Ein wirtschaftliches und vielseitiges Hochdurchsatz-Proteinreinigungssystem mit einem Mehrsäulenplattenadapter

Zusammenfassung

Ein Mehrsäulenplattenadapter ermöglicht die Schnittstelle von Chromatographiesäulen mit Multi-Well-Sammelplatten für die parallele Affinitäts- oder Ionenaustauschreinigung, was eine wirtschaftliche Proteinreinigungsmethode mit hohem Durchsatz bietet. Es kann unter Schwerkraft oder Vakuum verwendet werden, wodurch Milligrammmengen an Protein über erschwingliche Instrumente erhalten werden.

Zusammenfassung

Die Proteinreinigung ist für die Untersuchung der Proteinstruktur und -funktion unerlässlich und wird normalerweise in Kombination mit biophysikalischen Techniken verwendet. Es ist auch eine Schlüsselkomponente bei der Entwicklung neuer Therapeutika. Die sich entwickelnde Ära der funktionellen Proteomik befeuert die Nachfrage nach Hochdurchsatz-Proteinreinigung und verbesserten Techniken, um dies zu erleichtern. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass ein Mehrsäulenplattenadapter (MCPA) mehrere Chromatographiesäulen verschiedener Harze mit Multi-Well-Platten zur parallelen Reinigung verbinden kann. Diese Methode bietet eine wirtschaftliche und vielseitige Methode der Proteinreinigung, die unter Schwerkraft oder Vakuum eingesetzt werden kann und mit der Geschwindigkeit eines automatisierten Systems mithalten kann. Das MCPA kann verwendet werden, um Milligramm-Ausbeute an Protein durch eine erschwingliche und zeiteffiziente Methode für die nachfolgende Charakterisierung und Analyse wiederherzustellen. Der MCPA wurde für die Hochdurchsatz-Affinitätsreinigung von SH3-Domänen verwendet. Der Ionenaustausch wurde auch über das MCPA demonstriert, um Proteine nach der Ni-NTA-Affinitätschromatographie zu reinigen, was darauf hinweist, wie dieses System an andere Reinigungstypen angepasst werden kann. Aufgrund des Aufbaus mit mehreren Spalten kann die individuelle Anpassung der Parameter in der gleichen Reinigung vorgenommen werden, was mit den aktuellen plattenbasierten Methoden nicht erreichbar ist.

Einleitung

Proteinreinigungstechniken, um Milligrammmengen an gereinigten Proteinen zu erreichen, sind für ihre Charakterisierung und Analyse unerlässlich, insbesondere für biophysikalische Methoden wie NMR. Die Proteinreinigung ist auch in anderen Studienbereichen wie Arzneimittelentdeckungsprozessen und Protein-Protein-Interaktionsstudien von zentraler Bedeutung. Das Erreichen solcher Mengen an reinem Protein kann jedoch zu^einemEngpass für diese Techniken werden 1^,2,3. Die Hauptmethode zur Proteinreinigung ist die Chromatographie, die eine Vielzahl von Methoden umfasst, die auf den in....

Protokoll

1. Denaturierung der Ni-NTA-Chromatographie

1. Vorbereiten von Puffern
   HINWEIS: Einzelheiten zu allen Puffern finden Sie in Tabelle 1.
   1. Machen Sie 500 ml 0,5 M NaOH, achten Sie darauf, zuerst das Milli-Q-Wasser hinzuzufügen und dann das NaOH langsam hinzuzufügen, während sich das Becherglas auf einem Rührer befindet. Filtern Sie mit einem 0,22 μm Filter.
   2. 100 ml 0,1 M Nickelsulfat vorbereiten und mit einem 0,22 μm Filter filtern.
   3. 50 ml 2 M Imidazol vorbereiten und mit einem 0,22 μm Filter filtern.
   4. 1,5 l Denaturierungspuffer bei pH 8,0, bestehend aus 5,3 mM Tris-HCl, 4,7 mM Tris-Base (Tr....

Ergebnisse

So hat das MCPA beispielsweise 14 AbpSH3-Mutanten unter Denaturierungsbedingungen erfolgreich über Ni-NTA gereinigt (Abbildung 2A). Eine kleine Verunreinigung ~ 25 kDa ist zu sehen, jedoch ist das Protein immer noch weitgehend rein. Es wird angenommen, dass es sich bei dieser Verunreinigung um YodA handelt, ein häufiges co-gereinigtes Protein, das in E. coli¹¹gefundenwird. Abbildung 2B zeigt die Reinigung von 11 versch.......

Diskussion

Die Methode ist robust und für relativ unerfahrene Proteinbiochemiker einfach zu bedienen, es gibt jedoch einige Überlegungen zu beachten.

Vorsicht bei Überfüllung von Sammelplatten

Die 48-Well-Auffangplatte selbst fasst nur 5 ml pro Vertiefung, während jede 96-Well nur 2 ml fasst. Dies muss beim Hinzufügen von Puffer und beim Durchlaufen der Probe durch die Säule berücksichtigt werden, da die Gefahr einer Überfüllung der Vertiefungen best.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL/ well collection plate	Agilent technologies	201240-100
5 mL/ well collection plate	Agilent technologies	201238-100
12 mL chromatography columns	Bio-Rad	7311550
96 well long drip plate	Agilent technologies	200919-100	Come with 0.25 um filters which are to be removed.
96 well plate seal/mat	Agilent technologies	201158-100	Should be peirceable
His60 Ni Superflow Resin	Takara Bio	635660
HiTrap Q HP anion exchange column	GE Healthcare (Cytiva)	17115301
Lvis plate reader	BMG LABTECH		Compatible with FLUOstar Omega plate reader
Male leur plugs	Cole-Parmer	EW-45503-70
PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kit	Sigma-Aldrich	575650-U
Reservoir collection plate	Agilent technologies	201244-100
The Repeater Plus	Eppendorf	2226020	With 5 mL and 50 mL syringes
VACUSAFE vacuum	INTEGRA	158 320	The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle