Ein wirtschaftliches und vielseitiges Hochdurchsatz-Proteinreinigungssystem mit einem Mehrsäulenplattenadapter

Zusammenfassung

Ein Mehrsäulenplattenadapter ermöglicht die Schnittstelle von Chromatographiesäulen mit Multi-Well-Sammelplatten für die parallele Affinitäts- oder Ionenaustauschreinigung, was eine wirtschaftliche Proteinreinigungsmethode mit hohem Durchsatz bietet. Es kann unter Schwerkraft oder Vakuum verwendet werden, wodurch Milligrammmengen an Protein über erschwingliche Instrumente erhalten werden.

Zusammenfassung

Die Proteinreinigung ist für die Untersuchung der Proteinstruktur und -funktion unerlässlich und wird normalerweise in Kombination mit biophysikalischen Techniken verwendet. Es ist auch eine Schlüsselkomponente bei der Entwicklung neuer Therapeutika. Die sich entwickelnde Ära der funktionellen Proteomik befeuert die Nachfrage nach Hochdurchsatz-Proteinreinigung und verbesserten Techniken, um dies zu erleichtern. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass ein Mehrsäulenplattenadapter (MCPA) mehrere Chromatographiesäulen verschiedener Harze mit Multi-Well-Platten zur parallelen Reinigung verbinden kann. Diese Methode bietet eine wirtschaftliche und vielseitige Methode der Proteinreinigung, die unter Schwerkraft oder Vakuum eingesetzt werden kann und mit der Geschwindigkeit eines automatisierten Systems mithalten kann. Das MCPA kann verwendet werden, um Milligramm-Ausbeute an Protein durch eine erschwingliche und zeiteffiziente Methode für die nachfolgende Charakterisierung und Analyse wiederherzustellen. Der MCPA wurde für die Hochdurchsatz-Affinitätsreinigung von SH3-Domänen verwendet. Der Ionenaustausch wurde auch über das MCPA demonstriert, um Proteine nach der Ni-NTA-Affinitätschromatographie zu reinigen, was darauf hinweist, wie dieses System an andere Reinigungstypen angepasst werden kann. Aufgrund des Aufbaus mit mehreren Spalten kann die individuelle Anpassung der Parameter in der gleichen Reinigung vorgenommen werden, was mit den aktuellen plattenbasierten Methoden nicht erreichbar ist.

Einleitung

Proteinreinigungstechniken, um Milligrammmengen an gereinigten Proteinen zu erreichen, sind für ihre Charakterisierung und Analyse unerlässlich, insbesondere für biophysikalische Methoden wie NMR. Die Proteinreinigung ist auch in anderen Studienbereichen wie Arzneimittelentdeckungsprozessen und Protein-Protein-Interaktionsstudien von zentraler Bedeutung. Das Erreichen solcher Mengen an reinem Protein kann jedoch zu^einemEngpass für diese Techniken werden 1^,2,3. Die Hauptmethode zur Proteinreinigung ist die Chromatographie, die eine Vielzahl von Methoden umfasst, die auf den individuellen Eigenschaften von Proteinen und ihren Tags basieren. In der Affinitätschromatographie haben Proteine ein zusätzliches Protein- oder Peptidmotiv, das als Tag fungiert, das eine Affinität für ein bestimmtes Substrat auf dem Chromatographieharz^{4 aufsät.} Die gebräuchlichste Affinitätsmethode ist die immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) mit His-markierten Proteinen, während eine andere beliebte Methode die Ionenaustauschchromatographie ist, die Proteine basierend auf ihrer Ladung trennt. Für höchste Reinheit wird häufig eine Kombination aus Affinitätschromatographie und Ionenaustausch zusammen verwendet, was in der Regel teure Laborgeräte für einen hohen Durchsatz erfordert.

Die sich entwickelnde Ära der funktionellen Proteomik befeuert die Nachfrage nach Hochdurchsatztechniken, um nicht einzelne Proteine für spezifische Analysen, sondern eine große Anzahl von Proteinen gleichzeitig für umfassende Analysen und genomweite Studien zu reinigen⁵. Die immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) ist eine der am weitesten verbreiteten Methoden zur Hochdurchsatzproteinreinigung^6,7, aber ihre automatisierten Systeme sind teuer und für kleinere Labore unerschwinglich⁸. Die erschwinglicheren plattenbasierten Alternativen, die derzeit verfügbar sind, verwenden zugängliche Laborgeräte wie ein Vakuum. Obwohl diese Methoden die Reinigungsgeschwindigkeit erfolgreich verbessern, kann sie nur in kleinerem Maßstab eine Hochdurchsatzreinigung erreichen und nur Protein im Mikrogrammbereich liefern. Diese Einschränkungen bedeuten, dass die vorverpackten 96-Well-Filterplatten (z. B. von GE Healthcare, die jetzt im Besitz von Cytiva sind) nicht vor biophysikalischen Techniken verwendet werden können⁹. Die Schwerkraftchromatographie ist die kostengünstigste Reinigungsmethode. Das Einrichten mehrerer Spalten ist jedoch umständlich und kann für mehrere Proteine fehleranfällig sein.

Ein Mehrsäulenplattenadapter (MCPA) wurde entwickelt und bewährt, um parallele Affinitätschromatographiesäulen gleichzeitig erfolgreich und bequem auszuführen, um his-markierte Hefe-SH3-Domänen zu reinigen¹⁰. Der MCPA bietet eine kosteneffiziente Hochdurchsatz-Reinigungsmethode, die nicht auf kostspielige Instrumentierung angewiesen ist. Sein flexibles Design kann Milligramm Protein durch mehrere Affinitätschromatographiesäulen unter Schwerkraft oder Vakuumverteiler effektiv reinigen. Darüber hinaus können Harztyp, Volumen und andere Parameter für jede einzelne Säule angepasst werden, um eine schnellere Optimierung zu erreichen. Diese Studie zeigt, dass die Ionenaustauschchromatographie durch das MCPA in Verbindung mit der Affinitätschromatographie durch das MCPA verwendet werden kann, um die Aufreinigung der Abp1 SH3-Domäne zu verbessern. Zusätzlich können mit diesen Methoden bis zu 24 verschiedene Proteine parallel getrennt werden.

Protokoll

1. Denaturierung der Ni-NTA-Chromatographie

1. Vorbereiten von Puffern
   HINWEIS: Einzelheiten zu allen Puffern finden Sie in Tabelle 1.
   1. Machen Sie 500 ml 0,5 M NaOH, achten Sie darauf, zuerst das Milli-Q-Wasser hinzuzufügen und dann das NaOH langsam hinzuzufügen, während sich das Becherglas auf einem Rührer befindet. Filtern Sie mit einem 0,22 μm Filter.
   2. 100 ml 0,1 M Nickelsulfat vorbereiten und mit einem 0,22 μm Filter filtern.
   3. 50 ml 2 M Imidazol vorbereiten und mit einem 0,22 μm Filter filtern.
   4. 1,5 l Denaturierungspuffer bei pH 8,0, bestehend aus 5,3 mM Tris-HCl, 4,7 mM Tris-Base (Tris(hydroxymethyl)methylamin), 13,7 mM_NaH2PO4,86,3 mM Na2 HPO4 und 6 M Guanidinhydrochlorid, bereit und 0,22 μm filtern und 0,2 mM denaturierungspuffer vorbereiten und filtern.
   5. 500 ml Lysepufferlösung von 10 mM Imidazol, gelöst in Denaturierungspuffer (siehe 1.1.4) unter Verwendung des 2 M Imidazol-Stamms, werden vorbereitet und 0,22 μm filtriert.
   6. 500 ml Waschpufferlösung von 10 mM Imidazol, gelöst in Denaturierungspuffer (siehe 1.1.4), unter Verwendung des 2 M Imidazol-Stamms vorzubereiten und mit 0,22 μm zu filtern.
   7. Vorbereiten und 0,22 μm Filter 500 mL 100 mM EDTA-Puffer, pH-Wert auf 8 mit 1 M NaOH einstellen.
   8. Vorbereiten und 0,22 μm Filter 500 ml Elutionspuffer aus 7 mL 99% Eisessigsäure in 6 M Guanidinhydrochlorid.
      HINWEIS: Wenn Sie native Puffer verwenden, passen Sie sie gemäß Tabelle 1an.
2. Lysing-Zellen (Denaturierungsmethode)
   1. Fügen Sie 2 ml Lysepuffer zu jedem 1 g geernteten E. coli-Zellpellets hinzu, die das überexprimierte His-markierte Protein enthalten. Wirbel für mehrere Minuten, bis die Zellen wieder suspendiert sind. Lassen Sie die Proben 30 Minuten bei 4 °C auf einer Wippe.
   2. Zentrifuge lysierte Pellets bei 18.000 x g für 30 Minuten. Halten Sie 50 μL im Gefrierschrank mit -20 °C beiseite, um später ein SDS-PAGE-Gel zu analysieren.
   3. Gießen Sie die Überstände vorsichtig ab, um sicherzustellen, dass das Pellet nicht gestört wird. Lysate sollten eine klare, hellgelbe Farbe haben. Wenn Lysate trüb sind, zentrifugieren Sie erneut Probe; Erwägen Sie eine Beschallung, wenn verfügbar, um Nukleinsäure abzubauen.
   4. Filtern Sie die Überstände durch eine leere Säule (ohne Harz, aber mit Filter) und sammeln Sie sie in einer offenen Auffangwanne. Dann in ein Rohr zur Verwendung in Schritt 1.3 überführen.
      HINWEIS: Wenn Sie die nativen Puffer verwenden, behandeln Sie die Proben nach Schritt 1.2.1 in 3 Zyklen des Einfrierens/Auftauens bei -80 °C oder verarbeiten Sie sie durch Beschallung oder French Press, um Zellen zu lysieren.
3. Vorbereitung des Vakuumreinigungsaufbaus und der Ausgleichssäulen
   HINWEIS: Siehe Abbildung 1 für einen eingerichteten MCPA mit 24 Spalten.
   1. Bestimmen Sie, wie viele Säulen benötigt werden, sowie den gewünschten Harztyp und das gewünschte Harzvolumen. Als Faustregel für 100 ml Autoinduktionskultur (~ 2 g Pellet), die His-markierte SH3-Domänen mit T7-basierten Plasmiden exprimieren, verwenden Sie 0,6 ml Ni-NTA-Harz pro Säule, um etwa 3 mg Protein aus etwa 6 ml Lysat zu erhalten.
   2. Setzen Sie die gewünschte Anzahl von 12 mL Säulen (ohne Harz, aber mit Filter) in eine vormontierte MCPA (Langtropfplatte mit punktiertem Dichtmatten) ein. Die Säulen sollten eng in die Löcher der Dichtmatte passen, die durchstochen wurden.
   3. Wenn weniger als 24 Spalten verwendet werden, schließen Sie leere Löcher mit einer leeren geschlossenen Spalte.
   4. Nehmen Sie eine offene Auffangplatte und legen Sie diese Platte in die Basis des Vakuumverteilers und schließen Sie mit der Oberseite des Verteilers.
   5. Legen Sie das montierte MCPA mit Säulen auf den Vakuumverteiler.
   6. Befestigen Sie Schläuche aus einem Vakuumpumpensystem am Einlass/an der Düse am Boden des Vakuumverteilers.
   7. Stellen Sie sicher, dass die Ni-NTA-Perlen in einer 50% igen Lösung mit 20% Ethanol vorliegen. Bevor Sie etwas mit den Perlen tun, schütteln / mischen Sie die Perlen - Ethanollösung vorsichtig, um sie gleichmäßig wieder aufzuführen. Dann pipetten Sie mit einer 5-ml-Pipette 1,2 ml der 50%igen Lösung in die Säulen. Achten Sie beim Pipettieren darauf, dass die Perlen vollständig vermischt bleiben.
   8. Nach dem Pipettieren in alle 24 Säulen schalten Sie die Vakuumpumpe ein und führen das 20% Ethanol durch die Säule und in die darunter stehende Auffangplatte.
   9. Schalten Sie die Pumpe aus, sobald das gesamte 20% ige Ethanol durch alle Säulen gelaufen ist (Ni-NTA-Harz kann eine kurze Trocknung tolerieren, wenn das Vakuum noch angewendet wird, nachdem der Puffer durch die Säule gegangen ist). Entsorgen Sie das, was sich auf der offenen Sammelplatte befindet, in einen Abfallkasten.
      ACHTUNG: Alle Abfallprodukte aus den Ni-NTA-Perlen sind gefährlich, wenn Sie mit den Perlen umgehen oder den Abfall entsorgen, Handschuhe, Schutzbrillen und andere PSA tragen. Darüber hinaus entsorgen Sie alle Nickelsulfatabfälle in einem separaten Behälter zur späteren individuellen Entsorgung.
      HINWEIS: Wenn Harz neu oder kürzlich regeneriert ist, können die restlichen Schritte ignoriert werden, fahren Sie mit dem nächsten Abschnitt fort.
   10. Fügen Sie 3 Harzvolumina (1,8 ml) mit 100 mM EDTA-Puffer mit einer 20-ml-Spritze oder einer Repeater-Spritze mit einer 50-ml-Spritze hinzu. Schalten Sie dann die Vakuumpumpe ein, um den EDTA-Puffer durchwaschen zu lassen, und schalten Sie die Pumpe aus, sobald sie durchgewaschen ist.
       HINWEIS: Diese Wäsche sollte die nickelblaue Farbe entfernen, aber wenn dies nicht der Fall ist, wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Säulen ihre blaue Farbe verloren haben. Schalten Sie die Pumpe aus und gießen Sie den Inhalt der offenen Sammelplatte in den Abfallkasten.
   11. Fügen Sie 3 Harzvolumina (1,8 ml) mit 0,5 M NaOH-Puffer in jede Säule hinzu, bevor Sie die Pumpe einschalten und durch jede Säule laufen lassen. Leere Sammelplatte.
   12. Fügen Sie 4 Harzvolumina (2,4 ml) von 100 mM Nickelsulfat in jede Säule hinzu. Schalten Sie die Vakuumpumpe ein und lassen Sie diese noch einmal durch die Säule laufen.
   13. Fügen Sie 10 Harzvolumina (~ 6000 μL) Milli-Q-Wasser hinzu und führen Sie dieses durch die Säulen. Schalten Sie die Pumpe aus und gießen Sie den Inhalt der Sammelplatte in die Abfallbox.
   14. Waschen Sie die Säulen zweimal mit 4 Harzvolumina (2,4 ml) von 10 mM Imidazol im Waschpuffer (denaturierend oder nativ), um überschüssiges Nickel zu entfernen und auszugleichen. Leere Sammelplatte.
       HINWEIS: Wenn Säulen deutlich langsamer laufen, kann die Säulen- und Kontrollluft mit einer großen Spritze durch den MCPA gedrückt werden. Wenn die Blockierung aufgehoben ist, verwenden Sie eine andere Spalte mit einem neuen Filter.
   15. Wenn mehrere verschiedene Proben / Proteine auf dem MCPA gereinigt werden sollen, ersetzen Sie die offene Auffangplatte durch eine 48 x (5 ml / Well) Sammelplatte. Wenn jedoch nur die gleichen Proteinproben auf jeder Säule ausgeführt werden, ist es in Ordnung, weiterhin eine offene Auffangplatte zu verwenden.
4. Beladen, Waschen und Eluieren
   1. Bei ausgeschaltetm Vakuum Lysate in Säulen laden (die Menge an Lysat variiert typischerweise von 1 bis 12 ml oder mehr und kann erforderlich sein, um in mehreren Chargen zu laden). Verwenden Sie einen dünnen Kunststoffrührer, um die Perlen und das Lysat in der Säule vorsichtig zu mischen, um die Bindung zu maximieren.
   2. Nachdem Sie jede Säule einige Minuten lang vorsichtig gemischt haben, schalten Sie die Vakuumpumpe ein und führen Sie die Lysate durch die Säulen. Wenn mehrere Proteinproben ausgeführt werden, verwenden Sie eine 48-Well-Entnahmeplatte und stellen Sie sicher, dass Sie die Auffangplatte gegen eine weitere 48-Well-Platte austauschen, nachdem 4 ml durchgegangen sind, da die Vertiefungen in diesen Platten nur 4 ml Lösung aufnehmen können. Führen Sie Lysat weiter aus, bis alle Lysate durch eine Spalte geführt wurden. Fixieren von Sammelplatten, die den Durchfluss enthalten.
      HINWEIS: Spalten können "blockiert" werden, wodurch das Lysat viel langsamer durch die Spalte fließt, als es sollte. Dies ist leicht zu erkennen, da die benachbarten Säulen mit normaler Geschwindigkeit fließen. In diesem Fall wird empfohlen, das Lysat/Harz-Gemisch in eine Säule mit einem frischen Filter zu überführt.
   3. Ersetzen Sie die Auffangplatte durch eine leere offene Auffangplatte und fügen Sie dann 9 Harzvolumina (5,4 ml) von 10 mM Imidazol-Waschpuffer zu jeder Säule hinzu und schalten Sie das Vakuum ein und führen Sie die Wäsche durch. Wiederholen Sie dies 4-5 mal. Um ein Überlaufen zu vermeiden, leeren Sie regelmäßig die Abfallplatte.
      1. Ersetzen Sie dann die Auffangplatte durch eine saubere geeignete Platte (offene Platte für nur ein Protein und 96 gut, wenn mehrere Proteine vorhanden sind, um sicherzustellen, dass sich A1 in der oberen linken Ecke befindet).
   4. Mit einer Repeater-Spritze mit einer 12,5-ml-Spritze werden ~ 1 Harzvolumen (0,75 ml) denaturierender Elutionspuffer in jede Säule pipetten.
   5. Um ein Aufschäumen von Protein zu vermeiden, schalten Sie die Vakuumpumpe bei der niedrigsten Einstellung ein. Heben Sie den MCPA vorsichtig an, um sich zu stellen, ob nichts mehr in die Auffangplatte tropft.
      HINWEIS: Eine Alternative zum Eluieren mit dem Vakuum oder der Schwerkraft besteht darin, einen 10-ml-Spritzenkolben in die Oberseite der Säule zu drücken, um den Elutionspuffer sanft durch die Säule zu drücken. Tun Sie dies für jede Säule und achten Sie beim Entfernen des Spritzenkolbens darauf, die Perlen an der Unterseite der Säule nicht zu stören. Sobald der Elutionspuffer durchgedrückt wurde, entfernen Sie vorsichtig den Spritzenkolben aus der letzten Säule, in der er verwendet wurde, und schalten Sie kurz die Vakuumpumpe ein, um die letzten Tropfen aus den Säulen zu entfernen.
      1. Wenn eine 96-Well-Sammelplatte verwendet wurde, überprüfen Sie die Auffangplatte, um sicherzustellen, dass das, was von jeder Säule durch die lange Tropfplatte fließt, nur in einen Brunnen fließt und nichts in benachbarte Brunnen auf der Sammelplatte eluiert.
   6. Für die nächste Elution wiederholen Sie die obigen 2 Schritte und sammeln Sie in einer frischen Multi-Well (verschiedene Proben) oder offenen Auffangplatte (gleiche Proben).
   7. Optionaler Schritt, nehmen Sie ein 50 μL Aliquot jeder Elution für die Reinheits- und Konzentrationsanalyse.
   8. Fügen Sie 2 ml 20% Ethanol zu jeder Säule hinzu und führen Sie diese mit der Vakuumpumpe durch. Dann fügen Sie weitere 2 ml 20% Ethanol zu den Säulen hinzu und verwenden Sie einen frischen dünnen Kunststoffrührer, um das 20% Ethanol und die Perlen zu mischen, bevor Sie in ein 50-ml-Röhrchen zur Lagerung bei 4 ° C übergehen. Reinigen Sie die Säulen und überprüfen Sie, ob Wasser frei durch jede Säule fließt, und reinigen Sie dann alles und legen Sie es für den späteren Gebrauch weg.
      HINWEIS: Bei einigen Spalten werden die Filter blockiert und sie werden zu langsam ausgeführt, diese Spalten sollten ersetzt oder Filter bereinigt werden. Daher wird empfohlen, Filter regelmäßig zu testen, indem Harz entfernt und die Säule mit Wasser gefüllt wird, um zu sehen, ob es schnell durchfließt. Filter können gereinigt werden, indem eine geschlossene Säule mit denaturierendem Elutionspuffer gefüllt bleibt und über Nacht geschüttelt wird.

2. Ionenaustausch - Einzelproteinreinigung

1. Vorbereiten der Puffer
   HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für Details zu allen Puffern
   1. Bereiten Sie einen 2 L salzarmen Puffer vor: 10 mM Tris pH 8,1 (5 mM Tris Acid, 5 mM Tris Base). Filterlösung mit einem 0,22 μm Filter.
   2. Bereiten Sie einen 0,5 L hohen Salzpuffer vor: 10 mM Tris pH 8,1, 4 M NaCl. Messen Sie 116,9 g NaCl und machen Sie bis zu 0,5 L mit dem 10 mM Tris pH 8,1 von oben. Filterlösung mit einem 0,22 μm Filter.
2. Herstellungssalzkonzentrationsreihe: 0-1 M NaCl.
   HINWEIS: Der Bereich der Salzkonzentrationen kann für jedes Protein angepasst werden.
   1. Aufbau von 24 x 50 ml beschrifteten Zentrifugenröhrchen in einem Rack
   2. Bereiten Sie mit den oben hergestellten Puffern 24 x 14 mL NaCl-Verdünnungen im Bereich von 0-1000 μM vor. Beginnen Sie mit der Zugabe der erforderlichen Volumina von 4 M NaCl 10 mM Tris. Dies könnte in Schritten von 25 mM oder 50 mM je nach Protein erfolgen.
   3. Dann fügen Sie die erforderlichen Volumina von 10 mM Tris zu jeder Röhre hinzu. Kehren Sie jede Tube mehrmals um, um sie zu mischen.
3. Probenvorbereitung
   1. Erhalten Sie die zu entreinden Proben durch Ionenaustausch. Optional nehmen Sie ein 50 μL Aliquot zur späteren Analyse.
      HINWEIS: Proben sollten immer kalt gehalten werden; Dies können Lysate oder vielleicht Post-Ni-NTA sein. Proben von Ni-NTA in Denaturierungspuffern erfordern eine Dialyse oder einen Pufferaustausch in 10 mM Tris-Puffer. Proben aus Ni-NTA in nativen Puffern könnten mit 10 mM Tris-Puffer verdünnt werden, um die Salzkonzentration zu reduzieren, so dass das Protein an IEX-Harz binden kann.
   2. Spinnen Sie Proben bei 18.000 x g für 10 Minuten.
   3. Gießen Sie den Überstand vorsichtig in ein Wiegeboot. Vermeiden Sie es, das Pellet zu stören.
   4. Nehmen Sie den Überstand vorsichtig in eine 20-ml-Spritze auf und befestigen Sie einen 0,22 μm-Filter.
   5. Den Überstand langsam durch den Filter in ein frisches 50-ml-Rohr auswerfen.
   6. Wenn eine Verdünnung erforderlich ist, verdünnen Sie den Überstand mit 10 mM Tris-Puffer aus dem obigen (In diesem Experiment wurde der Überstand 1 zu 2 verdünnt). In der Zwischenzeit bei 4 °C lagern.
4. Vorbereitung des Vakuumreinigungsaufbaus und des Gleichgewichtsaufbaus
   HINWEIS: In diesem Protokoll wird nur eine Spalte für die IEX-Reinigung einer Probe verwendet. Informationen zu mehreren Reinigungen finden Sie im nächsten Abschnitt.
   1. Bestimmen Sie den gewünschten Harztyp und das gewünschte Harzvolumen. Als Faustregel gilt für bis zu 20 mg teilweise reine His-markierte SH3-Domänen 0,4 ml Q-Sepharose-Schnellflussharz pro Säule (siehe Schritt 2.4.8).
   2. Legen Sie 24 offene leere Spalten (leer ohne Filter unten) in einen vormontierten MCPA ein. Die Säulen sollten eng in die Löcher der Dichtmatte passen, die durchstochen wurden.
   3. Legen Sie einen 10-ml-Spritzenkolben in jede leere Säule mit Ausnahme der ersten Position, an der die Reinigung beginnt.
   4. Drücken Sie den Boden einer offenen Säule (mit Filter) durch eine 5-ml-Spritzenkolben-Gummidichtung (die durchbohrt wurde), um am Ende der Säule einen Gummiring zu bilden. Dieser Gummiring sorgt für eine gute Abdichtung, wenn diese Säule in jede leere Säule darüber eingeführt wird. Fügen Sie diese Spalte vorerst in die erste leere Spalte auf dem MCPA ein.
   5. Nehmen Sie eine offene Auffangplatte und legen Sie diese Platte in die Basis des Vakuumverteilers und schließen Sie mit der Oberseite des Verteilers.
   6. Legen Sie das montierte MCPA (mit Säulen) auf den Vakuumverteiler.
   7. Befestigen Sie Schläuche aus einem Vakuumpumpensystem am Einlass/Düse am Boden des Vakuums.
   8. Schneiden Sie eine blaue Pipettenspitze ~ 2 cm von der Unterseite ab und nehmen Sie 800 μL Q-Sepharose-Perlen (oder ein anderes Ionenaustauscherharz) auf, um sicherzustellen, dass die 50/50-Perlen-Ethanol-Lösung gemischt wird, um eine Schichtung zu vermeiden. 800 μL in die eine offene Säule (mit Filter) in der ersten Position pipetten und sobald sich die Perlen am Boden der Säulen absetzen, schalten Sie das Vakuum so ein, dass es durch das 20% Ethanol läuft.
   9. Waschen Sie die Säule mit Sepharose-Perlen mit 2 x 2 ml 10 mM Tris. Schalten Sie das Vakuum aus, kurz bevor der Tris-Puffer durchläuft, um ein Austrocknen des Harzes zu verhindern. Run off kann verworfen werden.
      HINWEIS: Wenn zuvor Harz verwendet wurde, regenerieren Sie sich durch Waschen in 5 Harzvolumina von 4 M NaCl und dann 5 Harzvolumina von 10 mM Tris vor Schritt 2.4.9.
5. Beladen, Waschen und Eluieren
   1. Alle zu entfernenden Proben (siehe Abschnitt 3) in die Q-Sepharose-Säule in der ersten Position geben, verwenden Sie eine kleine Kunststoffschleife, um Die Probe und die Perlen für etwa ~ 2 Minuten zu rühren, bevor Sie die Vakuumpumpe einschalten.
      HINWEIS: Bei übermäßigem Überstand (>12 ml) ist darauf zu achten, dass die Säule überfüllt wird. Lassen Sie das Sample durchgehen und fügen Sie dann weitere hinzu, mischen Sie es, bevor Sie es wieder durchgehen lassen.
   2. Speichern/Fixieren des Flowthroughs für eine spätere Analyse.
   3. Legen Sie eine weitere offene Auffangplatte in den Vakuumverteiler und waschen Sie dann jede Sepharosesäule mit 2 x 2 mL 10 mM Tris und lagern Sie sie.
   4. Setzen Sie eine 96-Well-Sammelplatte ein und stellen Sie sicher, dass sich A1 in der oberen linken Ecke befindet.
   5. Um die erste Elutionsfraktion zu sammeln, entfernen Sie den Spritzenkolben aus der nächsten Säule, bewegen Sie die Q-Sepharosesäule in diese Position und setzen Sie den Spritzenkolben in die vorherige Position. Dann pipette 1 ml der ersten Salzkonzentration in die Q-Sepharosesäule. Schalten Sie die Pumpe ein und sammeln Sie die Elution. Schalten Sie die Pumpe aus, so wie die Flüssigkeit in der Nähe der Perlen ist, um ein Austrocknen der Perlen zu vermeiden.
   6. Um die nächste Elutionsfraktion zu sammeln, entfernen Sie den Spritzenkolben aus der nächsten Säule, bewegen Sie die Q-Sepharosesäule in diese Position und setzen Sie den Spritzenkolben in die vorherige Position.
   7. Fügen Sie 1 ml der nächsten Salzkonzentration in die Säule hinzu und wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Konzentrationen verwendet wurden und 24 Elutionen in 24 separaten Vertiefungen gesammelt wurden. Überprüfen Sie, ob keine Flüssigkeit in benachbarte Brunnen gelangt ist.
   8. Waschen Sie die Säule mit 2 mL 4 M NaCl 10 mM Tris. Lassen Sie das durchgehen.
   9. Mit 2 ml 20% Ethanol waschen. Ethanol laufen lassen, bis es sich direkt über den Perlen befindet, und versiegeln Sie die Säule zur Lagerung.
   10. Lagern Sie 96 Well-Sammelplatte und analysieren Sie sie mittels UV-Spektroskopie und SDS PAGE.

3. Ionenaustausch - Gleichzeitige Aufreinigung von 24 verschiedenen Proteinen

HINWEIS: Einzelheiten zur Herstellung von Puffern, einer Reihe von Salzkonzentrationen und zum Vorbereiten von Proben finden Sie in den Schritten 2.1-2.3

1. Vorbereiten des Reinigungs-Setups
   HINWEIS: Wie das Reinigungssystem aufgebaut ist, hängt sehr stark davon ab, wie viele Proteine gereinigt werden und wie viele Salzbedingungen verwendet werden. Um 12 Proben bis maximal 24 Proben gleichzeitig zu reinigen, ist eine Auffangplatte für jede salzhaltige Salzkonzentration erforderlich, die zum Eluieren verwendet wird. Für weniger als 12 Proben ist es möglich, die Chromatographiesäulen um einige Positionen innerhalb desselben MCPA zu verschieben, bevor die Sammelplatten gewechselt werden. In diesem Fall müssen die Säulen nicht in leere Säulen gelegt werden und sie können direkt an der MCPA-Dichtmatte befestigt werden. Das folgende Protokoll gilt für 24 gleichzeitige Ionenaustauschreinigungen.
   1. Legen Sie das montierte MCPA direkt an 24 leeren Säulen mit Filtern auf den Vakuumverteiler, der eine offene Auffangplatte enthält, und bereiten Sie 24 Ionenaustauschsäulen vor und waschen Sie sie wie bei der einzeln reinigungsmethode oben. Für diese Reinigung ist es praktisch, einen Eppendorf-Repeater oder eine Spritze zu verwenden, um schnell in Säulen zu pipetten.
2. Beladen, Waschen und Eluieren
   1. Legen Sie eine 48-Well-Auffangplatte in den Boden des Vakuumverteilers, bevor Sie den MCPA (mit den gewaschenen Reinigungssäulen) montieren. Stellen Sie sicher, dass sich A1 in der oberen linken Ecke befindet.
   2. Pipetette jede Proteinprobe (bis zu 5 ml gleichzeitig) in die entsprechende Säule. Rühren Sie jede Säule mit einer dünnen Kunststoffschlaufe (eine Schlaufe für jede Säule, um eine Kontamination zu vermeiden) für ca. 2 Minuten. Schalten Sie dann die Vakuumpumpe ein und lassen Sie den Überstand durchströmen.
      HINWEIS: Bei übermäßigem Überstand ist vorsicht vor überfüllten Spalten zu achten. Lassen Sie das Sample durch seine Spalte laufen, fügen Sie dann weitere hinzu, mischen Sie es, bevor Sie es wieder durchgehen lassen.
   3. Lagern/frieren Sie die 48-Well-Auffangplatte für die spätere Analyse ein, da diese den Durchfluss für jedes Protein enthält.
   4. Legen Sie eine weitere 48-Well-Auffangplatte in den Vakuumverteiler und waschen Sie dann jede Sepharosesäule mit 2 x 2 mL 10 mM Tris.
   5. Setzen Sie die erste 96-Well-Auffangplatte in den Verteiler ein, stellen Sie sicher, dass sich A1 in der oberen linken Ecke befindet, und pipetieren Sie dann 1 ml der ersten Salzkonzentration in jede Säule und schalten Sie dann die Vakuumpumpe ein, um diese durch die Säulen zu führen. Die Auffangplatte entfernen, mit Parafolie abdecken und zur Analyse bei 4 °C aufbewahren.
   6. Wiederholen Sie den Schritt für jede nachfolgende Salzkonzentration, die zum Eluierten verwendet wird. Stellen Sie sicher, dass für jede Elution eine neue Sammelplatte verwendet wird und dass jede Sammelplatte beschriftet und gelagert wird.
   7. Waschen Sie jede Säule mit 2 mL von 10 mM Tris, 4 M NaCl.
   8. Waschen Sie jede Säule mit 2 ml 20% Ethanol. Ethanol laufen lassen, bis es sich direkt über den Perlen befindet, und versiegeln Sie säulen für die Lagerung.
   9. Lagern Sie 96 Well-Sammelplatten und analysieren Sie sie mittels UV-Spektroskopie und SDS-PAGE.

Ergebnisse

So hat das MCPA beispielsweise 14 AbpSH3-Mutanten unter Denaturierungsbedingungen erfolgreich über Ni-NTA gereinigt (Abbildung 2A). Eine kleine Verunreinigung ~ 25 kDa ist zu sehen, jedoch ist das Protein immer noch weitgehend rein. Es wird angenommen, dass es sich bei dieser Verunreinigung um YodA handelt, ein häufiges co-gereinigtes Protein, das in E. coli¹¹gefundenwird. Abbildung 2B zeigt die Reinigung von 11 versch...

Diskussion

Die Methode ist robust und für relativ unerfahrene Proteinbiochemiker einfach zu bedienen, es gibt jedoch einige Überlegungen zu beachten.

Vorsicht bei Überfüllung von Sammelplatten

Die 48-Well-Auffangplatte selbst fasst nur 5 ml pro Vertiefung, während jede 96-Well nur 2 ml fasst. Dies muss beim Hinzufügen von Puffer und beim Durchlaufen der Probe durch die Säule berücksichtigt werden, da die Gefahr einer Überfüllung der Vertiefungen best...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL/ well collection plate	Agilent technologies	201240-100
5 mL/ well collection plate	Agilent technologies	201238-100
12 mL chromatography columns	Bio-Rad	7311550
96 well long drip plate	Agilent technologies	200919-100	Come with 0.25 um filters which are to be removed.
96 well plate seal/mat	Agilent technologies	201158-100	Should be peirceable
His60 Ni Superflow Resin	Takara Bio	635660
HiTrap Q HP anion exchange column	GE Healthcare (Cytiva)	17115301
Lvis plate reader	BMG LABTECH		Compatible with FLUOstar Omega plate reader
Male leur plugs	Cole-Parmer	EW-45503-70
PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kit	Sigma-Aldrich	575650-U
Reservoir collection plate	Agilent technologies	201244-100
The Repeater Plus	Eppendorf	2226020	With 5 mL and 50 mL syringes
VACUSAFE vacuum	INTEGRA	158 320	The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle