH требуют следующих шагов: проницаемка для обеспечения проникновения зондов или антител; фиксация, при которой клеточный материал фиксируется и сохраняется; обнаружение, при котором применяются антитела или зонды нуклеиновой кислоты; и, наконец, монтаж образцов для визуализации.

Хотя существующие протоколы имеют общие характеристики, они заметно различаются по отношению к задействованным параметрам. Здесь был описан оптимизированный, простой, иммуно-РНК-FISH протокол для обнаружения SARS-CoV-2 РНК в культурах HAE и клетках Веро. Техника включает в себя следующие шаги: (1) фиксация клеток с параформальдегидом; (2) проницаемая с моющим средством или метанолом (MeOH); (3) регидратация через градуированные серии растворов MeOH (только культур HAE); (4) обнаружение; 5) усиление с использованием технологии УВК для обнаружения РНК ТОРС-КоВ-2; (6) иммуностимулятор; и (7) изображения под конфокальцентом.

протокол

1. Буферная подготовка

  1. Для 500 мл 2x буфера PHEM, комбинат 18,14 гпиперазина-N,НО-бис(2-этанесульфоновая кислота) (PIPES), 6,5 г 4-(2-гидроксиэтил)-1 пиперазин этанесульфоновая кислота (HEPES), 3,8 г тетраакетической кислоты этиленгликоль (EGTA) и 0,99 г сульфата магния (MgSO4). Сделайте объем до 400 мл с дистиллированной водой (dH2O), перемешать, и настроить рН до 7,0 с помощью 10 М гидроксида калия (KOH) или гидроксида натрия (NaOH). Сделайте окончательный объем до 500 мл, а затем разделите на 50 мл aliquots. Хранить при -20 градусов по Цельсию до тех пор, пока требуется.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер не будет ясен, пока рН не достигнет 7,0.
  2. Подготовье опционное решение 37% w/v paraformaldehyde (PFA). Для 50 мл смешайте 18,5 г ПФА и 35 мл dH2O в стеклянной бутылке. Поместите бутылку на магнитный мешалка с подогревом. Добавьте 900 МКЛ из 1 M KOH или NaOH и перемешайте, пока раствор не станет ясным. Дайте остыть и перенесите в коническую центрифугу 50 мл; до 50 мл с dH2O. Решение может храниться при -20 градусов по Цельсию до тех пор, пока не потребуется.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Формальдегид должен быть обработан в дымовой капот во время ношения защитных перчаток и лабораторного пальто.
  3. Подготовьте буфер фиксации (3,7% PFA буфер с PHEM). Для 50 мл, объединить 5 мл 37% раствора PFA, 25 мл 2x буфера PHEM, и 20 мл dH2O в 50 мл конической центрифуги трубки. Хранить при -20 градусов по Цельсию до тех пор, пока требуется.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После оттаивания буфер может храниться при 4 градусах Цельсия в течение 3 месяцев.
  4. Подготовка PBST (0,1% Tween-20 в 1x фосфат-буферный солевой раствор (PBS). Для 50 мл добавьте 50 МКЛ 100% Tween-20 до 50 мл 1x PBS и хорошо перемешайте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор может храниться при комнатной температуре (RT).
  5. Подготовка регидратационных буферов путем объединения MeOH/PBST в соотношении 3:1, 1:1 и 1:3 (окончательный объем 100 мл каждого; см. таблицу 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: MeOH очень токсичны и легковоспламеняющиеся. Как это может повредить зрительный нерв, он должен быть обработан в дым капот избегая каких-либо открытого пламени. Поскольку смешивание MeOH и PBST генерирует экзотермическую реакцию, объединить растворы на льду.
  6. Для 1000 мл 20x SSC, объединить 175,3 г хлорида натрия (NaCl) и 88,2 г цитрата натрия в стакане, и заполнить с 800 мл dH2O. Перемешать до растворения, и настроить рН до 7,2 с помощью NaOH. Добавьте dH2O к общей громкости 1000 мл, а также автоклав или фильтр через фильтр 0,22 мкм в автоклавную бутылку.
  7. Для 50 мл 5x SSCT, объединить 12,5 мл 20x SSC буфера с 37,5 мл dH2O, и добавить 50 йл 100% Tween-20. Хорошо перемешать.
  8. Для 50 мл 50% 5x SSCT/50% PBST, объединить 25 мл 5x SSCT с 25 мл PBST.
  9. Для 50 мл 2x SSC, объединить 5 мл 10x SSC буфера с 45 мл dH2O. Mix хорошо.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все буферы SSC должны храниться на RT в темноте.

2. Целевое определение, зонды и усилители

  1. Используйте инструменты, доступные на веб-сайте производителя для разработки усилителей и зондов. Убедитесь, что зонды дополняют обратную нить ДНК гена SARS-CoV-2 N(дополнительная цифра 1).
  2. Определите наилучший размер набора зонда (для визуализации достаточно набора из 20 зондов).
  3. Установите усилители, используемые для обнаружения РНК цели.
    1. Используйте усилитель HCR B1 с маркировкой Alexa Fluor 647.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Усилитель HCR включает метастабийные шпильки HCR h1 и h2. Мультиплексные эксперименты могут быть разработаны с помощью этого протокола. Если это планируется, выберите другой усилитель HCR (B1, B2, ...) для каждой целевой РНК, которая будет изображена в пределах одного и того же образца (например, усилитель B1 для цели 1, усилитель B2 для цели 2, ...).

3. Клеточная культура и инфекция ТОРС-КоВ-2

  1. Культура Веро (обезьяньи клетки эпителиальной почки) в модифицированной среде орла Дулбекко, содержащей 5% сыворотки крупного рогатого скота плода.
    1. Семя 50000 клеток на крышки (No 1, 15 × 15 мм) в 12-хорошо пластины.
  2. Подготовка полностью дифференцированных культурHAE, как описано 18 на проницаемых Transwell вставки поддерживает с мембраной (диаметр 6,5 мм) и культуры в бронхиальной эпителиальной среды роста до полного слияния.
  3. Вирусная инфекция
    1. Прививки клеток с ТОРС-CoV-2 при 1000x медианной культуре тканей инфекционной дозы (TCID50) на мл
    2. Инкубационые клетки в течение 2 ч при 37 градусах Цельсия.
    3. Вымойте клетки дважды с PBS для удаления несвего вируса.
    4. Культурные клетки на 48 ч.

4. SARS-CoV-2 РНК-FISH в клетках Веро, обучигаемых на обложках

День 1

  1. Фиксация и проницаемая ячейка
    1. Исправить инфицированные клетки с 3,7% ж / В PFA решение для 1 ч на RT.
    2. Аспирировать 3,7% раствор PFA, и мыть клетки дважды с помощью 1x PBS.
    3. Перезагнировать клетки с раствором PBST в течение 10 минут на RT с агитацией.
    4. Аспирировать PBST, и мыть клетки дважды с 1x PBS.
  2. обнаружение
    1. Аспирировать 1x PBS раствор, и мыть клетки дважды с 2x SSC на RT.
    2. Аспирировать 2x SSC решение, и предустановить образцы, добавив по крайней мере 300 йл буфера гибридизации зонда. Обложка скважин, содержащих клетки, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
    3. Подготовьте решение зонда, добавив 1,2 пмоль смеси зонда в буфер гибридизации зонда.
      1. Используйте 1,2 МКЛ из запаса зонда 1 МКМ для подготовки 300 МКЛ рабочего запаса.
    4. Удалите раствор предгибридизации и перенесите крышки во увлажняемую камеру.
      1. Pipette 30-50 йл раствора зонда на парафильме для формирования отдельных капель.
    5. Инкубировать образцы на ночь (12-18 ч) при 37 градусах Цельсия.

      День 2
    6. Передача coverslips обратно в 12-хорошо пластины, и удалить избыток раствора зонда путем мытья в течение 4 х 5 мин с 400 йл буфера промывки зонда при 37 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы размещению 30-50 мкл aliquots на парафильм и под крышками для инкубации, добавить 300 йл зонда решение непосредственно coverslips в 12-хорошо пластины. Эта процедура проще, но требует значительного количества реагентов. Нагрейте буфер промывки зонда до 37 градусов по Цельсию перед использованием. Рассчитайте необходимое количество буфера и перенесите его в коническую центрифугу 15 мл.
    7. Вымойте образцы в течение 2 х 5 мин с 5x SSCT на RT.
    8. Замените решение 5x SSCT на 1x PBS и храните образцы при 4 градусах Цельсия до усиления.
  3. усиление
    1. Удалите раствор 1x PBS из скважин и добавьте по крайней мере 300 МЛ буфера усиления к каждой скважине. Инкубировать образцы в течение 30 мин на RT.
    2. Подготовь каждую ХБ волосяную вардину (h1 и h2) путем прихлопытить-охлаждение нужного объема в отдельных трубках.
      1. Для подготовки 300 МКЛ раствора усиления используйте 18 млн т каждого шпильки (например, для 300 йл, используйте 6 МКЛ из 3 мкм раствора шпильки запас).
      2. Перенесите раствор шпильки в трубки.
      3. Инкубационный при 95 градусов по Цельсию на 90 с.
      4. Охладить до RT в течение 30 минут в темноте.
    3. Подготовьте парикмахерскую смесь, добавив в буфер усиления шпильки с помощью шпильки "h1" и "h2".
    4. Поместите капли 30-50 л шпильки смеси на парафильм.
    5. Инкубировать образцы на ночь (12-18 ч) в темноте на RT.

      День 3
    6. Передача coverslips обратно в 12 хорошо пластины, и удалить избыток шпильки путем мытья в течение 5 х 5 мин с 5x SSCT на RT с волнением.
    7. Оспирировать 5x SSCT буфер, и заменить его на 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости используйте образцы РНК-ФИШ в стандартном анализе иммунофлуоресценции, за которым следует окрашивание ядер (см. раздел 5).
  4. Ядерное окрашивание и монтаж слайдов
    1. Аспирировать 1x PBS решение, и заменить его на 4 ',6-diamidino-2-фенилиндол (DAPI, 0,2 мкг / мл) в 1x PBS решение.
    2. Инкубировать образцы в течение 10 минут на RT в темноте.
    3. Аспирировать раствор DAPI и мыть клетки дважды с помощью 1x PBS.
    4. Поместите две капли по 10 КЛ каждая из монтажной среды; обеспечить, чтобы капли были разделены достаточно, чтобы позволить разместить две крышки на одном слайде.
    5. Удалите избыток жидкости, нажав крышки на чистое полотенце, а затем поместить их в антифад монтажа среды с клетками лицом вниз.
    6. Поместите установленные образцы на сухую, плоскую поверхность в темноте и дайте им вылечиться.
    7. После лечения, печать края крышки с ГЕРК герметик или лак для ногтей, чтобы предотвратить образцы от высыхания.

5. ТОРС-КОВ-2 РНК-ФИШ в культурах HAE

День 1

  1. Фиксация и пермеабилизация культуры HAE
    1. Аспирировать среду, и исправить инфицированных клеток с помощью 3,7% PFA решение для 1 ч на RT.
    2. Аспирировать 3,7% раствор PFA, и мыть клетки дважды с 1x PBS.
      1. Замените 3,7% решение PFA на 1x PBS под вставкой Transwell.
    3. Отбросьте PBS, и обезвоживать образцы с помощью 2 х 5 мин моет с 100% MeOH prechilled до -20 градусов по Цельсию.
    4. После второй стирки замените буфер свежим охлажденным MeOH для протеабилизации под вставкой Transwell. Хранить на ночь при -20 градусов по Цельсию.

День 2

  1. Регидратации
    Регидратировать образцы через градуированную серию решений MeOH/PBST (каждый в течение 5 мин) на льду: 75% MeOH/25% PBST, 50% MeOH/50% PBST, 25% MeOH/75% PBTS и 100% PBST (дважды).
    1. Вымойте клетки в течение 5 мин на льду с 50% 5x SSCT/50% PBST.
    2. Вымойте клетки в течение 5 минут на льду с 5x SSCT.
    3. Замените 5x буфер SSCT на 1x PBS.
  2. обнаружение
    1. Инкубировать клетки (внутри вставки Transwell) в течение 5 минут на льду с 100 йл буфера гибридизации зонда. Затем перенесите пластину в инкубатор на 30 мин при 37 градусов по Цельсию (прегибридизация).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер гибридизации зонда должен быть предварительно разогрет до 37 градусов по Цельсию перед использованием. Рассчитайте необходимый объем: для одной вставки Transwell необходимо 100 йл.
    2. Подготовь решение зонда. Как 1 мл зонда решение требует 4 pmol зонда, добавить 4 МКл 1 МК зонда фондового решения 1 мл буфера гибридизации зонда, и хорошо перемешать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для обнаружения РНК используйте 100 МКЛ раствора зонда на вставку Transwell. Оставьте раствор зонда на льду до конца шага предгибридизации.
    3. Удалите решение для предохрибровки и добавьте решение зонда.
    4. Инкубировать клетки на ночь (12-18 ч) при 37 градусов по Цельсию.

      День 3
    5. Удалите избыточный зонд, стирая в течение 4 х 15 мин с 100 йл буфера промывки зонда при 37 градусов по Цельсию.
    6. Вымойте образцы в течение 2 х 5 мин с 5x SSCT на RT.
    7. Замените 5x SSCT на 1x PBS и храните образцы при 4 градусах Цельсия до усиления.
  3. усиление
    1. Предварительно разочастить образцы, инкубируя их буфером усиления в течение 30 минут на RT.
    2. Подготовь каждую шпильки, захлопав нужные объемы в отдельных трубках.
      1. Для подготовки 500 МКЛ раствора усиления используйте 30 млн т каждого шпильки (например, для 500 йл, используйте 10 йл из 3 мкм раствора шпильки).
      2. Перенесите раствор шпильки в трубки.
      3. Инкубационный при 95 градусов по Цельсию на 90 с.
      4. Охладить до RT в течение 30 минут в темноте.
    3. Подготовьте решение шпильки, добавив все шпильки с оснастки до 500 йл буфера усиления на RT.
    4. Удалите предварительное решение для упрощения и добавьте полное решение для шпильки.
    5. Инкубировать образцы на ночь (12-18 ч) на RT в темноте.
    6. Удалите лишние шпильки при стирке с 5x SSCT на RT следующим образом: 2 х 5 мин, 2 х 15 мин, и 1 х 5 мин.
    7. Замените 5x SSCT раствор с 1x PBS, и хранить при 4 кк в течение не более 2-3 дней или перейти непосредственно к ядерному окрашивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости используйте образцы РНК-ФИШ в стандартном анализе иммунофлуоресценции с последующим ядерным окрашиванием (см. раздел 6).
  4. Ядерное окрашивание и монтаж слайдов
    1. Аспирировать решение 1x PBS и заменить его раствором DAPI (0,2 мкг/мл) в 1x PBS.
    2. Инкубировать образцы в течение 10 минут на RT в темноте.
    3. Аспирировать раствор DAPI и мыть клетки дважды с помощью 1x PBS.
    4. Поместите вырезанную мембрану из трансвелла на 10 МКЛ антифадной крепления среды с обращением клеток вверх и добавьте к мембране дополнительную монтажную среду (5 МЛ).
    5. Обложка мембраны с coverslips.
    6. Лечить установленные образцы на сухой, плоской поверхности в темноте.
    7. После лечения, печать края крышки с ГЕРК герметик или лак для ногтей, чтобы предотвратить образцы от высыхания.

6. Иммунофлуоресценция анализ клеток Веро и HAE культур

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните иммунофлуоресценции анализ на 3 день для клеточных линий или день 4 для культур HAE. Используйте другой подход для каждой модели. Все различия четко обозначены.

  1. Аспирировать 1x PBS решение из скважин.
  2. Блокируйте образцы путем инкубации с 1% w/v бычьего альбумин сыворотки в растворе PBST в течение 30 мин при 37 градусах Цельсия.
  3. Подготовка первичных антител путем подготовки соответствующих разбавлений в блокирующий раствор, и инкубировать.
    1. Для клеток Vero на обложках:
      1. Поместите капли (30-50 л) раствора антитела на парафильм в камере влажности.
      2. Место coverslips на антитела капель с клетками лицом вниз.
    2. Для HAE замените блокирующий агент в вставке раствором антитела (100 МКЛ) и инкубировать образцы в увлажненной камере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте время и температуру для каждой инкубации с помощью первичного антитела. Типичные параметры 2 ч на RT или на ночь при 4 градусов по Цельсию.
  4. Вымойте образцы в течение 3 х 5 мин с PBST.
    1. Для ячеек на крышках перенесите на пластину из 12 колодец и добавьте раствор PBST.
    2. Для культур HAE замените раствор антител раствором PBST.
  5. Проверьте источники света и фильтры, доступные для конфокального микроскопа.
  6. Выберите вторичные антитела в соответствии с видом хозяина. Выберите параметры фторфора (возбуждение и выброс длин волн, ширина спектра и эффективность возбуждения в зависимости от доступного источника света).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Спектральные параметры можно моделировать с помощью онлайн-инструментов (см. таблицу материалов).
  7. Подготовьте соответствующие вторичные антитела, разбавляя их блокирующим раствором.
  8. Инкубировать вторичными антителами (как в 6.3), но инкубировать в течение 1 ч при 37 градусов по Цельсию.
  9. Вымойте образцы, как в шаге 6.4.
  10. Ядерное окрашивание и монтаж слайдов
    1. Для ячеек на обложках
      1. Аспирировать PBST, и заменить его на DAPI (0,2 мкг / мл) в 1x PBS решение.
      2. Инкубировать образцы в течение 10 минут на RT в темноте.
      3. Аспирировать раствор DAPI и мыть клетки дважды с помощью 1x PBS.
      4. Поместите крышки на капли 10 МКЛ монтажной среды с клетками лицом вниз.
      5. Печать крышки с лаком для ногтей.
    2. Для культур HAE
      1. Аспирировать 1x PBST, и заменить его на DAPI (0,2 мкг / мл) в 1x PBS решение.
      2. Инкубировать образцы в течение 10 минут на RT в темноте.
      3. Аспирировать раствор DAPI и мыть клетки дважды с помощью 1x PBS.
      4. Поместите вырез мембраны на капли 10 МКЛ монтажной среды с клетками, обращенные вверх, и добавить дополнительные (5 йл) монтаж среды к мембране.
      5. Обложка мембраны с coverslips.
      6. Печать крышки с лаком для ногтей.

7. Конфокальцавная микроскопия

  1. Определите треки, указав используемые фторфоры.
  2. Выберите режим сканирования и скорость.
  3. Отрегулируйте мощность лазера, увеличение и компенсационые значения для каждого флюорофора, сравнивая их с соответствующими отрицательными контролями: для вирусов, макет-инфицированных клеток; для клеточных белков, образцы, окрашенные антителами контроля изотипа от соответствующего хозяина.
  4. Чтобы получить 3D-изображение, активируйте режим z-stack и установите верхние и нижние пределы. Установите размер шага/число.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения более подробной информации о коронавирусной визуализации,см.

Результаты

Протокол иммуно-РНК-ФИШ, описанный в этой рукописи, был выполнен с использованием двух клеточных систем: клеточной линии Веро и 3D-культуры HAE. Основные шаги для обеих клеточных моделей показаны в таблице 2. Протокол РНК-ФИШ для визуализации SARS-CoV-2 в культурах HAE ?...

Обсуждение

Immuno-RNA-FISH является надежным методом двойного окрашивания РНК и клеточных белков. Здесь описан модифицированный иммуно-РНК-ФИШ протокол, который позволяет обнаруживать РНК ТОРС-КоВ-2 и клеточные белки в клеточных линиях и культурах HAE. Этот протокол может быть адаптирован для использова?...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, чтобы заявить.

Благодарности

Эта работа была поддержана Министерством науки и высшего образования для исследований ПО ТОРС-КоВ-2, а также грантами Национального научного центра (гранты UMO2017/27/B/N'6/02488 К.П. и УМО-2018/30/E/N'1/00874 К.К.-П.).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Confocal Microscope LSM 880ZEISS
Grant Bio, Mini Rocker- ShakerFisher Scientific12965501
Incubator Galaxy170RNew BrunswickCO170R-230-1000
Thermomixer ComfortEppendorf5355 000 011
Materials
15 mm x 15 mm NO. 1 coverslipsLabSolute7695022
1.5 mL tubesFL-MEDICAL5.350.023.053
12-well plateTTP92412
Conical centrifuge tubeSarstedt5.332.547.254
parafilmSigmaP7793-1EA
serological pipetsVWR Collection612-5523P, 612-5827P
slide glassPTH CHEMLAND04-296.202.03
Transwell ThinCertsGrainer bio-one665641
Reagents
Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies Invitrogen
β5-tubulin Santa Cruz Biotechnology sc-134234
DAPIThermo ScientificD1306
Disodium phosphateSigmaS51136-500G
EGTABioShopEGT101.25
HCR Amplification BufferMolecular Instruments, Inc.BAM01522Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information
HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647Molecular Instruments, Inc.S013922
HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647Molecular Instruments, Inc.S012522
HCR Probe Hybridization BufferMolecular Instruments, Inc.BPH03821Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information
HCR probe set for SARS-CoV-2 NcapsidMolecular Instruments, Inc.PRE134
HCR Probe Wash BufferMolecular Instruments, Inc.BPW01522Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information
HEPESBioShopHEP001.100
Magnesium sulfate heptahydrateSigma63138-250G
MethanolSigma32213-1L-M
Monopotassium phosphateSigmaP5655-100G
ParaformaldehydeSigmaP6148-1KG
PIPESBioShopPIP666.100
Potassium ChlorideSigmaP5405-250G
Prolong Diamond Antifade Mounting MediumInvitrogenP36970
Sodium ChlorideBioShopSOD001.5
Trisodium Citrate 2-hydratePOCH 6132-04-3
Tween-20BioShopTWN580.500
Software
Fluorescence SpectraviewerModeling spectral parameters
ImageJ FijiAcquiring and processing z-stack images

Ссылки

  1. Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145, (2018).
  2. Milewska, A., et al. Replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 in human respiratory epithelium. Journal of Virology. 94, (2020).
  3. Banach, B. S., et al. Human airway epithelial cell culture to identify new respiratory viruses: coronavirus NL63 as a model. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 19-26 (2009).
  4. Milewska, A., et al. Entry of human coronavirus NL63 into the cell. Journal of Virology. 92, (2018).
  5. El Baba, R., Herbein, G. Management of epigenomic networks entailed in coronavirus infections and COVID-19. Clinical Epigenetics. 12, 118 (2020).
  6. Pinto, B. G. G., et al. ACE2 expression is increased in the lungs of patients with comorbidities associated with severe COVID-19. Journal of Infectious Diseases. 222 (4), 556-563 (2020).
  7. Verdecchia, P., Cavallini, C., Spanevello, A., Angeli, F. The pivotal link between ACE2 deficiency and SARS-CoV-2 infection. European Journal of Internal Medicine. 76, 14-20 (2020).
  8. Gordon, D. E., et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature. 583, 459-468 (2020).
  9. Ferron, F., Decroly, E., Selisko, B., Canard, B. The viral RNA capping machinery as a target for antiviral drugs. Antiviral Research. 96 (1), 21-31 (2012).
  10. Mehta, S., Jeffrey, K. L. Beyond receptors and signaling: epigenetic factors in the regulation of innate immunity. Immunology and Cell Biology. 93 (3), 233-244 (2015).
  11. Poppe, M., et al. The NF-kappaB-dependent and -independent transcriptome and chromatin landscapes of human coronavirus 229E-infected cells. PLoS Pathogens. 13, 1006286 (2017).
  12. Schafer, A., Baric, R. S. Epigenetic landscape during coronavirus infection. Pathogens. 6 (1), 8 (2017).
  13. Carletti, T., et al. Viral priming of cell intrinsic innate antiviral signaling by the unfolded protein response. Nature Communications. 10, 3889 (2019).
  14. Heil, F., et al. Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8. Science. 303 (5663), 1526-1529 (2004).
  15. Sze, A., et al. Host restriction factor SAMHD1 limits human T cell leukemia virus type 1 infection of monocytes via STING-mediated apoptosis. Cell Host and Microbe. 14 (4), 422-434 (2013).
  16. Kikkert, M. Innate immune evasion by human respiratory RNA viruses. Journal of Innate Immunity. 12, 4-20 (2020).
  17. Kennedy, E. M., et al. Posttranscriptional m(6)A editing of HIV-1 mRNAs enhances viral gene expression. Cell Host and Microbe. 22 (6), 830 (2017).
  18. Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Human Cell Culture Protocols in Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).
  19. Milewska, A., Owczarek, K., Szczepanski, A., Pyrc, K. Visualizing coronavirus entry into cells. Methods in Molecular Biology. 2203, 241-261 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1662HAE

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены