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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Ein Mehrsäulenplattenadapter ermöglicht die Schnittstelle von Chromatographiesäulen mit Multi-Well-Sammelplatten für die parallele Affinitäts- oder Ionenaustauschreinigung, was eine wirtschaftliche Proteinreinigungsmethode mit hohem Durchsatz bietet. Es kann unter Schwerkraft oder Vakuum verwendet werden, wodurch Milligrammmengen an Protein über erschwingliche Instrumente erhalten werden.

Zusammenfassung

Die Proteinreinigung ist für die Untersuchung der Proteinstruktur und -funktion unerlässlich und wird normalerweise in Kombination mit biophysikalischen Techniken verwendet. Es ist auch eine Schlüsselkomponente bei der Entwicklung neuer Therapeutika. Die sich entwickelnde Ära der funktionellen Proteomik befeuert die Nachfrage nach Hochdurchsatz-Proteinreinigung und verbesserten Techniken, um dies zu erleichtern. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass ein Mehrsäulenplattenadapter (MCPA) mehrere Chromatographiesäulen verschiedener Harze mit Multi-Well-Platten zur parallelen Reinigung verbinden kann. Diese Methode bietet eine wirtschaftliche und vielseitige Methode der Proteinreinigung, die unter Schwerkraft oder Vakuum eingesetzt werden kann und mit der Geschwindigkeit eines automatisierten Systems mithalten kann. Das MCPA kann verwendet werden, um Milligramm-Ausbeute an Protein durch eine erschwingliche und zeiteffiziente Methode für die nachfolgende Charakterisierung und Analyse wiederherzustellen. Der MCPA wurde für die Hochdurchsatz-Affinitätsreinigung von SH3-Domänen verwendet. Der Ionenaustausch wurde auch über das MCPA demonstriert, um Proteine nach der Ni-NTA-Affinitätschromatographie zu reinigen, was darauf hinweist, wie dieses System an andere Reinigungstypen angepasst werden kann. Aufgrund des Aufbaus mit mehreren Spalten kann die individuelle Anpassung der Parameter in der gleichen Reinigung vorgenommen werden, was mit den aktuellen plattenbasierten Methoden nicht erreichbar ist.

Einleitung

Proteinreinigungstechniken, um Milligrammmengen an gereinigten Proteinen zu erreichen, sind für ihre Charakterisierung und Analyse unerlässlich, insbesondere für biophysikalische Methoden wie NMR. Die Proteinreinigung ist auch in anderen Studienbereichen wie Arzneimittelentdeckungsprozessen und Protein-Protein-Interaktionsstudien von zentraler Bedeutung. Das Erreichen solcher Mengen an reinem Protein kann jedoch zueinemEngpass für diese Techniken werden 1,2,3. Die Hauptmethode zur Proteinreinigung ist die Chromatographie, die eine Vielzahl von Methoden umfasst, die auf den in....

Protokoll

1. Denaturierung der Ni-NTA-Chromatographie

  1. Vorbereiten von Puffern
    HINWEIS: Einzelheiten zu allen Puffern finden Sie in Tabelle 1.
    1. Machen Sie 500 ml 0,5 M NaOH, achten Sie darauf, zuerst das Milli-Q-Wasser hinzuzufügen und dann das NaOH langsam hinzuzufügen, während sich das Becherglas auf einem Rührer befindet. Filtern Sie mit einem 0,22 μm Filter.
    2. 100 ml 0,1 M Nickelsulfat vorbereiten und mit einem 0,22 μm Filter filtern.
    3. 50 ml 2 M Imidazol vorbereiten und mit einem 0,22 μm Filter filtern.
    4. 1,5 l Denaturierungspuffer bei pH 8,0, bestehend aus 5,3 mM Tris-HCl, 4,7 mM Tris-Base (Tr....

Ergebnisse

So hat das MCPA beispielsweise 14 AbpSH3-Mutanten unter Denaturierungsbedingungen erfolgreich über Ni-NTA gereinigt (Abbildung 2A). Eine kleine Verunreinigung ~ 25 kDa ist zu sehen, jedoch ist das Protein immer noch weitgehend rein. Es wird angenommen, dass es sich bei dieser Verunreinigung um YodA handelt, ein häufiges co-gereinigtes Protein, das in E. coli11gefundenwird. Abbildung 2B zeigt die Reinigung von 11 versch.......

Diskussion

Die Methode ist robust und für relativ unerfahrene Proteinbiochemiker einfach zu bedienen, es gibt jedoch einige Überlegungen zu beachten.

Vorsicht bei Überfüllung von Sammelplatten

Die 48-Well-Auffangplatte selbst fasst nur 5 ml pro Vertiefung, während jede 96-Well nur 2 ml fasst. Dies muss beim Hinzufügen von Puffer und beim Durchlaufen der Probe durch die Säule berücksichtigt werden, da die Gefahr einer Überfüllung der Vertiefungen best.......

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde durch einen Institutional Development Award (IDeA) des National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Fördernummer P20GM103451 und einen internen Forschungsstipendium der University of Liverpool unterstützt.

....

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
2 mL/ well collection plateAgilent technologies201240-100
5 mL/ well collection plateAgilent technologies201238-100
12 mL chromatography columnsBio-Rad7311550
96 well long drip plateAgilent technologies200919-100Come with 0.25 um filters which are to be removed.
96 well plate seal/matAgilent technologies201158-100Should be peirceable
His60 Ni Superflow ResinTakara Bio635660
HiTrap Q HP anion exchange columnGE Healthcare (Cytiva)17115301
Lvis plate readerBMG LABTECHCompatible with FLUOstar Omega plate reader
Male leur plugsCole-ParmerEW-45503-70
PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kitSigma-Aldrich575650-U
Reservoir collection plateAgilent technologies201244-100
The Repeater PlusEppendorf2226020With 5 mL and 50 mL syringes
VACUSAFE vacuumINTEGRA158 320The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle

Referenzen

  1. Zhang, C., et al. Development of an Automated Mid-Scale Parallel Protein Purification System for Antibody Purification and Affinity Chromatography. Protein Expression and Purification. , 128 (2016).
  2. Renaud, J. P., et al.

Nachdrucke und Genehmigungen

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