Çok Sütunlu Plaka Adaptörü Kullanan Ekonomik ve Çok Yönlü Yüksek Verimli Protein Arıtma Sistemi

Özet

Çok sütunlu plaka adaptörü, kromatografi sütunlarının paralel benzeşim veya iyon değişimi saflaştırması için çok kuyulu toplama plakalarıyla arayüzlenmesini sağlayarak ekonomik yüksek verimli protein saflaştırma yöntemi sağlar. Uygun fiyatlı enstrümantasyon yoluyla miligram protein miktarı sağlayan yerçekimi veya vakum altında kullanılabilir.

Özet

Protein saflaştırma, protein yapısı ve fonksiyonunun incelenmesi için zorunludur ve genellikle biyofizik tekniklerle birlikte kullanılır. Ayrıca yeni terapötiklerin geliştirilmesinde önemli bir bileşendir. Fonksiyonel proteomiklerin gelişen çağı, bunu kolaylaştırmak için yüksek verimli protein saflaştırma ve gelişmiş tekniklere olan talebi körüklüyor. Çok sütunlu plaka adaptörünün (MCPA) paralel saflaştırma için çok kuyulu plakalarla farklı reçinelerin birden fazla kromatografi sütununu arayüzleyebileceği varsayıldı. Bu yöntem, otomatik bir sistemin hızına rakip olarak yerçekimi veya vakum altında kullanılabilen ekonomik ve çok yönlü bir protein saflaştırma yöntemi sunar. MCPA, sonraki karakterizasyon ve analiz için uygun fiyatlı ve zaman verimli bir yöntemle miligram protein verimini geri kazanmak için kullanılabilir. MCPA, SH3 etki alanlarının yüksek verimli benzeşimlilik saflaştırılması için kullanılmıştır. İyon değişimi, Ni-NTA benzeşim kromatografisi sonrası proteini saflaştırmak için MCPA aracılığıyla da gösterilmiştir ve bu sistemin diğer saflaştırma türlerine nasıl uyarlanabilebileceğini gösterir. Birden fazla sütunla kurulumu nedeniyle, parametrelerin bireysel olarak özelleştirilmesi, mevcut plaka tabanlı yöntemlerle elde edilemeyen aynı saflaştırmada yapılabilir.

Giriş

Miligram miktarlarda saflaştırılmış protein elde etmek için protein saflaştırma teknikleri, özellikle NMR gibi biyofiziksel yöntemler için karakterizasyon ve analizleri için zorunludur. Protein saflaştırma, ilaç keşif süreçleri ve protein-protein etkileşim çalışmaları gibi diğer çalışma alanlarında da merkezidir; bununla birlikte, bu miktarda saf protein elde etmek, bu teknikler için bir darboğaz^halinegelebilir 1^,2,3. Protein saflaştırmanın temel yöntemi, proteinlerin ve etiketlerinin bireysel özelliklerine dayanan çeşitli yöntemler içeren kromatografidir. Benzeşim kromatografisinde, proteinler kromatografi reçinesi üzerinde belirli bir substrata benzeyen bir etiket olarak çalışan ek bir protein veya peptit motifine sahiptir⁴. En yaygın benzeşim yöntemi, His etiketli proteinleri kullanan hareketsiz metal benzeşim kromatografisidir (IMAC), bir diğer popüler yöntem ise proteinleri yüklerine göre ayıran iyon değişimi kromatografisidir. En yüksek saflık için, benzeşim kromatografisi ve iyon değişiminin bir kombinasyonu sıklıkla birlikte kullanılır ve genellikle yüksek verim için pahalı laboratuvar ekipmanı gerektirir.

Fonksiyonel proteomiklerin gelişen çağı, belirli analizler için tekil proteinleri değil, kapsamlı analiz ve genom geniş çalışmaları için aynı anda çok sayıda proteini arındırmak için yüksek verimli tekniklere olan talebi körüklüyor⁵. Hareketsiz metal benzeşimi kromatografisi (IMAC), yüksek verimli protein saflaştırma⁶,⁷ için en yaygın kullanılan yöntemlerden^biridir,ancak otomatik sistemleri daha küçük laboratuvarlar için maliyetli ve uygun değildir⁸. Şu anda mevcut olan daha uygun fiyatlı plaka tabanlı alternatifler, vakum gibi erişilebilir laboratuvar tabanlı ekipmanların kullanımını kullanır. Bu yöntemler saflaştırma hızını artırmada başarılı olsa da, sadece daha küçük ölçekte yüksek verimli saflaştırma elde edebilir, sadece mikrogram aralığında protein verebilir. Bu sınırlamalar, önceden paketlenmiş 96 kuyu filtre plakasının (örneğin, şu anda Cytiva'ya ait olan GE Healthcare'den) biyofizik tekniklerden önce kullanılamayacağı anlamına gelir⁹. Yerçekimi kromatografisi en uygun maliyetli saflaştırma yöntemidir; ancak, birden fazla sütun kurmak sakıncalı ve birden fazla protein için hataya eğilimli olabilir.

Çok sütunlu bir plaka adaptörü (MCPA) geliştirilmiştir ve etiketli maya SH3 etki alanlarını arındırmak için paralel benzeşim kromatografi sütunlarını aynı anda başarılı ve rahat bir şekilde çalıştırdığı kanıtlanmıştır¹⁰. MCPA, maliyetli enstrümantasyona bağlı olmayan uygun maliyetli yüksek verimli saflaştırma yöntemi sunar. Esnek tasarımı, miligram proteini yerçekimi veya vakum manifoldu altında birden fazla benzeşim kromatografi kolonu ile etkili bir şekilde saflaştırabilir. Ayrıca, daha hızlı iyileştirme için her bir sütun için reçine türü, hacmi ve diğer parametreler ayarlanabilir. Bu çalışma, MCPA tarafından iyon değişim kromatografisinin, ABP1 SH3 alanının saflaştırılmasını geliştirmek için MCPA tarafından benzeşim kromatografisi ile birlikte kullanılabileceğini göstermektedir. Ayrıca, bu yöntemler kullanılarak paralel olarak 24 farklı protein ayrılabilir.

Protokol

1. Denatüre Ni-NTA kromatografisi

1. Arabellekler hazırlanıyor
   NOT: Tüm arabelleklerin ayrıntıları için Tablo 1'e bakın.
   1. 500 mL 0,5 M NaOH'u yapın, önce Milli-Q suyunu eklediğinizden emin olun ve ardından beher bir karıştırıcı üzerindeyken NaOH'u yavaşça ekleyin. 0,22 μm filtre kullanarak filtreleyin.
   2. 0,22 μm filtre kullanarak 100 mL 0,1 M nikel sülfat ve filtre hazırlayın.
   3. 50 mL 2 M imidazol hazırlayın ve 0,22 μm filtre kullanarak filtreleyin.
   4. 5,3 mM Tris-HCl'den oluşan pH 8,0'da 0,22 μm filtre 1,5 L denatüre tampon hazırlayın, 4.7 mM Tris-baz (Tris (hidroksimetil)metilamin), 13.7 mM NaH₂PO₄, 86.3 mM Na₂HPO₄ ve 6 M guanidin hidroklorür.
   5. 2 M imidazol stoğu kullanılarak denatüre tamponunda çözünmüş 10 mM imidazol lizoz tampon çözeltisinin 0,22 μm filtresini hazırlayın ve 500 mL'lik liziz tampon çözeltisi hazırlayın (bkz. 1,1,4).
   6. 2 M imidazol stoğu kullanılarak denatüre tamponunda çözünmüş 10 mM imidazol yıkama tampon çözeltisinin 0,22 μm filtresini hazırlayın ve 500 mL'lik yıkama tampon çözeltisi hazırlayın (bkz. 1,1,4).
   7. 100 mM EDTA tamponunun 500 mL'lik filtresini hazırlayın ve 0,22 μm filtreleyin, 1 M NaOH kullanarak pH'ı 8'e ayarlayın.
   8. 6 M guanidin hidroklorür içine 7 mL% 99 buzul asetik asitten oluşan 0,22 μm filtre 500 mL elution tampon hazırlayın.
      NOT: Yerel arabellekler kullanıyorsanız, Tablo 1'egöre uyarlanın.
2. Hücreleri lysing (denatüre etme yöntemi)
   1. Aşırı eksprese edilmiş His etiketli proteini içeren her 1 g hasat edilen E. coli hücre peletlerine 2 mL lizis tamponu ekleyin. Hücreler yeniden askıya alınana kadar birkaç dakika girdap. Numuneleri 4 °C'de 30 dakika boyunca bir rocker üzerinde bırakın.
   2. Santrifüj, 30 dakika boyunca 18.000 x g'da peletleri boyadı. Daha sonra bir SDS-PAGE jel üzerinde analiz etmek için -20 °C dondurucuda 50 μL'yi bir kenara bırakın.
   3. Peletin bozulmamasını sağlamak için süpernatantları dikkatlice dökün. Lysates açık, açık sarı bir renk olmalıdır. Lisatlar bulutluysa, santrifüj tekrar örneklenir; nükleik asidi bozmak için varsa sonication düşünün.
   4. Süpernatantları boş bir sütundan (reçinesiz ancak filtreyle) filtreleyin ve açık bir toplama tepsisinde toplayın. Ardından 1.3.
      NOT: Yerel tamponları kullanıyorsanız, 1.2.1 adımından sonra, örnekleri -80 °C'de 3 donma/çözülme döngüsüne tedavi edin veya sonication veya French Press ile hücreleri iyse.
3. Vakumlu arıtma kurulumunun hazırlanması ve sütunların dengelenmesi
   NOT: Bkz. Şekil 1 24 sütunlu bir MCPA kurulumu için.
   1. İstenen reçine türü ve hacminin yanı sıra kaç sütun gerektiğini belirleyin. T7 tabanlı plazmidler kullanarak His etiketli SH3 alan adlarını ifade eden 100 mL otoindüksiyon kültürü (~2 g pelet) için bir kural olarak, yaklaşık 6 mL lysate'den yaklaşık 3 mg protein elde etmek için sütun başına 0,6 mL Ni-NTA reçinesi kullanın.
   2. İstediğiniz sayıda 12 mL sütunu (reçinesiz ancak filtreli) önceden monte edilmiş bir MCPA'ya (delinmiş sızdırmazlık paspaslı uzun damlama plakası) yerleştirin. Kolonlar, delinmiş sızdırmazlık paspasının deliklere sıkıca oturmalıdır.
   3. 24'ten az sütun kullanılıyorsa, boş açık bir sütunla boş delikleri kapatın.
   4. Açık bir toplama plakası alın ve bu plakayı vakum manifoldunun tabanına koyun ve manifoldun üst kısmıyla kapatın.
   5. Monte edilmiş MCPA'yı sütunlarla vakum manifoldunun üzerine yerleştirin.
   6. Vakum pompası sisteminden boruyu vakum manifoldunun altındaki giriş/nozüle takın.
   7. Ni-NTA boncuklarının% 20 etanol ile% 50 çözeltide olduğundan emin olun. Boncuklarla herhangi bir şey yapmadan önce, boncuk / etanol çözeltisini eşit şekilde yeniden çıkarmak için hafifçe çalkalayın / karıştırın. Daha sonra, 5 mL pipet kullanarak, sütunlara% 50 çözeltinin pipet 1.2 mL'si. Pipetleme yaparken boncukların tamamen karışık kaldığından emin olun.
   8. 24 sütunun tümüne pipetleme yaptıktan sonra vakum pompasını açın ve% 20 etanol'ü kolondan geçirip aşağıdaki toplama plakasına çalıştırın.
   9. Tüm %20 etanol tüm kolonlardan geçtikten sonra pompayı kapatın (Ni-NTA reçinesi, tampon kolondan geçtikten sonra vakum hala uygulanırsa kısa süreli kurutulması tolere edebilir). Açık toplama plakasındakileri bir atık kutusuna atın.
      DİkKAT: Ni-NTA boncuklarından gelen tüm atık ürünler, boncukları işlerken veya atıkları bertaraf ederken, eldiven, gözlük ve diğer KKD'leri takarken tehlikelidir. Ayrıca, tüm Nikel Sülfat atıklarını daha sonra bireysel bertaraf için ayrı bir kaba atın.
      NOT: Reçine yeniyse veya yakın zamanda yeniden yenileniyorsa, bu adımların geri kalanı yoksayılabilir, sonraki bölüme geçin.
   10. 20 mL şırınna veya 50 mL şırınnalı bir tekrarlayıcı şırınna cihazı kullanarak 100 mM EDTA tamponunun 3 reçine hacmini (1,8 mL) ekleyin. Ardından vakum pompasını açarak EDTA tamponu yıkansın ve yıkandıktan sonra pompayı kapatın.
       NOT: Bu yıkama nikel mavisi rengini kaldırmalıdır, ancak durum böyle değilse, tüm sütunlar mavi rengini kaybedene kadar bu adımı tekrarlayın. Pompayı kapatın ve açık toplama plakasının içeriğini atık kutusuna dökün.
   11. Pompayı açmadan ve bunu her sütunda çalıştırmadan önce her sütuna 0,5 M NaOH tamponunun 3 reçine hacmini (1,8 mL) ekleyin. Boş toplama plakası.
   12. Her sütuna 100 mM nikel sülfat 4 reçine hacmi (2,4 mL) ekleyin. Vakum pompasını açın ve bunu bir kez daha kolondan geçirin.
   13. 10 reçine hacmi (~6000 μL) Milli-Q suyu ekleyin ve bunu sütunlardan geçirin. Pompayı kapatın ve toplama plakasının içeriğini atık kutusuna dökün.
   14. Fazla nikel ve equilibrate kaldırmak için sütunları her seferinde yıkama tamponunda (denatüre veya doğal) 10 mM imidazolden 4 reçine hacmi (2,4 mL) ile iki kez yıkayın. Boş toplama plakası.
       NOT: Herhangi bir sütun önemli ölçüde daha yavaş çalışıyorsa, sütunu ayırın ve havayı kontrol edin büyük bir şırınna kullanılarak MCPA'dan itilebilir. Bu engel kaldırılmışsa, yeni filtreli farklı bir sütun kullanın.
   15. MCPA'da birden fazla farklı numune/protein saflaştırılacaksa, açık toplama plakasını 48 x (5 mL/kuyu) toplama plakası ile değiştirin. Bununla birlikte, her sütunda sadece aynı protein örneklerini çalıştırırken, açık bir toplama plakası kullanarak devam etmek iyidir.
4. Yükleme, yıkama ve eluting
   1. Vakum kapalıyken, lisatları sütunlara yükleyin (lysat miktarı genellikle 1 ila 12 mL veya daha fazla değişecektir ve birkaç toplu iş halinde yüklenmesi gerekebilir). Bağlamayı en üst düzeye çıkarmak için boncukları ve sütundaki lisatları hafifçe karıştırmak için ince bir plastik karıştırıcı kullanın.
   2. Her sütunu birkaç dakika hafifçe karıştırdıktan sonra vakum pompasını çalıştırın ve lysates'i kolonlardan geçirin. Birden fazla protein örneği çalıştırılıyorsa, 48 kuyu toplama plakası kullanın ve bu plakalardaki kuyular sadece 4 mL çözelti tutabildiğinden, 4 mL geçtikten sonra toplama plakasını başka bir 48 kuyu plakası ile değiştirdiğinizden emin olun. Tüm lysates bir sütunda çalıştırılana kadar lysate çalıştırmaya devam edin. Akış içeren toplama plakalarını dondurun.
      NOT: Sütunlar "engellenebilir" ve bu da lilatın sütundan olması gerekenden çok daha yavaş akmasına neden olabilir. Komşu sütunlar normal bir hızda akacağı için bu kolayca fark edilir. Bu durumda, lisat/reçine karışımının taze filtre içeren bir sütuna aktarılması önerilir.
   3. Toplama plakasını boş bir açık toplama plakası ile değiştirin ve ardından her kolona 10 mM imidazol yıkama tamponu 9 reçine hacmi (5,4 mL) ekleyin ve vakumu açın ve yıkamayı çalıştırın. Bunu 4-5 kez tekrarlayın. Taşma önlemek için, periyodik olarak boş atık plakası.
      1. Daha sonra toplama plakasını temiz ve uygun bir plaka ile değiştirin (sadece bir protein için açık plaka ve birden fazla protein varsa 96 kuyu, A1'in sol üst köşede olmasını sağlayın).
   4. 12,5 mL şırınna ile bir tekrarlayıcı şırınna kullanarak, pipet ~1 reçine hacmi (0,75 mL) her sütuna elütüre arabellek.
   5. Protein köpürmesini önlemek için vakum pompasını en düşük ayarda açın. Toplama plakasına damlatacak hiçbir şey kalmamasını kontrol etmek için MCPA'yı hafifçe kaldırın.
      NOT: Vakum veya yerçekimi ile elde etmeye bir alternatif, 10 mL'lik bir şırınna pistonunu sütunun üstüne iterek elution tamponunu sütundan hafifçe itmektir. Bunu her sütun için yapın, sütunun altındaki boncukları rahatsız etmemek için şırınna pistonunu çıkarırken dikkatli olun. Elution tamponu itildikten sonra, şırıngam pistonunu kullanıldığı son sütundan hafifçe çıkarın ve kolonlardan son damlaları çıkarmak için vakum pompasını kısa bir süre açın.
      1. 96 kuyulu bir toplama plakası kullanılmışsa, her sütundan uzun damlama plakasından akan şeyin sadece bir kuyuya aktığından ve toplama plakasındaki komşu kuyulara hiçbir şeyin kaçmıyor olduğundan emin olmak için toplama plakasını kontrol edin.
   6. Bir sonraki elution için yukarıdaki 2 adımı tekrarlayın ve taze bir çok kuyulu (farklı numuneler) veya açık toplama plakasında (aynı numuneler) toplayın.
   7. İsteğe bağlı adım, saflık ve konsantrasyon analizi için her bir elution'dan 50 μL aliquot alın.
   8. Her kolona 2 mL% 20 etanol ekleyin ve vakum pompasını kullanarak bunu çalıştırın. Daha sonra sütunlara 2 mL daha % 20 etanol ekleyin ve 4 ° C'de depolama için 50 mL'lik bir tüpe aktarmadan önce% 20 etanol ve boncukları karıştırmak için taze ince bir plastik karıştırıcı kullanın. Sütunları temizleyin ve suyun her sütundan serbestçe akıp aktığını kontrol edin ve ardından her şeyi temizleyin ve daha sonra kullanmak üzere yerine koyun.
      NOT: Bazı sütunların filtreleri sonunda engellenir ve çok yavaş çalışır, bu sütunlar değiştirilmelidir veya filtreler temizlenir. Bu nedenle, hızlı bir şekilde akıp aktığını görmek için reçineyi çıkararak ve sütunu suyla doldurarak filtrelerin periyodik olarak test etmesi önerilir. Filtreler, denatüre elution tamponu ile dolu kapalı bir sütun bırakılarak ve bir gecede sallanarak temizlenebilir.

2. İyon Değişimi - Tek protein saflaştırma

1. Arabellekler hazırlanıyor
   NOT: Tüm arabelleklerin ayrıntıları için Tablo 1'e bakın
   1. 2 L düşük tuz tamponu hazırlayın: 10 mM Tris pH 8.1 (5 mM Tris Asit, 5 mM Tris Tabanı). 0,22 μm filtre kullanarak filtre çözeltisi.
   2. 0,5 L yüksek tuz tamponu hazırlayın: 10 mM Tris pH 8,1, 4 M NaCl. 116,9 g NaCl ölçün ve yukarıdan 10 mM Tris pH 8,1 ile 0,5 L'ye kadar yapın. 0,22 μm filtre kullanarak filtre çözeltisi.
2. Tuz konsantrasyon serisi yapma: 0-1 M NaCl.
   NOT: Tuz konsantrasyonları aralığı her protein için ayarlanabilir.
   1. Bir rafta 24 x 50 mL etiketli santrifüj tüpleri kurulum
   2. Yukarıda yapılan tamponları kullanarak, 0-1000 μM arasında değişen 24 x 14 mL NaCl seyreltmeleri hazırlayın. Bu, proteine bağlı olarak 25 mM veya 50 mM'lik artışlarla yapılabilir.
   3. Ardından her tüpe gerekli 10 mM Tris hacimlerini ekleyin. Karıştırmak için her tüpü birkaç kez ters çevirin.
3. Numuneler hazırlanıyor
   1. İyon değişimi ile arındırılacak numuneleri alın. İsteğe bağlı olarak, daha sonra analiz için 50 μL aliquot alın.
      NOT: Numuneler her zaman soğuk tutulmalıdır; bunlar lysates olabilir veya Ni-NTA sonrası olabilir. Denatüre tamponlarda Ni-NTA'dan alınan numuneler, 10 mM Tris tamponunda çaprazlama veya tampon değişimi gerektirir. Ni-NTA'dan yerel tamponlardaki örnekler, proteinin IEX reçinesine bağlanabilmesi için tuz konsantrasyonu azaltmak için 10 mM Tris tamponu ile seyreltilebilir.
   2. 10 dakika boyunca 18.000 x g'da dönüş örnekleri.
   3. Süpernatantı dikkatlice bir tartım teknesine dökün. Peletin rahatsız edilmesine karşı kaçının.
   4. Üst yapıyı dikkatlice 20 mL şırınnaya alın ve 0,22 μm filtre takın.
   5. Süpernatant'ı filtreden yavaşça 50 mL'lik yeni bir tüpe atın.
   6. Seyreltme gerekiyorsa, yukarıda yapılan 10 mM Tris tamponu ile süpernatantı seyreltin (Bu deneyde süpernatant 2'de 1 seyreltildi). Bu arada 4 °C'de saklayın.
4. Vakumlu arıtma kurulumu ve denge kurulumunun hazırlanması
   NOT: Bu iletişim kuralında, bir örneğin IEX saflaştırılması için yalnızca bir sütun kullanılır. Birden çok saflaştırma için sonraki bölüme bakın.
   1. İstediğiniz reçine türünü ve hacmini belirleyin. Kısmen saf His etiketli SH3 etki alanlarının 20 mg'ına kadar başparmak kuralı olarak, sütun başına 0,4 mL Q-sepharose hızlı akış reçinesi kullanın (bkz. adım 2.4.8).
   2. Önceden monte edilmiş bir MCPA'ya 24 açık boş sütun (altta filtresiz boş) ekleyin. Kolonlar, delinmiş sızdırmazlık paspasının deliklere sıkıca oturmalıdır.
   3. Saflaştırmanın başlayacağı ilk konum hariç her boş sütuna 10 mL şırınna piston yerleştirin.
   4. Sütunun sonunda bir lastik halka oluşturmak için açık bir sütunun altını (filtreli) 5 mL şırınna pistonlu kauçuk contadan (delinmiş) itin. Bu kauçuk halka, bu sütun yukarıdaki her boş sütuna yerleştirildiğinde iyi bir sızdırmazlık sağlayacaktır. Şimdilik, bu sütunu MCPA'daki ilk boş sütuna ekleyin.
   5. Açık bir toplama plakası alın ve bu plakayı vakum manifoldunun tabanına koyun ve manifoldun üst kısmıyla kapatın.
   6. Monte edilen MCPA'yı (sütunlu) vakum manifoldunun üzerine yerleştirin.
   7. Boruyu vakum pompası sisteminden vakumun altındaki giriş/nozüle takın.
   8. Alttan ~ 2 cm mavi pipet ucu kesin ve katmanlamayı önlemek için 50/50 boncuk etanol çözeltisinin karıştırılmasını sağlayarak 800 μL Q-sepharose boncuk (veya başka bir iyon değişim reçinesi) almak için kullanın. Pipet 800 μL ilk konumdaki tek açık sütuna (filtreli) ve boncuklar sütunların altına yerleştikten sonra vakumda% 20 etanolden geçecek kadar açılır.
   9. Sepharose boncuk içeren sütunu 2 x 2 mL 10 mM Tris ile yıkayın. Reçinenin kurumasını önlemek için Tris tamponu geçmeden hemen önce vakumu kapatın. Kaçak atılabilir.
      NOT: Reçine daha önce kullanılmışsa, adım 2.4.9'dan önce 4 M NaCl'lik 5 reçine hacminde ve ardından 10 mM Tris'lik 5 reçine hacminde yıkayarak yenilenin.
5. Yükleme, yıkama ve eluting
   1. Arındırılacak tüm numuneleri (bkz. bölüm 3) ilk konumdaki Q sepharose sütununa aktarın, vakum pompasını açmadan önce numuneyi ve boncukları yaklaşık 2 dakika karıştırmak için küçük bir plastik döngü kullanın.
      NOT: Fazla supernatant (>12 mL) durumlarında, sütunu aşırı doldurmaya dikkat edin. Örneğin çalışmasına izin verin, sonra tekrar çalıştırmadan önce karıştırarak daha fazla ekleyin.
   2. Akış akışını daha sonra analiz için depolayın/dondurun.
   3. Vakum manifolduna başka bir açık toplama plakası yerleştirin ve ardından her sepharose kolonunu 2 x 2 mL 10 mM Tris ile yıkayın ve saklayın.
   4. A1'in sol üst köşede olduğundan emin olmak için 96 kuyu toplama plakası takın.
   5. İlk elution fraksiyonunu toplamak için şırınna pistonunu bir sonraki sütundan çıkarın, Q sepharose sütununu bu konuma getirin ve şırınna pistonunu önceki konuma getirin. Daha sonra Q sepharose sütununa ilk tuz konsantrasyonunun pipet 1 mL'si. Pompayı açın ve elution'ı toplayın. Boncukların kurumasını önlemek için pompayı tıpkı boncukların yakınındaki sıvı çizgileri gibi kapatın.
   6. Bir sonraki elution fraksiyonunu toplamak için şırınna pistonunu bir sonraki sütundan çıkarın, Q sepharose sütununu bu konuma getirin ve şırınna pistonunu önceki konuma getirin.
   7. Sütuna bir sonraki tuz konsantrasyonunun 1 mL'sini ekleyin ve tüm konsantrasyonlar kullanılana ve 24 ayrı kuyuda 24 elution toplanana kadar işlemi tekrarlayın. Komşu kuyulara sıvı girmediğini kontrol edin.
   8. Sütunu 2 mL 4 M NaCl 10 mM Tris ile yıkayın. Bırak bu geçsin.
   9. % 20 etanol 2 mL ile yıkayın. Etanol boncukların hemen üzerine gelene kadar çalışmasına izin verin ve depolama için sızdırmazlık sütunu.
   10. 96 kuyu toplama plakasini saklayın ve UV spektroskopisi ve SDS PAGE ile analiz edin.

3. İyon Değişimi - 24 farklı proteinin eşzamanlı saflaştırılması

NOT: Tampon yapma, bir dizi tuz konsantrasyonu ve numune hazırlama hakkında ayrıntılı bilgi için 2.1-2.3 adımlarına bakın

1. Arıtma kurulumunu hazırlama
   NOT: Arıtma sisteminin nasıl kurulduğu, kaç proteinin saflaştırılacağına ve kaç tuz koşulunun kullanılacağına bağlıdır. Aynı anda maksimum 24 numuneye kadar 12 numuneyi saflaştırmak için, elute etmek için kullanılan her tuz konsantrasyonu için bir toplama plakası gereklidir. 12'den az örnek için, toplama plakalarını değiştirmeden önce kromatografi sütunlarını aynı MCPA içinde birkaç konum taşımak mümkündür. Bu durumda, sütunları boş sütunlara yerleştirmeye gerek yoktur ve doğrudan MCPA sızdırmazlık paspası içine takılabilirler. Aşağıdaki protokol 24 eşzamanlı iyon değişimi saflaştırması içindir.
   1. Monte edilmiş MCPA'yı doğrudan filtreli 24 boş sütuna açık bir toplama plakası içeren vakum manifoldunun üzerine yerleştirin ve yukarıdaki tek arıtma yönteminde olduğu gibi 24 iyon değişim sütununu hazırlayın ve yıkayın. Bu saflaştırma için, sütunlara hızla pipet yapmak için bir Eppendorf tekrarlayıcı veya şırınna kullanmak uygundur.
2. Yükleme, yıkama ve eluting
   1. MCPA'yı takmadan önce vakum manifoldunun tabanına 48 kuyulu bir toplama plakası yerleştirin (yıkanmış arıtma kolonları takılıyken). A1'in sol üst köşede olduğundan emin olun.
   2. Pipet her protein örneği (bir seferde 5 mL'ye kadar) ilgili sütunlarına. Her sütunu ince bir plastik döngü (kirlenmeyi önlemek için her sütun için bir döngü) kullanarak yaklaşık 2 dakika karıştırın. Ardından vakum pompasını aç ve süpernatantın akmasına izin verin.
      NOT: Fazla üstnatant durumlarında, sütunları aşırı doldurmaya dikkat edin. Örneğin sütununda çalışmasına izin verin, sonra tekrar çalıştırarak önce karıştırarak daha fazlasını ekleyin.
   3. Daha sonra analiz için 48 kuyulu toplama plakasını saklayın/dondurun, çünkü bu her proteinin akışını içerir.
   4. Vakum manifolduna başka bir 48 kuyu toplama plakası yerleştirin ve ardından her sepharose kolonunu 2 x 2 mL 10 mM Tris ile yıkayın.
   5. İlk 96 kuyulu toplama plakasını manifolda yerleştirin, A1'in sol üst köşede olduğundan emin olarak ve ardından her sütuna ilk tuz konsantrasyonunun 1 mL pipetini ve ardından bunu sütunlardan geçirmek için vakum pompasını açın. Toplama plakasını çıkarın, parafilm ile örtün ve analiz için 4 °C'de saklayın.
   6. Elute etmek için kullanılan her ardışık tuz konsantrasyonu için adımı tekrarlayın. Her elution için yeni bir toplama plakası kullanıldığından ve her toplama plakasının etiketli ve depolandığından emin olun.
   7. Her sütunu 2 mL 10 mM Tris, 4 M NaCl ile yıkayın.
   8. Her sütunu% 20 etanol 2 mL ile yıkayın. Etanol boncukların hemen üzerine gelene kadar çalışmasına izin verin ve depo için sütunları kapatın.
   9. 96 kuyu toplama plakalarını saklayın ve UV spektroskopisi ve SDS-PAGE ile analiz edin.

Sonuçlar

Örnek olarak, MCPA, Ni-NTA (Şekil 2A) aracılığıyla denatüre koşullarında 14 AbpSH3 mutantını başarıyla arındırmıştır. Küçük bir kirletici ~ 25 kDa görülebilir, ancak protein hala büyük ölçüde saftır. Bu kirleticinin, E. coli^11'debulunan ortak bir ko-saflaştırılmış protein olan YodA olduğuna inanılmaktadır. Şekil 2B, yerel koşullar altında 11 farklı SH3 etki alanının saflaştır?...

Tartışmalar

Yöntem, nispeten deneyimsiz protein biyokimyacıları için sağlam ve kullanımı kolaydır, ancak akılda tutulması gereken birkaç husus vardır.

Toplama plakalarını aşırı doldurma konusunda dikkatli olun

48 kuyulu toplama plakasının kendisi kuyu başına sadece 5 mL tutarken, her 96 kuyu sadece 2 mL tutar. Kuyuları aşırı doldurma riski olduğundan, sütun boyunca tampon eklerken ve örnek çalıştırırken bu akılda tutulmalıdır...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL/ well collection plate	Agilent technologies	201240-100
5 mL/ well collection plate	Agilent technologies	201238-100
12 mL chromatography columns	Bio-Rad	7311550
96 well long drip plate	Agilent technologies	200919-100	Come with 0.25 um filters which are to be removed.
96 well plate seal/mat	Agilent technologies	201158-100	Should be peirceable
His60 Ni Superflow Resin	Takara Bio	635660
HiTrap Q HP anion exchange column	GE Healthcare (Cytiva)	17115301
Lvis plate reader	BMG LABTECH		Compatible with FLUOstar Omega plate reader
Male leur plugs	Cole-Parmer	EW-45503-70
PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kit	Sigma-Aldrich	575650-U
Reservoir collection plate	Agilent technologies	201244-100
The Repeater Plus	Eppendorf	2226020	With 5 mL and 50 mL syringes
VACUSAFE vacuum	INTEGRA	158 320	The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle