Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يسمح محول لوحة متعددة الأعمدة الأعمدة الكروماتوغرافية لتكون واجهة مع لوحات جمع متعددة الآبار لتقارب مواز أو تنقية تبادل الأيونات توفير طريقة تنقية البروتين عالية الإنتاجية اقتصادية. ويمكن استخدامه تحت الجاذبية أو فراغ تسفر عن كميات ملليغرام من البروتين عن طريق الأجهزة بأسعار معقولة.

Abstract

تنقية البروتين أمر حتمي لدراسة بنية البروتين ووظيفته وعادة ما يستخدم في تركيبة مع التقنيات الفيزيائية الحيوية. كما أنها عنصر رئيسي في تطوير علاجات جديدة. العصر المتطور من البروتيوميات الوظيفية يغذي الطلب على تنقية البروتين عالية الإنتاجية والتقنيات المحسنة لتسهيل ذلك. افترض أن محول لوحة الأعمدة المتعددة (MCPA) يمكنه ربط أعمدة لونية متعددة من راتنجات مختلفة بلوحات متعددة الآبار لتنقية متوازية. تقدم هذه الطريقة طريقة اقتصادية ومتعددة الاستخدامات لتنقية البروتين التي يمكن استخدامها تحت الجاذبية أو الفراغ ، مما ينافس سرعة النظام الآلي. يمكن استخدام MCPA لاسترداد غلة ملليغرام من البروتين عن طريق طريقة معقولة وفعالة من حيث الوقت لتوصيف وتحليل لاحقة. تم استخدام MCPA لتنقية تقارب عالي الإنتاجية من مجالات SH3. كما تم إثبات تبادل الأيونات عبر MCPA لتنقية البروتين بعد الكروماتوغرافيا تقارب Ni-NTA، مما يشير إلى كيفية هذا النظام يمكن تكييفها لأنواع تنقية أخرى. نظرا لإعداده مع أعمدة متعددة ، يمكن إجراء التخصيص الفردي للمعلمات في نفس التنقية ، غير قابل للتحقيق من خلال الأساليب الحالية المستندة إلى اللوحة.

Introduction

تقنيات تنقية البروتين لتحقيق كميات ملليغرام من البروتينات النقية أمر حتمي لتوصيفها وتحليلها، وخاصة بالنسبة للطرق الفيزيائية الحيوية مثل NMR. تنقية البروتين هو أيضا مركزية عبر مجالات أخرى من الدراسة مثل عمليات اكتشاف المخدرات ودراسات التفاعل البروتين البروتين; ومع ذلك، تحقيق مثل هذه الكميات من البروتين النقي يمكن أن تصبح عنق الزجاجة لهذه التقنيات1،2،3. الطريقة الرئيسية لتنقية البروتين هي الكروماتوغرافيا ، والتي تشمل مجموعة متنوعة من الطرق التي تعتمد على الخصائص الفردية للبروتينات وعلاماتها. في الكروماتوغرافيا تقارب، والبروتينات لديها بروتين إضافي أو الببتيد عزر الذي يعمل كعلامة التي لديها تقارب لركيزة معينة على راتنج الكروماتوغرافيا4. طريقة التقارب الأكثر شيوعا هي كروماتوغرافيا تقارب المعادن (IMAC) باستخدام البروتينات الموسومة به ، في حين أن طريقة شعبية أخرى هي كروماتوغرافيا تبادل الأيونات التي تفصل بين البروتينات على أساس شحنتها. لأعلى درجة من النقاء، يتم استخدام مزيج من الكروماتوغرافيا المتقاربة وتبادل الأيونات معا، وعادة ما يتطلب معدات مختبرية باهظة الثمن للحصول على إنتاجية عالية.

العصر المتطور من البروتيوميات الوظيفية يغذي الطلب على تقنيات عالية الإنتاجية لتنقية البروتينات ليس المفرد لتحليل محدد ولكن أعداد كبيرة من البروتينات في وقت واحد لتحليل شامل ودراسات الجينوم واسعة5. الكروماتوغرافيا تقارب معدنية معطلة (IMAC) هي واحدة من الأساليب الأكثر استخداما لتنقية البروتين عالية الإنتاجية6،7 بعد أنظمتها الآلية مكلفة وغير ميسورة للمختبرات الصغيرة8. وتستخدم البدائل القائمة على الصفائح المتاحة حاليا، والتي يمكن الحصول عليها، استخدام معدات مختبرية يمكن الوصول إليها، مثل الفراغ. على الرغم من أن هذه الأساليب ناجحة في تحسين سرعة تنقية، فإنه يمكن تحقيق فقط تنقية عالية الإنتاجية على نطاق أصغر، مما أسفر فقط البروتين في نطاق ميكروغرام. هذه القيود تعني أن ما قبل معبأة 96 لوحات مرشح البئر (على سبيل المثال، من جنرال الكتريك للرعاية الصحية المملوكة الآن من قبل Cytiva) لا يمكن استخدامها قبل التقنيات الفيزيائية الحيوية9. الكروماتوغرافيا الجاذبية هي الطريقة الأكثر كفاءة من حيث التكلفة لتنقية; ومع ذلك، إعداد أعمدة متعددة غير مريح ويمكن أن يكون عرضة للخطأ لبروتينات متعددة.

وقد تم تطوير محول لوحة متعددة الأعمدة (MCPA) وثبت لتشغيل بنجاح وسهولة موازية تقارب الأعمدة اللونية في وقت واحد لتنقية له الموسومة الخميرة SH3 المجالات10. يوفر MCPA طريقة تنقية عالية الإنتاجية فعالة من حيث التكلفة لا تعتمد على الأجهزة المكلفة. يمكن تصميمها مرنة تنقية بشكل فعال ملليغرام من البروتين عن طريق أعمدة لونية تقارب متعددة تحت الجاذبية أو فراغ متعددة. علاوة على ذلك، يمكن تعديل نوع الراتنج وحجمه ومعلمات أخرى لكل عمود فردي لتحسينه بشكل أسرع. توضح هذه الدراسة أن الكروماتوغرافيا التبادلية الأيونية من قبل MCPA يمكن استخدامها بالتزامن مع الكروماتوغرافيا التقاربية من قبل MCPA لتعزيز تنقية نطاق Abp1 SH3. بالإضافة إلى ذلك، يمكن فصل ما يصل إلى 24 بروتينا مختلفا بالتوازي باستخدام هذه الأساليب.

Protocol

1. ونياتورينج ني-NTA

  1. إعداد المخازن المؤقتة
    ملاحظة: راجع الجدول 1 للحصول على تفاصيل كافة المخازن المؤقتة.
    1. تشكل 500 مل من 0.5 M NaOH، مع التأكد من إضافة المياه ميلي كيو أولا ومن ثم إضافة NaOH ببطء في حين أن الكأس على stirrer. تصفية باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
    2. إعداد 100 مل من كبريتات النيكل 0.1 M ومرشح باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
    3. إعداد 50 مل من 2 إميدازول ومرشح باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
    4. إعداد و0.22 ميكرومتر مرشح 1.5 لتر من العازلة الإزالة في درجة الحموضة 8.0 تتكون من 5.3 mM تريس-HCl، 4.7 mM تريس قاعدة (تريس (هيدروكسي ميثيل)ميثيلامين), 13.7 mM NaH2PO4, 86.3 mM Na2HPO4 و 6 M guanidine هيدروكلوريد.
    5. إعداد و0.22 ميكرومتر مرشح 500 مل من محلول تحلل العازلة من 10 mM imidazole حلها في العازلة denaturing (انظر 1.1.4) باستخدام المخزون 2 M imidazole.
    6. إعداد و0.22 ميكرومتر مرشح 500 مل من محلول عازلة غسل من 10 mM imidazole حلها في العازلة denaturing (انظر 1.1.4) باستخدام المخزون 2 M imidazole.
    7. إعداد و0.22 ميكرومتر مرشح 500 مل من 100 متر EDTA العازلة، وضبط درجة الحموضة إلى 8 باستخدام 1 M NaOH.
    8. إعداد و0.22 ميكرومتر مرشح 500 مل من العازلة elution تتكون من 7 مل من حمض الخليك الجليدي 99٪ في 6 M guanidine هيدروكلوريد.
      ملاحظة: إذا كنت تستخدم المخازن المؤقتة الأصلية، تكيف وفقا للجدول 1.
  2. lysing الخلايا (أسلوب الإزالة)
    1. إضافة 2 مل من العازلة تحلل إلى كل 1 غرام من الكريات خلية القولونية التي تحتوي على أكثر من أعرب له الموسومة البروتين. دوامة لعدة دقائق حتى يتم إعادة تعليق الخلايا. ترك العينات على الروك لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    2. حبيبات مهزوسة بالطرد المركزي عند 18,000 × غرام لمدة 30 دقيقة. احتفظ ب 50 ميكرولتر جانبا في ثلاجة -20 درجة مئوية لتحليلها لاحقا على هلام SDS-PAGE.
    3. صب بعناية قبالة المضادات الفائقة التأكد من أن بيليه لا يزعج. يجب أن يكون Lysates لون أصفر فاتح وواضح. إذا كانت اللوادر غائمة، عينة الطرد المركزي مرة أخرى؛ النظر sonication إذا كانت متاحة لتتحلل حمض النوى.
    4. تصفية supernatants من خلال عمود فارغ (دون الراتنج ولكن مع مرشح) وجمع في علبة جمع مفتوحة. ثم نقل إلى أنبوب للاستخدام في الخطوة 1.3.
      ملاحظة: إذا كان استخدام المخازن المؤقتة الأصلية، ثم بعد الخطوة 1.2.1، علاج العينات إلى 3 دورات من تجميد / ذوبان في -80 درجة مئوية أو عملية بواسطة سونيكيشن أو الصحافة الفرنسية إلى الخلايا lyse.
  3. إعداد إعداد تنقية الفراغ والأعمدة المتساوية
    ملاحظة: انظر الشكل 1 لإعداد MCPA مع 24 عمودا.
    1. تحديد عدد الأعمدة المطلوبة وكذلك نوع الراتنج المطلوب وحجمه. كقاعدة عامة ل100 مل من ثقافة الاستقراء الذاتي (~ 2 غرام بيليه) التعبير عن له الموسومة SH3 المجالات باستخدام T7 القائم على البلازميدات، واستخدام 0.6 مل من راتنج ني-NTA لكل عمود لانتاج حوالي 3 ملغ من البروتين من حوالي 6 مل من اللذات.
    2. إدراج العدد المطلوب من أعمدة 12 مل (دون الراتنج ولكن مع مرشح) في MCPA تجميعها مسبقا (لوحة بالتنقيط طويلة مع ثقب حصيرة الختم). يجب أن تناسب الأعمدة بشكل مريح في ثقوب حصيرة الختم التي تم ثقبها.
    3. إذا تم استخدام أقل من 24 عمودا، أغلق فتحات فارغة بعمود مغلق فارغ.
    4. تأخذ لوحة جمع مفتوحة ووضع هذه اللوحة في قاعدة فراغ متعددة وقريبة مع الجزء العلوي من متعددة.
    5. وضع MCPA تجميعها مع أعمدة على رأس فراغ متعددة.
    6. إرفاق أنابيب من نظام مضخة فراغ إلى مدخل / فوهة في الجزء السفلي من فراغ متعددة.
    7. تأكد من أن حبات Ni-NTA في محلول 50٪ مع الإيثانول بنسبة 20٪. قبل القيام بأي شيء مع الخرز يهز بلطف / مزيج حل حبة / الإيثانول لإعادة الإنفاق بالتساوي. ثم، وذلك باستخدام ماصة 5 مل، ماصة 1.2 مل من الحل 50٪ في الأعمدة. في حين pipetting تأكد من الخرز لا تزال مختلطة تماما.
    8. بعد pipetting في جميع الأعمدة 24، بدوره على مضخة فراغ وتشغيل الإيثانول 20٪ من خلال العمود وإلى لوحة جمع أدناه.
    9. إيقاف تشغيل المضخة مرة واحدة كل الإيثانول 20٪ قد تم تشغيل من خلال جميع الأعمدة (راتنج ني-NTA يمكن أن تتسامح مع التجفيف وجيزة إذا كان الفراغ لا يزال يطبق بعد المخزن المؤقت قد مرت من خلال العمود). التخلص من ما هو في لوحة جمع مفتوحة في صندوق النفايات.
      تنبيه: جميع النفايات من حبات Ni-NTA خطرة، عند التعامل مع الخرز أو التخلص من النفايات، وارتداء القفازات والنظارات الواقية وغيرها من معدات الوقاية الشخصية. وعلاوة على ذلك، التخلص من جميع النفايات كبريتات النيكل في حاوية منفصلة للتخلص الفردية في وقت لاحق.
      ملاحظة: إذا resin جديدة أو تم إعادة إنشائها مؤخرا، يمكن تجاهل باقي هذه الخطوات، الانتقال إلى المقطع التالي.
    10. إضافة 3 وحدات تخزين الراتنج (1.8 مل) من 100 mM EDTA العازلة باستخدام حقنة 20 مل أو جهاز حقنة مكرر مع حقنة 50 مل. ثم قم بتشغيل مضخة الفراغ للسماح للحاجز EDTA يغسل من خلال وإيقاف تشغيل المضخة بمجرد أن يتم غسلها من خلال.
      ملاحظة: يجب إزالة هذا الغسيل اللون الأزرق النيكل ولكن إذا لم يكن هذا هو الحال ثم كرر هذه الخطوة حتى فقدت كافة الأعمدة لونها الأزرق. إيقاف تشغيل المضخة وصب محتويات لوحة جمع مفتوحة في مربع النفايات.
    11. إضافة 3 وحدات تخزين الراتنج (1.8 مل) من 0.5 M NaOH المخزن المؤقت في كل عمود قبل تشغيل المضخة وتشغيل هذا من خلال كل عمود. لوحة جمع فارغة.
    12. إضافة 4 كمية راتنج (2.4 مل) من كبريتات النيكل 100 مليون متر في كل عمود. بدوره على مضخة فراغ وتشغيل هذا من خلال العمود مرة أخرى.
    13. إضافة 10 وحدات تخزين الراتنج (~ 6000 ميكرولتر) من المياه ميلي كيو وتشغيل هذا من خلال الأعمدة. إيقاف تشغيل المضخة وتصب قبالة محتويات لوحة جمع في مربع النفايات.
    14. غسل الأعمدة مرتين مع 4 أحجام الراتنج (2.4 مل) من 10 mM imidazole في عازلة غسل (الإزالة أو الأصلي) في كل مرة لإزالة أي النيكل الزائدة والاعتدال. لوحة جمع فارغة.
      ملاحظة: إذا كانت أي أعمدة تعمل بشكل أبطأ بشكل ملحوظ، فصل العمود والتحقق من الهواء يمكن دفعها من خلال MCPA باستخدام حقنة كبيرة. إذا تم إلغاء حظر هذا، استخدم عمودا مختلفا باستخدام عامل تصفية جديد.
    15. إذا عينات مختلفة متعددة / البروتينات ستكون لتنقيتها على MCPA ثم استبدال لوحة جمع مفتوحة مع لوحة جمع 48 × (5 مل / بئر). ومع ذلك ، عند تشغيل عينات البروتين نفسها فقط على كل عمود ، فلا بأس من الاستمرار في استخدام لوحة جمع مفتوحة.
  4. التحميل والغسيل والغسل
    1. مع فراغ قبالة، تحميل lysates في الأعمدة (كمية lysate سوف تختلف، وعادة من 1 إلى 12 مل أو أكثر، وقد تكون هناك حاجة لتحميل على دفعات عدة). استخدام ستيرر رقيقة من البلاستيك لخلط بلطف الخرز وlysate في العمود لتحقيق أقصى قدر من الربط.
    2. بعد خلط بلطف كل عمود لبضع دقائق، قم بتشغيل مضخة فراغ وتشغيل lysates من خلال الأعمدة. إذا كان يجري تشغيل عينات البروتين متعددة، واستخدام لوحة جمع 48 بئر وتأكد من مبادلة لوحة جمع لوحة أخرى 48 لوحة بئر بعد 4 مل قد ركض من خلال كما الآبار في هذه اللوحات يمكن أن تعقد فقط 4 مل من الحل. متابعة تشغيل lysate حتى يتم تشغيل كافة lysates خلال عمود. تجميد لوحات التجميع التي تحتوي على التدفق.
      ملاحظة: قد تصبح أعمدة "حظر" تسبب lysate تدفق خلال العمود أبطأ بكثير مما يجب. يتم رصد هذا بسهولة كما سوف تتدفق الأعمدة المجاورة بمعدل طبيعي. إذا حدث ذلك، فمن المستحسن أن يتم نقل خليط lysate/resin إلى عمود يحتوي على فلتر جديد.
    3. استبدال لوحة جمع مع لوحة جمع مفتوحة فارغة ثم إضافة 9 أحجام الراتنج (5.4 مل) من 10 mm imidazole غسل العازلة إلى كل عمود وتشغيل الفراغ وتشغيل الغسيل من خلال. كرر هذا 4-5 مرات. لتجنب تجاوز السعة، قم بإخلاء لوحة النفايات بشكل دوري.
      1. ثم استبدل لوحة التجميع بلوحة نظيفة مناسبة (طبق مفتوح لبروتين واحد فقط و96 جيدا إذا كانت هناك بروتينات متعددة ، مما يضمن وجود A1 في الزاوية اليسرى العليا).
    4. باستخدام حقنة مكرر مع حقنة 12.5 مل، ماصة ~ 1 حجم الراتنج (0.75 مل) من إزالة العازلة elution في كل عمود.
    5. لتجنب رغوة البروتين، قم بتشغيل مضخة الفراغ في أدنى إعداد. رفع بلطف MCPA للتحقق من أي شيء يترك بالتنقيط في لوحة جمع.
      ملاحظة: بديل ل eluting مع فراغ أو خطورة هو دفع المكبس حقنة 10 مل في الجزء العلوي من العمود لدفع بلطف العازلة elution من خلال العمود. القيام بذلك لكل عمود، وتوخي الحذر عند إزالة المكبس حقنة عدم تعكير صفو الخرز في الجزء السفلي من العمود. بمجرد أن يتم دفع العازلة elution من خلال، وإزالة بلطف المكبس حقنة من العمود الأخير الذي تم استخدامه في وبدوره لفترة وجيزة على مضخة فراغ لإزالة قطرات الماضي من الأعمدة.
      1. إذا تم استخدام لوحة جمع 96 بئرا ، فتحقق من لوحة التجميع للتأكد من أن ما يتدفق من كل عمود عبر لوحة التنقيط الطويلة يتدفق فقط إلى بئر واحد ولا شيء يتدفق إلى الآبار المجاورة على لوحة التجميع.
    6. ل elution المقبل كرر الخطوات أعلاه 2 وجمع في الطازجة متعددة البئر (عينات مختلفة) أو لوحة جمع مفتوحة (نفس العينات).
    7. خطوة اختيارية، واتخاذ aliquot 50 ميكرولتر من كل elution لتحليل النقاء والتركيز.
    8. إضافة 2 مل من الإيثانول 20٪ إلى كل عمود وتشغيل هذا من خلال استخدام مضخة فراغ. ثم أضف 2 مل أخرى من الإيثانول بنسبة 20٪ إلى الأعمدة واستخدم ستيرر بلاستيكي رقيق طازج لخلط الإيثانول بنسبة 20٪ والخرز قبل نقله إلى أنبوب 50 مل للتخزين عند 4 درجات مئوية. تنظيف الأعمدة والتحقق من أن المياه تتدفق بحرية من خلال كل عمود ومن ثم تنظيف كل شيء ووضع بعيدا للاستخدام في وقت لاحق.
      ملاحظة: بعض الأعمدة أخيرا قد تم حظر عوامل التصفية الخاصة بها ثم سيتم تشغيل ببطء شديد، يجب استبدال هذه الأعمدة أو تنظيف عوامل التصفية. على هذا النحو ، فمن المستحسن لاختبار الفلاتر دوريا عن طريق إزالة الراتنج وملء العمود بالماء لمعرفة ما اذا كان يتدفق بسرعة. يمكن تنظيف المرشحات عن طريق ترك عمود مغلق مليء بحاجز elution المشوه والاهتزاز بين عشية وضحاها.

2. تبادل الأيونات - تنقية البروتين واحد

  1. إعداد المخازن المؤقتة
    ملاحظة: راجع الجدول 1 للحصول على تفاصيل كافة المخازن المؤقتة
    1. إعداد 2 L منخفض الملح العازلة: 10 mM تريس درجة الحموضة 8.1 (5 م تريس حمض, 5 MM تريس قاعدة). حل التصفية باستخدام فلتر 0.22 ميكرومتر.
    2. إعداد 0.5 L الملح العالي العازلة: 10 mM تريس درجة الحموضة 8.1, 4 M NaCl. قياس 116.9 غرام من NaCl، وجعل ما يصل إلى 0.5 لتر مع 10 mM تريس pH 8.1 من فوق. حل التصفية باستخدام فلتر 0.22 ميكرومتر.
  2. صنع سلسلة تركيز الملح: 0-1 M NaCl.
    ملاحظة: يمكن تعديل مجموعة تركيزات الملح لكل بروتين.
    1. إعداد أنابيب الطرد المركزي 24 × 50 مل المسماة في رف
    2. باستخدام المخازن المؤقتة التي تم إجراؤها أعلاه، قم بإعداد تخفيفات NaCl 24 × 14 مل تتراوح بين 0-1000 ميكرومتر. ويمكن القيام بذلك عن طريق زيادات قدرها 25 مليون متر أو 50 مليون متر مربع اعتمادا على البروتين.
    3. ثم أضف وحدات التخزين المطلوبة من 10 mM تريس إلى كل أنبوب. عكس كل أنبوب عدة مرات لخلط.
  3. إعداد العينات
    1. الحصول على عينات لتنقيتها من قبل تبادل أيون. اختياريا، خذ 50 ميكرولتر aliquot للتحليل في وقت لاحق.
      ملاحظة: يجب أن تبقى عينات الباردة دائما; قد تكون هذه lysates ، أو ربما وظيفة ني NTA. نماذج من ني-NTA في إزالة المخازن المؤقتة تتطلب dialyzing أو تبادل المخزن المؤقت في 10 mM تريس المخزن المؤقت. يمكن تخفيف عينات من ني-NTA في المخازن المؤقتة الأصلية مع 10 mM تريس العازلة للحد من تركيز الملح بحيث يمكن ربط البروتين لراتنج IEX.
    2. تدور العينات في 18000 × غرام لمدة 10 دقائق.
    3. صب بعناية قبالة supernatant في قارب الوزن. تجنب إزعاج بيليه.
    4. تناول supernatant بعناية في حقنة 20 مل وإرفاق مرشح 0.22 ميكرومتر.
    5. إخراج supernatant ببطء من خلال مرشح في أنبوب 50 مل جديدة.
    6. إذا كان التخفيف مطلوبا ، فإن المخفف الفائق مع 10 mM Tris buffer المصنوع أعلاه (في هذه التجربة تم تخفيف الفائق 1 في 2). يخزن عند 4 درجة مئوية في هذه الأثناء.
  4. إعداد إعداد تنقية الفراغ وإعداد التوازن
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، يتم استخدام عمود واحد فقط لتنقية IEX لعينة واحدة. للحصول على تنقيات متعددة، راجع القسم التالي.
    1. تحديد نوع الراتنج المطلوب وحجمه. كقاعدة عامة لمدة تصل إلى 20 ملغ من نطاقات SH3 النقية جزئيا ، استخدم 0.4 مل من راتنج التدفق السريع Q-sepharose لكل عمود (انظر الخطوة 2.4.8).
    2. إدراج 24 أعمدة فارغة مفتوحة (فارغة بدون عامل تصفية في الأسفل) في MCPA تجميعها مسبقا. يجب أن تناسب الأعمدة بشكل مريح في ثقوب حصيرة الختم التي تم ثقبها.
    3. ضع المكبس حقنة 10 مل في كل عمود فارغ باستثناء الموضع الأول، حيث سيبدأ تنقية.
    4. ادفع الجزء السفلي من عمود مفتوح (مع فلتر) من خلال طوقا مطاطيا من 5 مل (تم اختراقه) لتشكيل حلقة مطاطية في نهاية العمود. سيضمن هذا الخاتم المطاطي ختما جيدا عند إدخال هذا العمود في كل عمود فارغ أعلاه. في الوقت الحالي، إدراج هذا العمود في العمود الفارغ الأول على MCPA.
    5. تأخذ لوحة جمع مفتوحة ووضع هذه اللوحة في قاعدة فراغ متعددة وقريبة مع الجزء العلوي من متعددة.
    6. وضع MCPA تجميعها (مع الأعمدة) على رأس فراغ متعددة.
    7. إرفاق أنابيب من نظام مضخة فراغ إلى مدخل / فوهة في الجزء السفلي من الفراغ.
    8. قطع طرف ماصة زرقاء ~ 2 سم من أسفل واستخدامها لتولي 800 ميكرولتر من الخرز Q-sepharose (أو أي راتنج تبادل أيونات أخرى)، وضمان أن يتم خلط حل حبة الإيثانول 50/50 لتجنب طبقات. ماصة 800 μL في عمود واحد مفتوح (مع مرشح) في الموقف الأول وبمجرد أن يستقر الخرز إلى الجزء السفلي من الأعمدة التبديل على فراغ بما فيه الكفاية لتشغيل من خلال الإيثانول 20٪.
    9. غسل العمود الذي يحتوي على حبات سيفاروز مع 2 × 2 مل من 10 mM تريس. إيقاف الفراغ قبل أن يمتد المخزن المؤقت Tris لمنع جفاف الراتنج. يمكن تجاهل تشغيل.
      ملاحظة: إذا تم استخدام الراتنج سابقا، تجدد عن طريق الغسيل في 5 أحجام الراتنج من 4 M NaCl ثم 5 أحجام الراتنج من 10 mM تريس قبل الخطوة 2.4.9.
  5. التحميل والغسيل والغسل
    1. نقل جميع عينة لتنقيتها (انظر القسم 3) إلى العمود Q sepharose في الموقف الأول، واستخدام حلقة بلاستيكية صغيرة لتحريك العينة والخرز لحوالي 2 دقيقة قبل التبديل على مضخة فراغ.
      ملاحظة: في حالات الزائدة supernatant (>12 مل) ، حذار من overfilling العمود. السماح للعينة تشغيل من خلال ثم إضافة المزيد، وخلط قبل السماح تشغيل من خلال مرة أخرى.
    2. تخزين/تجميد التدفق إلى الإرشادات التفصيلية للتحليل لاحقا.
    3. ضع لوحة تجميع مفتوحة أخرى في فراغ متعدد ثم اغسل كل عمود سيفاروز مع 2 × 2 مل من 10 mM Tris وتخزينها.
    4. أدخل لوحة تجميع 96 بئرا، وتأكد من وجود A1 في الزاوية اليسرى العليا.
    5. لجمع الكسر elution الأول، وإزالة المكبس حقنة من العمود التالي على طول، نقل العمود Q sepharose في هذا الموقف ووضع المكبس حقنة في الموقف السابق. ثم ماصة 1 مل من تركيز الملح الأول في العمود Q sepharose. بدوره على المضخة وجمع elution. إيقاف تشغيل المضخة تماما كما خطوط السائل بالقرب من الخرز لتجنب تجفيف الخرز.
    6. لجمع كسر elution المقبل، وإزالة المكبس حقنة من العمود التالي على طول، نقل العمود Q sepharose في هذا الموقف ووضع المكبس حقنة في الموقف السابق.
    7. أضف 1 مل من تركيز الملح التالي إلى العمود وكرر العملية حتى يتم استخدام جميع التركيزات وجمع 24 إلوتيون في 24 بئرا منفصلا. تحقق من عدم دخول أي سائل إلى أي آبار مجاورة.
    8. غسل العمود مع 2 مل من 4 M NaCl 10 mM تريس. دع هذا يمر
    9. غسل مع 2 مل من الإيثانول 20٪. السماح الايثانول تشغيل حتى انها فقط فوق الخرز وعمود الختم للتخزين.
    10. تخزين 96 لوحة جمع الآبار وتحليلها عن طريق التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية وSDS PAGE.

3. تبادل الأيونات - تنقية متزامنة من 24 بروتينات مختلفة

ملاحظة: راجع الخطوات 2.1-2.3 للحصول على تفاصيل حول إنشاء مخازن مؤقتة، سلسلة من تركيزات الملح وإعداد العينات

  1. إعداد إعداد التنقية
    ملاحظة: تعتمد كيفية إعداد نظام التنقية إلى حد كبير على عدد البروتينات التي يتم تنقيتها وعدد حالات الملح التي سيتم استخدامها. لتنقية 12 عينة تصل إلى الحد الأقصى من 24 عينة في وقت واحد، مطلوب لوحة جمع لكل تركيز الملح المستخدمة لealute. لأقل من 12 عينة، فمن الممكن لنقل أعمدة الكروماتوغرافيا عدد قليل من المواقف داخل MCPA نفسه قبل تغيير لوحات جمع. في هذه الحالة، ليست هناك حاجة لوضع الأعمدة في أعمدة فارغة، وأنها يمكن أن تعلق مباشرة إلى حصيرة ختم MCPA. البروتوكول أدناه هو لتنقية تبادل الأيونات المتزامنة 24.
    1. ضع MCPA المجمعة المرفقة مباشرة إلى 24 أعمدة فارغة مع مرشحات على رأس فراغ متعددة التي تحتوي على لوحة جمع مفتوحة وإعداد وغسل 24 أعمدة تبادل أيون كما هو الحال في طريقة تنقية واحدة أعلاه. لهذا التنقية، فمن المريح استخدام مكرر Eppendorf أو حقنة لأنابيب بسرعة في الأعمدة.
  2. التحميل والغسيل والغسل
    1. ضع لوحة جمع 48 بئرا في قاعدة المجلد الفراغي قبل تركيب MCPA (مع أعمدة التنقية المغسولة المرفقة). تأكد من وجود A1 في الزاوية اليسرى العليا.
    2. ماصة كل عينة البروتين (تصل إلى 5 مل في وقت واحد) في العمود المقابلة لها. حرك كل عمود باستخدام حلقة بلاستيكية رقيقة (حلقة واحدة لكل عمود لتجنب التلوث) لمدة دقيقتين تقريبا. ثم قم بتشغيل مضخة الفراغ والسماح للتدفق الفائق من خلال.
      ملاحظة: في حالات supernatant الزائدة، حذار من overfilling الأعمدة. دع العينة تمر عبر عمودها ثم أضف المزيد ، والاختلاط قبل السماح بتشغيلها مرة أخرى.
    3. تخزين / تجميد لوحة جمع 48 جيدا لتحليلها في وقت لاحق لأن هذا يحتوي على تدفق لكل بروتين.
    4. ضع لوحة تجميع أخرى من 48 بئرا في المجلد الفراغي ثم اغسل كل عمود سيفاروز ب 2 × 2 مل من 10 mM Tris.
    5. إدراج أول لوحة جمع 96 جيدا في متعددة، وضمان أن A1 هو في الزاوية اليسرى العليا ومن ثم ماصة 1 مل من تركيز الملح الأول في كل عمود ومن ثم تشغيل مضخة فراغ لتشغيل هذا من خلال الأعمدة. إزالة لوحة جمع، وتغطية مع parafilm وتخزينها في 4 °C للتحليل.
    6. كرر خطوة لكل تركيز الملح المتعاقبة المستخدمة لealute. تأكد من استخدام لوحة جمع جديدة لكل طلة وأن كل لوحة تجميع موسومة ومخزنة.
    7. غسل كل عمود مع 2 مل من 10 mM تريس، 4 M NaCl.
    8. غسل كل عمود مع 2 مل من الإيثانول 20٪. السماح الايثانول تشغيل حتى انها فقط فوق الخرز وأعمدة الختم للتخزين.
    9. تخزين 96 لوحات جمع الآبار وتحليلها عن طريق التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية وSDS-PAGE.

النتائج

على سبيل المثال، نجحت MCPA في تنقية 14 متحولة AbpSH3 في ظروف الإزالة عبر Ni-NTA(الشكل 2A). ويمكن رؤية ملوث صغير ~ 25 كيلودا، ولكن البروتين لا يزال نقيا إلى حد كبير. ويعتقد أن هذا الملوث هو يودا، وهو بروتين مشترك مشترك النقاء موجود في الإشريكية القولونية11.

Discussion

الأسلوب قوي وبسيط للاستخدام لعلماء الكيمياء الحيوية البروتين عديم الخبرة نسبيا، ولكن هناك بعض الاعتبارات أن نأخذ في الاعتبار.

تحذير بشأن ملء لوحات التجميع

لوحة جمع 48 جيدا نفسها يحمل فقط 5 مل لكل بئر في حين أن كل 96 جيدا يحمل فقط 2 مل. هذا يحتاج إلى أن يو...

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

تم دعم الأبحاث الواردة في هذا المنشور من قبل جائزة التطوير المؤسسي (IDeA) من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم المنحة P20GM103451 ومنحة بحثية داخلية من جامعة ليفربول.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2 mL/ well collection plateAgilent technologies201240-100
5 mL/ well collection plateAgilent technologies201238-100
12 mL chromatography columnsBio-Rad7311550
96 well long drip plateAgilent technologies200919-100Come with 0.25 um filters which are to be removed.
96 well plate seal/matAgilent technologies201158-100Should be peirceable
His60 Ni Superflow ResinTakara Bio635660
HiTrap Q HP anion exchange columnGE Healthcare (Cytiva)17115301
Lvis plate readerBMG LABTECHCompatible with FLUOstar Omega plate reader
Male leur plugsCole-ParmerEW-45503-70
PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kitSigma-Aldrich575650-U
Reservoir collection plateAgilent technologies201244-100
The Repeater PlusEppendorf2226020With 5 mL and 50 mL syringes
VACUSAFE vacuumINTEGRA158 320The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle

References

  1. Zhang, C., et al. Development of an Automated Mid-Scale Parallel Protein Purification System for Antibody Purification and Affinity Chromatography. Protein Expression and Purification. , 128 (2016).
  2. Renaud, J. P., et al. Biophysics in Drug Discovery: Impact, Challenges and Opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (10), (2016).
  3. Kim, Y., et al. High-throughput Protein Purification and Quality Assessment for Crystallization. Methods (San Diego, Calif). 55 (1), (2011).
  4. Pan, W., Wang, Y. A New Metal Affinity NCTR 25 Tag as a Better Alternative to the His-tag for the Expression of Recombinant Fused Proteins. Protein Expression and Purification. , 164 (2019).
  5. Locatelli-Hoops, S., Sheen, F. C., Zoubak, L., Gawrisch, K., Yeliseev, A. A. Application of HaloTag Technology to Expression and Purification of Cannabinoid Receptor CB2. Protein Expression and Purification. 89 (1), 62-72 (2013).
  6. Pina, A. S., Lowe, C. R., Roque, A. C. A. Challenges and Opportunities in the Purification of Recombinant Tagged Proteins. Biotechnology Advances. 32 (2), (2014).
  7. Gaberc-Porekar, V., Menart, V. Perspectives of Immobilized-Metal Affinity Chromatography. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), (2001).
  8. Anderson, A. C. The Process of Structure-Based Drug Design. Chemistry & Biology. 10 (9), (2003).
  9. Cummin, E., et al. A Simple High-Throughput Purification Method for Hit Identification in Protein Screening. Journal of Immunological Methods. 339 (1), (2008).
  10. Dominguez, M. J., et al. A Multi-Column Plate Adapter Provides an Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System. Protein Expression and Purification. , 152 (2018).
  11. Bolanos-Garcia, V. M., Davies, O. R. Structural Analysis and Classification of Native Proteins From E. Coli Commonly Co-Purified by Immobilised Metal Affinity Chromatography. Biochimica et Biophysica Acta. 1760 (9), (2006).
  12. Ayyar, B. V., Arora, S., Murphy, C., O'Kennedy, R. Affinity Chromatography for Antibody Purification. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , (1129).
  13. Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. Structural Biology and Drug Discovery for Protein-Protein Interactions. Trends in Pharmacological Sciences. 33 (5), (2012).
  14. Grabowski, M., Niedzialkowska, E., Zimmerman, M. D., Minor, W. The Impact of Structural Genomics: the First Quindecennial. Journal of Structural and Functional Genomics. 17 (1), 1-16 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

171 MCPA SH3

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved