使用多柱板适配器的经济性和多功能性高通量蛋白质净化系统

摘要

多柱板适配器允许色谱柱与多井收集板接口，用于平行亲和力或离子交换纯化，提供经济的高通量蛋白质纯化方法。它可以通过负担得起的仪器在重力或真空下产生毫克蛋白质。

摘要

蛋白质纯化是蛋白质结构和功能研究的必要条件，通常与生物物理技术相结合使用。它也是开发新疗法的关键组成部分。功能蛋白质组学的不断发展时代正在推动对高通量蛋白质纯化的需求，并改进了技术来促进这一需求。据推测，多柱板适配器（MCPA）可以将不同脂质的多个色谱柱与多井板对接，进行平行净化。这种方法提供了一种经济且多才多艺的蛋白质纯化方法，可在重力或真空下使用，与自动化系统的速度相媲美。MCPA可以用来通过一种经济实惠且省时的方法回收蛋白质的毫克产量，用于后续的定型和分析。MCPA 已用于 SH3 域的高吞吐量亲和力纯化。离子交换也通过MCPA证明净化蛋白质后Ni-NTA亲和色谱，表明该系统如何可以适应其他纯化类型。由于其设置具有多个列，参数的单独自定义可以在同一纯化中进行，目前基于板的方法无法实现。

引言

蛋白质纯化技术，以达到毫克的纯化蛋白质的数量是必不可少的，他们的特征和分析，特别是生物物理方法，如NMR。蛋白质纯化也是其他研究领域的核心，如药物发现过程和蛋白质-蛋白质相互作用研究：然而，实现如此数量的纯蛋白质可以成为这些技术^{的瓶颈1，2，3。}蛋白质纯化的主要方法是色谱法，它包括各种依靠蛋白质的个体特征及其标签的方法。在亲和色谱中，蛋白质有一个额外的蛋白质或肽图案，作为一个标签，对色谱树脂⁴上的某一基质有亲和力。最常见的亲和力方法是使用他标记的蛋白质固定金属亲和力色谱 （IMAC），而另一种流行的方法是离子交换色谱，根据蛋白质的电荷分离蛋白质。对于最高的纯度，亲和色谱和离子交换的组合经常一起使用，通常需要昂贵的实验室设备来获得高通量。

功能蛋白质组学时代的发展正在推动对高通量技术的需求，以纯化不是单一的蛋白质进行特定分析，而是同时大量蛋白质进行综合分析和基因组广泛研究^。固定金属亲和色谱 （IMAC） 是高通量蛋白质纯化⁶、⁷最广泛使用的方法之一^，但其自动化系统对于较小的实验室

研究方案

1. 否认尼-NTA色谱

1. 准备缓冲区
   注：有关所有缓冲器的详细信息，请参阅表 1。
   1. 组成 500 毫升的 0.5 M NaOH，确保先添加 Milli-Q 水，然后在烧嘴在搅拌器上时缓慢添加 NaOH。使用 0.22 μm 过滤器进行筛选。
   2. 使用 0.22 μm 过滤器准备 100 mL 的 0.1 M 镍硫酸盐和过滤器。
   3. 使用 0.22 μm 过滤器准备 50 mL 的 2 M 伊米达佐尔和过滤器。
   4. 准备和 0.22 μm 过滤器 1.5 L 的 变性缓冲在 pH 8.0 包括 5.3 mM 特里斯 -HCl， 4.7 mM 三基（三磷（羟基甲基）甲基胺），13.7 m M NaH₂PO_4，86.3 mM 纳₂HPO₄ 和 6 M 盐酸瓜尼丁。
   5. 准备和 0.22 μm 过滤器 500 mL 的 裂解缓冲 液溶解在脱硝缓冲 （见 1.1.4） 使用 2 M imidazole 股票。
   6. 准备和 0.22 μm 过滤器 500 mL 的 洗涤缓冲 液 10 mm imidazole 溶解在凹陷缓冲区 （见 1.1.4） 使用 2 M imidazole 库存.

结果

例如，MCPA通过Ni-NTA（图2A）成功地在变性条件下净化了14个AbpSH3突变体。可以看到一种小污染物~25 kDa，但蛋白质基本上仍然是纯的。这种污染物被认为是YodA，一种常见的共同纯化蛋白，发现于大肠杆菌^11。图 2B显示了 11 个不同的 SH3 域在原生条件下的净化。在致变条件下看到的小污染物在原生条件下被去除。这表明 MCPA ?.......

讨论

该方法是稳健和简单的使用相对缺乏经验的蛋白质生物化学家，但也有一些考虑要记住。

小心过度填充收集板

48 井收集板本身每口井仅容纳 5 mL，而每口 96 井仅持有 2 mL。在添加缓冲区并在列中运行样品时，需要牢记这一点，因为存在油井过多的风险。特别是，在将较大的样品转移到色谱柱进行净化时，需要小心谨慎。在超标超标的情况下?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL/ well collection plate	Agilent technologies	201240-100
5 mL/ well collection plate	Agilent technologies	201238-100
12 mL chromatography columns	Bio-Rad	7311550
96 well long drip plate	Agilent technologies	200919-100	Come with 0.25 um filters which are to be removed.
96 well plate seal/mat	Agilent technologies	201158-100	Should be peirceable
His60 Ni Superflow Resin	Takara Bio	635660
HiTrap Q HP anion exchange column	GE Healthcare (Cytiva)	17115301
Lvis plate reader	BMG LABTECH		Compatible with FLUOstar Omega plate reader
Male leur plugs	Cole-Parmer	EW-45503-70
PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kit	Sigma-Aldrich	575650-U
Reservoir collection plate	Agilent technologies	201244-100
The Repeater Plus	Eppendorf	2226020	With 5 mL and 50 mL syringes
VACUSAFE vacuum	INTEGRA	158 320	The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle