Un sistema de purificación de proteínas de alto rendimiento económico y versátil que utiliza un adaptador de placa multicolumna

Resumen

Un adaptador de placa multicolumna permite que las columnas de cromatografía se interconectan con placas de recolección de múltiples pozos para la afinidad paralela o la purificación del intercambio iónico, proporcionando un método económico de purificación de proteínas de alto rendimiento. Se puede utilizar bajo gravedad o vacío produciendo cantidades de miligramos de proteína a través de instrumentación asequible.

Resumen

La purificación de proteínas es imprescindible para el estudio de la estructura y función de las proteínas y generalmente se utiliza en combinación con técnicas biofísicas. También es un componente clave en el desarrollo de nuevas terapias. La era en evolución de la proteómica funcional está alimentando la demanda de purificación de proteínas de alto rendimiento y técnicas mejoradas para facilitar esto. Se planteó la hipótesis de que un adaptador de placa de múltiples columnas (MCPA) puede interconectar múltiples columnas de cromatografía de diferentes resinas con placas de múltiples pozos para la purificación paralela. Este método ofrece un método económico y versátil de purificación de proteínas que se puede utilizar bajo gravedad o vacío, rivalizando con la velocidad de un sistema automatizado. El MCPA se puede utilizar para recuperar los rendimientos de miligramos de proteína por un método asequible y eficiente en el tiempo para su posterior caracterización y análisis. El MCPA se ha utilizado para la purificación de afinidad de alto rendimiento de dominios SH3. El intercambio iónico también se ha demostrado a través del MCPA para purificar la proteína post Ni-NTA cromatografía de afinidad, lo que indica cómo este sistema se puede adaptar a otros tipos de purificación. Debido a su configuración con múltiples columnas, la personalización individual de los parámetros se puede hacer en la misma purificación, inalcanzable por los métodos basados en placas actuales.

Introducción

Las técnicas de purificación de proteínas para lograr cantidades de miligramos de proteínas purificadas son imprescindibles para su caracterización y análisis, especialmente para métodos biofísicos como la RMN. La purificación de proteínas también es fundamental en otras áreas de estudio, como los procesos de descubrimiento de fármacos y los estudios de interacción proteína-proteína; sin embargo, alcanzar tales cantidades de proteína pura puede convertirse en un cuello de botella para estas técnicas^1,2,3. El método principal para la purificación de proteínas es la cromatografía, que incluye una variedad de métodos que se basan en las características individuales de las proteínas y sus etiquetas. En cromatografía de afinidad, las proteínas tienen un motivo proteico o peptídico adicional que funciona como una etiqueta que tiene afinidad por un determinado sustrato en la resina de cromatografía^4. El método de afinidad más común es la cromatografía de afinidad de metales inmovilizados (IMAC) utilizando proteínas his-tagged, mientras que otro método popular es la cromatografía de intercambio iónico que separa las proteínas en función de su carga. Para obtener la mayor pureza, una combinación de cromatografía de afinidad e intercambio iónico se utiliza con frecuencia juntos, por lo general requieren costosos equipos de laboratorio para un alto rendimiento.

La era evolutiva de la proteómica funcional está alimentando la demanda de técnicas de alto rendimiento para purificar no proteínas singulares para análisis específicos, sino un gran número de proteínas simultáneamente para análisis exhaustivos y estudios de genoma completo⁵. La cromatografía de afinidad metálica inmovilizada (IMAC) es uno de los métodos más utilizados para la purificación de proteínas de alto rendimiento⁶,^7, sin^embargo,sus sistemas automatizados son costosos e inasequibles para laboratorios más pequeños⁸. Las alternativas basadas en placas más asequibles que están disponibles actualmente emplean el uso de equipos de laboratorio accesibles, como el vacío. Aunque estos métodos tienen éxito en la mejora de la velocidad de purificación, sólo puede lograr la purificación de alto rendimiento en una escala más pequeña, sólo el rendimiento de proteínas en el rango de microgramos. Estas limitaciones significan que las placas de filtro de 96 pozos preenvasadas (por ejemplo, de GE Healthcare ahora propiedad de Cytiva) no se pueden utilizar antes de las técnicas biofísicas⁹. La cromatografía por gravedad es el método de purificación más rentable; sin embargo, la configuración de múltiples columnas es inconveniente y puede ser propensa a errores para múltiples proteínas.

Se ha desarrollado un adaptador de placa de múltiples columnas (MCPA) y se ha demostrado que ejecuta con éxito y convenientemente columnas de cromatografía de afinidad paralela a la vez para purificar los dominios SH3 de levadura con etiqueta His^10. El MCPA ofrece un método de purificación de alto rendimiento rentable que no depende de una instrumentación costosa. Su diseño flexible puede purificar eficazmente miligramos de proteína por múltiples columnas de cromatografía de afinidad bajo gravedad o variedad de vacío. Además, el tipo de resina, el volumen y otros parámetros se pueden ajustar para cada columna individual para una optimización más rápida. Este estudio demuestra que la cromatografía del intercambio iónico por el MCPA se puede utilizar conjuntamente con la cromatografía de la afinidad por el MCPA para realzar la purificación del dominio Abp1 SH3. Además, hasta 24 proteínas diferentes se pueden separar en paralelo utilizando estos métodos.

Protocolo

1. Cromatografía de Ni-NTA desnaturalizante

1. Preparación de búferes
   Nota : consulte la tabla 1 para obtener detalles de todos los búferes.
   1. Ensañe 500 mL de NaOH de 0,5 M, asegurándose de añadir primero el agua Milli-Q y luego añadiendo el NaOH lentamente mientras el casto está en un agitador. Filtre utilizando un filtro de 0,22 μm.
   2. Preparar 100 mL de sulfato de níquel de 0,1 M y filtrar utilizando un filtro de 0,22 μm.
   3. Preparar 50 mL de imidazol de 2 M y filtrar con un filtro de 0,22 μm.
   4. Preparar y 0,22 μm de filtro 1,5 L de tampón desnaturalizante a pH 8,0 consistente en 5,3 mM de Tris-HCl, 4,7 mM de Tris-base (Tris (hidroximetil)metilamina), 13,7 mM de NaH₂PO_4,86,3 mM de Na₂HPO₄ y 6 M de clorhidrato de guanidina.
   5. Preparar y filtro de 0,22 μm 500 mL de solución tampón de lisis de 10 mM de imidazol disuelto en tampón desnaturalizante (ver 1.1.4) utilizando el caldo de imidazol de 2 M.
   6. Preparar y filtro de 0,22 μm 500 mL de solución tampón de lavado de 10 mM de imidazol disuelto en tampón desnaturalizante (ver 1.1.4) utilizando el caldo de imidazol de 2 M.
   7. Preparar y 0,22 μm de filtro de 500 mL de tampón EDTA de 100 mM, ajustar el pH a 8 utilizando NaOH de 1 M.
   8. Preparar y 0,22 μm de filtro de 500 mL de tampón de elución compuesto por 7 mL de ácido acético glacial al 99% en clorhidrato de guanidina 6 M.
      NOTA: Si utiliza búferes nativos, adáptese según la Tabla 1.
2. Células de Lysing (método de desnaturalización)
   1. Agregue 2 mL de tampón de lisis a cada 1 g de pellets de células de E. coli cosechados que contengan la proteína his-marcada sobreext expresada. Vórtice durante varios minutos hasta que las células se vuelven a suspender. Deje las muestras en un balancín durante 30 minutos a 4 °C.
   2. Centrífuga de pellets lisados a 18.000 x g durante 30 minutos. Mantenga 50 μL a un lado en el congelador de -20 °C para analizar más tarde un gel SDS-PAGE.
   3. Vierta cuidadosamente los sobrenadantes asegurándose de que el pellet no se moleste. Los Lysates deben ser de un color amarillo claro y claro. Si los lysates están nublados, muestra de la centrífuga otra vez; considerar la sonicación si está disponible para degradar el ácido nucleico.
   4. Filtrar los sobrenadantes a través de una columna vacía (sin resina pero con filtro) y recoger en una bandeja de recogida abierta. A continuación, transferir a un tubo para su uso en el paso 1.3.
      NOTA: Si se utilizan los búferes nativos, después del paso 1.2.1, tratar las muestras a 3 ciclos de congelación / descongelación a -80 ° C o proceso por sonicación o prensa francesa para lisear las células.
3. Preparación de la configuración de purificación de vacío y el equilibrio de columnas
   NOTA: Véase Figura 1 para una configuración MCPA con 24 columnas.
   1. Determine cuántas columnas se necesitan, así como el tipo de resina y el volumen deseados. Como regla general para 100 mL de cultivo de autoinducción (~ 2 g pellet) que expresan dominios SH3 marcados con His utilizando plásmidos basados en T7, use 0.6 mL de resina de Ni-NTA por columna para producir aproximadamente 3 mg de proteína de aproximadamente 6 mL de lisato.
   2. Inserte el número deseado de columnas de 12 mL (sin resina pero con filtro) en un MCPA premontado (placa de goteo largo con estera de sellado perforada). Las columnas deben caber perfectamente en los agujeros de la estera de sellado que han sido perforados.
   3. Si se utilizan menos de 24 columnas, cierre los taladros vacíos con una columna cerrada vacía.
   4. Tome una placa de recolección abierta y coloque esta placa en la base del colector de vacío y cierre con la parte superior del colector.
   5. Coloque el MCPA montado con columnas en la parte superior del colector de vacío.
   6. Conecte la tubería de un sistema de bomba de vacío a la entrada / boquilla en la parte inferior del colector de vacío.
   7. Asegúrese de que las perlas de Ni-NTA estén en una solución al 50% con etanol al 20%. Antes de hacer nada con las perlas agitar suavemente / mezclar la solución de perlas / etanol para resuspend uniformemente. Luego, utilizando una pipeta de 5 mL, pipeta 1.2 mL de la solución al 50% en las columnas. Mientras que el pipeteo asegúrese de que las cuentas permanecen completamente mezclados.
   8. Después de pipetear en las 24 columnas, encienda la bomba de vacío y ejecute el etanol al 20% a través de la columna y en la placa de recolección a continuación.
   9. Apague la bomba una vez que todo el etanol al 20% haya pasado a través de todas las columnas (la resina ni-NTA puede tolerar un breve secado si el vacío todavía se aplica después de que el tampón haya pasado a través de la columna). Deseche lo que hay en la placa de recolección abierta en una caja de residuos.
      PRECAUCIÓN: Todos los productos de desecho de las perlas de Ni-NTA son peligrosos, al manipular las cuentas o eliminar los desechos, usar guantes, gafas y otros EPP. Además, deseche todos los residuos de sulfato de níquel en un contenedor separado para su eliminación individual más adelante.
      NOTA: Si la resina es nueva o se ha regenerado recientemente, el resto de estos pasos se pueden ignorar, vaya a la siguiente sección.
   10. Añadir 3 volúmenes de resina (1,8 mL) de tampón EDTA de 100 mM utilizando una jeringa de 20 mL o un dispositivo de jeringa repetidora con una jeringa de 50 mL. Luego encienda la bomba de vacío para dejar que el tampón EDTA se lave y apague la bomba una vez que se haya lavado.
       NOTA: Este lavado debe eliminar el color azul níquel, pero si este no es el caso, repita este paso hasta que todas las columnas hayan perdido su color azul. Apague la bomba y vierta el contenido de la placa de recogida abierta en la caja de residuos.
   11. Agregue 3 volúmenes de resina (1,8 mL) de tampón NaOH de 0,5 M en cada columna antes de encender la bomba y ejecutarla a través de cada columna. Placa de recogida vacía.
   12. Añadir 4 volúmenes de resina (2,4 mL) de sulfato de níquel de 100 mM en cada columna. Encienda la bomba de vacío y ejecute esto a través de la columna una vez más.
   13. Agregue 10 volúmenes de resina (~ 6000 μL) de agua Milli-Q y corra esto a través de las columnas. Apague la bomba y vierta el contenido de la placa de recolección en la caja de residuos.
   14. Lavar las columnas dos veces con 4 volúmenes de resina (2,4 mL) de imidazol de 10 mM en tampón de lavado (desnaturalizante o nativo) cada vez para eliminar cualquier exceso de níquel y equilibrar. Placa de recogida vacía.
       NOTA: Si alguna columna está funcionando significativamente más lento, desconecte la columna y compruebe que el aire se puede empujar a través del MCPA usando una jeringa grande. Si se desbloquea, utilice una columna diferente con un filtro nuevo.
   15. Si se van a purificar varias muestras/proteínas diferentes en el MCPA, reemplace la placa de recolección abierta con una placa de recolección de 48 x (5 mL/pozo). Sin embargo, cuando solo se ejecutan las mismas muestras de proteínas en cada columna, está bien continuar usando una placa de recolección abierta.
4. Carga, lavado y elase
   1. Con el vacío apagado, cargue los lysates en columnas (la cantidad de lysate variará, típicamente de 1 a 12 mL o más y se puede requerir cargar en varios lotes). Use un agitador de plástico delgado para mezclar suavemente las cuentas y el lisato en la columna para maximizar la unión.
   2. Después de mezclar suavemente cada columna durante unos minutos, encienda la bomba de vacío y ejecute los lysates a través de las columnas. Si se están corriendo varias muestras de proteína, use una placa de recolección de 48 pozos y asegúrese de cambiar la placa de recolección por otra placa de 48 pozos después de que 4 mL se haya ejecutado, ya que los pozos en estas placas solo pueden contener 4 mL de solución. Continúe ejecutando lysate hasta que todos los lysates se haya ejecutado a través de una columna. Congele las placas de recogida que contienen el flujo directo.
      Nota: Las columnas pueden convertirse en "bloqueado" haciendo que el lysate fluya a través de la columna mucho más lento de lo que debería. Esto se detecta fácilmente ya que las columnas vecinas fluirán a una velocidad normal. Si esto ocurre, se recomienda que la mezcla de lisato/resina se transfiera a una columna que contenga un filtro fresco.
   3. Reemplace la placa de recolección con una placa de recolección abierta vacía y luego agregue 9 volúmenes de resina (5.4 mL) de tampón de lavado de imidazol de 10 mM a cada columna y encienda el vacío y ejecute el lavado. Repita esto 4-5 veces. Para evitar desbordamientos, vacíe periódicamente la placa de desecho.
      1. Luego reemplace la placa de recolección con una placa limpia apropiada (placa abierta para una sola proteína y 96 bien si hay múltiples proteínas, asegurándose de que A1 esté en la esquina superior izquierda).
   4. Usando una jeringa repetidora con una jeringa de 12.5 mL, pipeta ~ 1 volumen de resina (0.75 mL) de tampón de elución de desnaturalizante en cada columna.
   5. Para evitar la formación de espuma de proteínas, encienda la bomba de vacío en el ajuste más bajo. Levante suavemente el MCPA para comprobar que no queda nada por gotear en la placa de recogida.
      NOTA: Una alternativa a eluting con el vacío o la gravedad es empujar un émbolo de la jeringuilla de 10 ml en la tapa de la columna para empujar suavemente el almacenador intermediario de la elución a través de la columna. Haga esto para cada columna, teniendo cuidado al quitar el émbolo de la jeringa para no molestar las cuentas en la parte inferior de la columna. Una vez que el tampón de elución ha sido empujado a través, retire suavemente el émbolo de la jeringa de la última columna en la que se utilizó y encienda brevemente la bomba de vacío para eliminar las últimas gotas de las columnas.
      1. Si se ha utilizado una placa de recolección de 96 pozos, verifique la placa de recolección para asegurarse de que lo que fluye de cada columna a través de la placa de goteo larga solo fluye hacia un pozo y nada se está elutiendo en los pozos vecinos en la placa de recolección.
   6. Para la siguiente elución repetir los 2 pasos anteriores y recoger en un fresco multi-pozo (diferentes muestras) o placa de recogida abierta (mismas muestras).
   7. Paso opcional, tome una alícuota de 50 μL de cada elución para el análisis de pureza y concentración.
   8. Agregue 2 mL de etanol al 20% a cada columna y ejecute esto a través del uso de la bomba de vacío. Luego agregue otros 2 mL de etanol al 20% a las columnas y use un agitador de plástico delgado y fresco para mezclar el etanol al 20% y las perlas antes de transferirlo a un tubo de 50 mL para su almacenamiento a 4 °C. Limpie las columnas y compruebe que el agua fluya libremente a través de cada columna y luego limpie todo y lo guardará para su uso posterior.
      Nota : algunas columnas finalmente tienen sus filtros bloqueados y se ejecutará demasiado lentamente, estas columnas deben reemplazarse o filtros limpiados. Como tal, se recomienda probar periódicamente los filtros eliminando la resina y llenando la columna con agua para ver si fluye rápidamente. Los filtros se pueden limpiar dejando una columna cerrada llena de búfer de elución de desnaturalizante y agitando durante la noche.

2. Intercambio iónico - Purificación de una sola proteína

1. Preparación de los búferes
   Nota: Consulte la tabla 1 para obtener detalles de todos los búferes
   1. Preparar un tampón bajo en sal de 2 L: 10 mM Tris pH 8.1 (5 mM Tris Acid, 5 mM Tris Base). Solución de filtro utilizando un filtro de 0,22 μm.
   2. Preparar un tampón de sal de 0,5 L de alto contenido: 10 mM Tris pH 8,1, 4 M NaCl. Medir 116,9 g de NaCl y hacer hasta 0,5 L con el 10 mM Tris pH 8,1 desde arriba. Solución de filtro utilizando un filtro de 0,22 μm.
2. Fabricación de series de concentración de sal: 0-1 M NaCl.
   NOTA: El rango de concentraciones de sal se puede ajustar para cada proteína.
   1. Configurar tubos centrífugos etiquetados de 24 x 50 mL en un rack
   2. Usando los tampones hechos anteriormente, prepare diluciones de NaCl de 24 x 14 mL que van desde 0-1000 μM. Comience agregando los volúmenes requeridos de 4 M NaCl 10 mM Tris. Esto podría hacerse por incrementos de 25 mM o 50 mM dependiendo de la proteína.
   3. A continuación, agregue los volúmenes requeridos de 10 mM Tris a cada tubo. Invierta cada tubo varias veces para mezclar.
3. Preparación de muestras
   1. Obtener las muestras a purificar por intercambio iónico. Opcionalmente, tome una alícuota de 50 μL para analizarla más adelante.
      NOTA: Las muestras siempre deben mantenerse frías; estos pueden ser lysates, o tal vez post Ni-NTA. Las muestras de Ni-NTA en tampones de desnaturalización requieren dializado o intercambio de tampón en tampón Tris de 10 mM. Las muestras de Ni-NTA en tampones nativos podrían diluirse con tampón Tris de 10 mM para reducir la concentración de sal de modo que la proteína pueda unirse a la resina IEX.
   2. Hilar muestras a 18.000 x g durante 10 minutos.
   3. Vierta cuidadosamente el sobrenadante en un bote de pesaje. Evite perturbar el pellet.
   4. Tome el sobrenadante cuidadosamente en una jeringa de 20 ml y coloque un filtro de 0,22 μm.
   5. Expulse lentamente el sobrenadante a través del filtro en un tubo fresco de 50 mL.
   6. Si se requiere dilución, diluir el sobrenadante con tampón Tris de 10 mM hecho anteriormente (En este experimento el sobrenadante se diluyó 1 en 2). Conservar a 4 °C mientras tanto.
4. Preparación de la configuración de purificación de vacío y configuración de equilibrio
   Nota : en este protocolo, sólo se utiliza una columna para la purificación IEX de una muestra. Para múltiples purificaciones, consulte la siguiente sección.
   1. Determinar el tipo de resina deseada y el volumen. Como regla general para hasta 20 mg de dominios SH3 parcialmente puros marcados con His, utilice 0,4 mL de resina de flujo rápido Q-sefarosa por columna (ver paso 2.4.8).
   2. Inserte 24 columnas vacías abiertas (vacías sin filtro en la parte inferior) en un MCPA premontado. Las columnas deben caber perfectamente en los agujeros de la estera de sellado que han sido perforados.
   3. Coloque un émbolo de jeringa de 10 ml en cada columna vacía excepto en la primera posición, donde comenzará la purificación.
   4. Empuje la parte inferior de una columna abierta (con filtro) a través de una junta de goma del émbolo de la jeringa de 5 ml (que ha sido perforada) para formar un anillo de goma al final de la columna. Este anillo de goma asegurará un buen sello cuando esta columna se inserta en cada columna vacía anterior. Por ahora, inserte esta columna en la primera columna vacía en el MCPA.
   5. Tome una placa de recolección abierta y coloque esta placa en la base del colector de vacío y cierre con la parte superior del colector.
   6. Coloque el MCPA montado (con columnas) en la parte superior del colector de vacío.
   7. Conecte la tubería de un sistema de bomba de vacío a la entrada / boquilla en la parte inferior del vacío.
   8. Corte una punta de pipeta azul ~ 2 cm de la parte inferior y utilícese para tomar hasta 800 μL de cuentas de Q-sefarosa (o cualquier otra resina de intercambio iónico), asegurándose de que la solución de etanol de perlas 50/50 se mezcle para evitar capas. Pipetee 800 μL en la columna abierta (con filtro) en la primera posición y una vez que las perlas se asienten en la parte inferior de las columnas, encienda el vacío lo suficiente como para pasar por el etanol al 20%.
   9. Lavar la columna que contiene perlas de sefarosa con 2 x 2 mL de 10 mM Tris. Apague el vacío justo antes de que el tampón Tris se ejecute para evitar que la resina se seque. La escorrentía se puede desechar.
      NOTA: Si la resina se ha utilizado previamente, regenerar mediante el lavado en 5 volúmenes de resina de 4 M NaCl y luego 5 volúmenes de resina de 10 mM Tris antes del paso 2.4.9.
5. Carga, lavado y elase
   1. Transfiera toda la muestra a purificar (consulte la sección 3) a la columna de sefarosa Q en la primera posición, use un pequeño bucle de plástico para remover la muestra y las perlas durante aproximadamente ~ 2 minutos antes de encender la bomba de vacío.
      NOTA: En casos de exceso de sobrenadante (>12 mL), tenga cuidado de no rellenar en exceso la columna. Deje que el ejemplo se ejecute y luego agregue más, mezclando antes de dejar correr de nuevo.
   2. Almacenar/Inmovilizar el flujo a través para su análisis posterior.
   3. Coloque otra placa de recolección abierta en el colector de vacío y luego lave cada columna de sefarosa con 2 x 2 mL de 10 mM Tris y guárdelo.
   4. Inserte una placa de recolección de 96 pozos, asegurándose de que A1 esté en la esquina superior izquierda.
   5. Para recoger la primera fracción de elución, retire el émbolo de la jeringa de la siguiente columna, mueva la columna de sefarosa Q a esta posición y coloque el émbolo de la jeringa en la posición anterior. A continuación, pipetear 1 mL de la primera concentración de sal en la columna de sefarosa Q. Encienda la bomba y recoja la elución. Apague la bomba al igual que las líneas de líquido cerca de las perlas para evitar secar las perlas.
   6. Para recoger la siguiente fracción de elución, retire el émbolo de la jeringa de la siguiente columna, mueva la columna de sefarosa Q a esta posición y coloque el émbolo de la jeringa en la posición anterior.
   7. Añadir 1 mL de la siguiente concentración de sal a la columna y repetir el proceso hasta que se hayan utilizado todas las concentraciones y se hayan recogido 24 eluciones en 24 pozos separados. Compruebe que ningún líquido haya entrado en ningún pozo vecino.
   8. Lavar la columna con 2 mL de 4 M NaCl 10 mM Tris. Dejemos que esto se ejecute.
   9. Lavar con 2 mL de etanol al 20%. Deje que el etanol corra hasta que esté justo encima de las perlas y selle la columna para su almacenamiento.
   10. Almacenar 96 placas de recolección de pozos y analizar por espectroscopia UV y SDS PAGE.

3. Intercambio iónico - Purificaciones simultáneas de 24 proteínas diferentes

NOTA: Consulte los pasos 2.1-2.3 para obtener detalles sobre la fabricación de tampones, una serie de concentraciones de sal y la preparación de muestras

1. Preparación de la configuración de purificación
   NOTA: La forma en que se configura el sistema de purificación depende en gran medida de cuántas proteínas se purifiquen y cuántas condiciones de sal se usarán. Para purificar 12 muestras hasta el máximo de 24 muestras simultáneamente, se requiere una placa de recolección para cada concentración de sal utilizada para eluir. Para menos de 12 muestras, es posible mover las columnas de cromatografía unas cuantas posiciones dentro del mismo MCPA antes de cambiar las placas de recolección. En este caso, no hay necesidad de colocar las columnas en columnas vacías y se pueden conectar directamente a la alfombrilla de sellado MCPA. El siguiente protocolo es para 24 purificaciones simultáneas de intercambio iónico.
   1. Coloque el MCPA montado directamente conectado a 24 columnas vacías con filtros en la parte superior del colector de vacío que contiene una placa de recolección abierta y prepare y lave 24 columnas de intercambio iónico como en el método de purificación único anterior. Para esta purificación, es conveniente usar un repetidor Eppendorf o una jeringa para pipetear rápidamente en columnas.
2. Carga, lavado y elase
   1. Coloque una placa de recolección de 48 pozos en la base del colector de vacío antes de colocar el MCPA (con las columnas de purificación lavadas conectadas). Asegúrese de que A1 esté en la esquina superior izquierda.
   2. Pipetee cada muestra de proteína (hasta 5 mL a la vez) en su columna correspondiente. Revuelva cada columna usando un lazo de plástico delgado (un bucle para cada columna para evitar la contaminación) durante aproximadamente 2 minutos. Luego encienda la bomba de vacío y deje que el sobrenadante fluya a través.
      Nota: En casos de exceso de sobrenadante, tenga cuidado de rellenar en exceso las columnas. Deje que el ejemplo se ejecute a través de su columna y luego agregue más, mezclando antes de dejar correr de nuevo.
   3. Almacene/Congele la placa de recolección de 48 pozos para su posterior análisis, ya que contiene el flujo a través de cada proteína.
   4. Coloque otra placa de recolección de 48 pocillos en el colector de vacío y luego lave cada columna de sefarosa con 2 x 2 mL de Tris de 10 mM.
   5. Inserte la primera placa de recolección de 96 pozos en el colector, asegurándose de que A1 esté en la esquina superior izquierda y luego pipetee 1 mL de la primera concentración de sal en cada columna y luego encienda la bomba de vacío para ejecutarla a través de las columnas. Retire la placa de recolección, cubra con parafilm y guárdelo a 4 °C para su análisis.
   6. Repita el paso para cada concentración de sal sucesiva utilizada para eluir. Asegúrese de que se utiliza una nueva placa de recolección para cada elución y que cada placa de recolección está etiquetada y almacenada.
   7. Lavar cada columna con 2 mL de 10 mM Tris, 4 M NaCl.
   8. Lavar cada columna con 2 mL de etanol al 20%. Deje que el etanol corra hasta que esté justo encima de las perlas y selle las columnas para su almacenamiento.
   9. Almacene 96 placas de recolección de pozos y analice por espectroscopia UV y SDS-PAGE.

Resultados

Como ejemplo, el MCPA ha purificado con éxito 14 mutantes AbpSH3 en condiciones de desnaturalización a través de Ni-NTA (Figura 2A). Un pequeño contaminante ~ 25 kDa se puede ver, sin embargo, la proteína sigue siendo en gran parte pura. Se cree que este contaminante es YodA, una proteína co-purificada común que se encuentra en E. coli^11. La Figura 2B muestra la purificación de 11 dominios SH3 diferentes en condi...

Discusión

El método es robusto y fácil de usar para bioquímicos de proteínas relativamente inexpertos, sin embargo, hay algunas consideraciones a tener en cuenta.

Precaución sobre el sobrellenado de placas de recogida

La placa de recolección de 48 pozos en sí solo tiene 5 mL por pozo, mientras que cada 96 pozos solo tiene 2 mL. Esto debe tenerse en cuenta al agregar el búfer y ejecutar la muestra a través de la columna, ya que existe el riesgo de lle...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL/ well collection plate	Agilent technologies	201240-100
5 mL/ well collection plate	Agilent technologies	201238-100
12 mL chromatography columns	Bio-Rad	7311550
96 well long drip plate	Agilent technologies	200919-100	Come with 0.25 um filters which are to be removed.
96 well plate seal/mat	Agilent technologies	201158-100	Should be peirceable
His60 Ni Superflow Resin	Takara Bio	635660
HiTrap Q HP anion exchange column	GE Healthcare (Cytiva)	17115301
Lvis plate reader	BMG LABTECH		Compatible with FLUOstar Omega plate reader
Male leur plugs	Cole-Parmer	EW-45503-70
PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kit	Sigma-Aldrich	575650-U
Reservoir collection plate	Agilent technologies	201244-100
The Repeater Plus	Eppendorf	2226020	With 5 mL and 50 mL syringes
VACUSAFE vacuum	INTEGRA	158 320	The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle