JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم تفاصيل الإجراءات المختبرية لتنشيط المختبر الخالي من المخدرات (IVA) لبصيلات المبيض للمرضى الذين يعانون من خلل المبيض الحاد. هذه الطريقة يمكن أن تزيد من عدد البويضات القابلة للاسترجاع لكل فرط تحفيز المبيض والاستفادة من الحفاظ على الخصوبة لهؤلاء المرضى.

Abstract

تنخفض وظيفة المبيض تدريجيا أثناء الشيخوخة وفي بعض الحالات المرضية الفسيولوجية بما في ذلك شذوذ النمط الكاريوتي وأمراض المناعة الذاتية والعلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي ، وكذلك جراحات المبيض. في النساء غير المتزوجات مع خلل حاد في المبيض، والحفاظ على الخصوبة مهم للحمل في المستقبل. على الرغم من أن الحفاظ على البويضات هو طريقة راسخة للحفاظ على الخصوبة، إلا أن هؤلاء المرضى لا يمكنهم الحفاظ إلا على عدد محدود من البويضات حتى بعد فرط تحفيز المبيض، مما يؤدي إلى تحفيز متكرر لضمان البويضات الكافية لضمان الحمل في المستقبل. لحل هذه المشكلة، قمنا مؤخرا بتطوير إجراء تنشيط المختبر الخالي من المخدرات (IVA)، والذي يمكننا من تحفيز المراحل المبكرة من بصيلات المبيض لتطويرها إلى مرحلة الجريب قبل البطني. يمكن لهذه بصيلات ما قبل الانترالية الاستجابة للبروتوكول الفريد لتحفيز gonadotropin ، مما يؤدي إلى زيادة عدد البويضات المستردة لكل تحفيز المبيض للحفاظ على التبريد. وIVA خالية من المخدرات تتألف من النهج الجراحي وتحفيز المبيض. لقد أزلنا جزءا من القشرة من أحد المبيضين أو كليهما من المرضى الذين خضعوا لجراحة بالمنظار. تم قطع الأنسجة القشرية المبيض إلى مكعبات صغيرة لتعطيل مسار إشارات فرس النهر وتحفيز تطور بصيلات المرحلة المبكرة. تم تطعيم هذه المكعبات بشكل متعاطو على المبيضين المتبقيين وكذلك تحت سيروسا قناتي فالوب. لقد نشرنا بالفعل الإجراء الجراحي ل IVA الخالي من الأدوية وبروتوكول تحفيز المبيض اللاحق ، ولكن هنا نقدم تفاصيل الطرق المختبرية المطلوبة ل IVA الخالية من المخدرات.

Introduction

وظيفة المبيض تنخفض تدريجيا خلال الشيخوخة وبعض الحالات المرضية الفسيولوجية بما في ذلك شذوذ karyotype، وأمراض المناعة الذاتية، والعلاج الكيميائي والإشعاعي، وجراحات المبيض. الحفاظ على الخصوبة هو واحد من أفضل الخيارات للنساء غير المتزوجات مع خلل حاد في المبيض للحفاظ على إمكاناتها للحمل في المستقبل. للحفاظ على الخصوبة، حاليا طريقتين متوفرة في الغالب في مجال الخصوبة أونكو. حفظ البويضات هو إجراء راسخ للحفاظ على الخصوبة وتم الإبلاغ عن العديد من الحالات الناجحة1،2. من ناحية أخرى، تم إنشاء أنسجة المبيض أيضا الحفاظ على الخصوبة في مرضى السرطان لكنها لا تزال استراتيجية تجريبية3،4. في كلتا الطريقتين، هناك حاجة إلى أعداد متعددة من البويضات الناضجة لحدوث الحمل. عموما, المرضى الذين يعانون من قصور المبيض المبكر (POI), الذين يصبحون انقطاع الطمث قبل 40 سنة من العمر, وأظهرت النساء في منتصف العمر مع انخفاض احتياطي المبيض استجابة المبيض الفقراء (POR) لتحفيز المبيض لتسفر عن البويضات ناضجة5,6,7. وعلاوة على ذلك، أظهر المرضى الصغار مع عدد قليل من بصيلات أنترال أيضا POR لتحفيز المبيض7. هؤلاء المرضى لديهم عدد محدود جدا من البويضات القابلة للاسترجاع حتى بعد فرط تحفيز المبيض السليم، مما يتطلب إجراءات مكلفة متعددة لضمان عدد كاف من البويضات للحمل.

التبرع بالبويضات يليه الإخصاب في المختبر (IVF) مع نقل الحيوانات المنوية والجنين للزوج (ET) هو الخيار الوحيد لهؤلاء المرضى POI وPO POR الذين يجدون صعوبة فيالحصولعلى البويضات الخاصة بهم 8و9و10. ومع ذلك، فإن التبرع بالبويضات معقد بسبب القضايا الأخلاقية وكذلك مضاعفات المناعة الذاتية والحمل11و12و13و14. لحل هذه القضايا، يتم إنشاء علاج العقم باستخدام البويضات الخاصة بالمرضى. بالنسبة لمرضى POI ، قمنا بتطوير نهج تنشيط المختبر (IVA) للسماح بنمو الجريبات الناجح وتوليد البويضات الناضجة ، مما يؤدي إلى عدد من حالات الحمل والولادة15. في IVA ، قمنا بتجزئة قشرة المبيض بعد إزالة المبيضين تحت جراحة بالمنظار وزرعناها لمدة يومين لتنشيط الجريبات بواسطة الأدوية المحفزة ل Akt ومن ثم إجراء تطعيم غير نظائري مرة أخرى في حقائب اصطناعية مصنوعة تحت سيروسا قناتي فالوب تحت الجراحة الثانية بالمنظار15. هذا الإجراء عزز نمو بصيلات بدائية, الأولية والثانوية بعد تجزئة قشرة المبيض لتعزيز فرس النهر الإشارات اضطراب16, تليها ثقافة يومين مع Akt إشارات المحفزات17.

على النقيض من حالات POI الشديدة ، فإن مرضى POR الذين يعانون من انخفاض احتياطي المبيض لديهم بصيلات ثانوية متعددة. لأن اضطراب إشارات فرس النهر وحده فعال في تعزيز نمو الجريبات الثانوية16، فقد أظهرنا مؤخرا حالات حمل وولادات ناجحة لمرضى POR باستخدام إجراء IVA الخالي من المخدرات الذي ينطوي على تجزئة القشرية وتطعيم العظام دون علاج للأدوية المحفزة Akt. IVA خالية من المخدرات يحفز المرحلة المبكرة من بصيلات المبيض لتطوير إلى مرحلة بصيلات ما قبل الرتيل بعد عملية جراحية واحدة فقط وزيادة عدد البويضات المستردة لنقل التلقيح الاصطناعي الجنين15,18. نهج IVA خالية من المخدرات له العديد من المزايا بالمقارنة مع IVA الأصلي لدينا من قبل 1) تجنب فقدان الجريب المحتملة خلال الثقافة، 2) التقليل من الغازية وتكاليف الجراحة الثانية، 3) التي تنطوي فقط على المدى القصير بعد الجراحة بقية السرير و 4) المحتملة للحمل العفوي بسبب التطعيم التقويمي. نشرنا مؤخرا مقال فيديو يظهر العمليات الجراحية للعقاقير خالية من IVA19 وبروتوكولات مفصلة لتحفيز المبيض بعد الجراحة20. هنا، نقدم تفاصيل الطرق المختبرية المطلوبة لIVA خالية من المخدرات.

Protocol

تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من كل مريض POR مع انخفاض احتياطي المبيض الذين التحقوا في علاج IVA الخالي من المخدرات. وقد وافقت اللجنة الأخلاقية للجامعة الدولية للصحة والرعاية الاجتماعية (رقم 17-S-21) على هذه الدراسة. تم تسجيل التجارب السريرية تحت رقم UMIN000034464 وأجريت وفقا لمدونة أخلاقيات الجمعية الطبية العالمية (إعلان هلسنكي).

1. استخراج قشرة المبيض

  1. إزالة جزء من قشرة المبيض (10 × 10 ملم، 2-3 مم سمك) من واحد أو كلا المبيضين تحت التخدير العام من خلال جراحة بالمنظار كما هو موضح سابقا19،20.
  2. ضع قشرة المبيض المجمعة في وعاء معقم يحتوي على 10 مل من HTF المعدل (mHTF) عند 37 درجة مئوية.

2. تجزئة قشرة المبيض

ملاحظة: قبل تشريح قشرة المبيض، قم بإحماء mHTF إلى 37 درجة مئوية. الحفاظ على الظروف العقيمة طوال العملية. يتم سرد كافة أدوات هذا الإجراء في جدول المواد.

  1. ضع قشرة المبيض التي تم جمعها في طبق بلاستيكي يحتوي على 5-10 مل من mHTF عند 37 درجة مئوية ووضعها على لوحة الحرارة للحفاظ على الأنسجة عند 37 درجة مئوية(الشكل 2A).
  2. التقاط صورة لكل قشرة باستخدام كاميرا رقمية مع اسم المريض قبل البدء في الإجراء التالي لربط بيانات خلفية المريض.
  3. ضع قشرة فردية على شاش معقم مرطب ب mHTF (الشكل 2B).
    ملاحظة: تطبيق mHTF إضافية مع ماصة المتاح على الشاش لمنع سطح القشرة التي تجفف خلال هذا الإجراء.
  4. إزالة الأنسجة النخاعية المتبقية حيث تبدو وردية باستخدام مقص صغير بحيث سمك الأنسجة تصل إلى 1-2 مم(الشكل 2C و D).
    ملاحظة: لتجنب فقدان بصيلات في مرحلة مبكرة، لا تعد الشرائط القشرية أقل من 1 مم في سمك، لأن بصيلات المرحلة المبكرة تقع ضمن 1-2 مم من سطح قشرة المبيض21.
  5. تشريح 1 مم × 1 مم × 5 مم من قطعة الأنسجة من كل شريط قشري المبيض باستخدام مشرط غرامة وإخضاعها للتحليل النسيجي لتحديد وجود بصيلات المتبقية كما هو موضح سابقا18 (الشكل 2E).
    ملاحظة: الأنسجة تشريح لعلم الأنسجة مغمورة في mHTF والحفاظ على 4 درجة مئوية حتى تحديد (الشكل 2F، انظر الخطوة 4).
  6. قطع القشرة إلى شرائط 1mm × 1 مم × 10 ملم باستخدام مشرط غرامة (الشكل 2G).
    ملاحظة: من الأسهل قطع عن طريق الضغط على مشرط من سحب على ذلك.
  7. قطع هذه الشرائط الأنسجة إلى 1 مم × 1 مم × 1 مم مكعبات صغيرة (الشكل 2H).
    ملاحظة: لتجنب تغيرات الضغط التناضحي في الوسط، أضف mHTF باعتدال قبل التجذيف الذاتي للأنسجة.

3. التطعيم التلقائي للشظايا القشرية المبيض

  1. فتح حزمة من قنية IVA ووضعها على الستائر العقيمة.
  2. شطف داخل قنية IVA مع mHTF عن طريق التجسس وتفريغ mHTF عدة مرات.
  3. أسبيرات 100-200 ميكرولتر من mHTF لملء غيض من IVA cannula لتجنب مكعبات القشرية من الجفاف أثناء التحميل (الشكل 3A).
  4. تحميل مكعبات القشرية في غيض من IVA cannula باستخدام ملاقط غرامة (الشكل 3B-E).
    ملاحظة: يعتمد عدد المكعبات القشرية للتحميل على موقع التطعيم. عموما, 20-30 مكعبات يمكن زرعها في المبيض العظام المتبقية, في حين يمكن زرع 10-15 مكعبات في الحقيبة تحت سيروسا من قناة فالوب.
  5. بعد تحميل المكعبات القشرية، أمسك بطرف القنية الذي يحتوي على مكعبات القشرية من الأصابع حتى نقل قنية IVA إلى جراح. وهذا سوف تجنب درجة حرارة المكعب إلى انخفاض.
    ملاحظة: تم الإبلاغ عن تفاصيل إجراء الحمل الذاتي تحت جراحة بالمنظار سابقا19. لترقيع مكعبات قشرية المبيض، تم تطوير جهاز على شكل قنية (IVA cannula) من قبل المتعاون لدينا، شركة كيتازاتو.

4. التحليل النسيجي لقشرة المبيض

ملاحظة: لحساب عدد بصيلات المتبقية، إجراء تحليل النسيجية كما وصف سابقا15.

  1. وضع علامة على سطح الشريط القشري مع صبغة وضع علامات على الأنسجة قبل تثبيت العينة. وهذا يشير إلى جانب القشرة في قطاع لعلم الأنسجة.
  2. إصلاح شرائط الأنسجة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية باستخدام محلول بوين.
    ملاحظة: للكشف عن بصيلات اللاذكار، لا نوصي باستخدام paraformaldehyde لتحديد لتجنب انكماش السيتوبلازم البويضات.
  3. الجفاف وتضمين شرائح الأنسجة في البارافين.
  4. مقطع تسلسلي كتلة البارافين التي تحتوي على عينة الأنسجة.
  5. وصمة عار كل قسم باستخدام الهيماتوكسيلين واليوزين لتصور بصيلات.
  6. عد بصيلات كما سبق وصفها17.

النتائج

في أول نشر لنهج IVA15، قمنا بزرع مكعبات المبيض القشرية واحدا تلو الآخر في مواقع التطعيم تحت جراحة بالمنظار(الشكل 1A). نظرا لاستخدام 100-150 مكعبات المبيض ، استغرق الأمر 3-4 ساعات لتطعيم الأنسجة تحت جراحة بالمنظار. أيضا، فقدت بعض مكعبات المبيض قبل التطعيم. لأن IVA cannula يم?...

Discussion

في هذه المخطوطة، عرضنا بروتوكول مختبر مفصل ل IVA الخالي من المخدرات. وIVA خالية من المخدرات هو نهج جديد لعلاج العقم لمريض POR مع انخفاض احتياطي المبيض لتعزيز نمو الجريبات الثانوية، مما أدى إلى إنتاج البويضات أكثر نضجا بعد تحفيز المبيض وزيادة في الحمل الناجح20. في 15 مريضا POR مع انخفا...

Disclosures

ويؤكد صاحبا البلاغ أنه ليس بينهما تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نشكر تاتسوجي إيهانا، ساتشيو كوريموتو، كازوكو تاكاهاسيه، يوكي يوشيزاوا، ماهو أراشي، كينتارو فوجيتا، إيرينا كودو، يوكا كوريموتو ومايوكو واكاتسوكي لدعمهم إجراء IVA الخالي من المخدرات والبروفيسور آرون ج. و. هسويه (كلية الطب بجامعة ستانفورد، ستانفورد، كاليفورنيا) على القراءة النقدية وتحرير المخطوطة. كما نشكر ريبيكا ترومان وغريغوري ترومان لإدراج السرد الإنجليزي. وقد دعمت هذه الدراسة الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS)، والبحث العلمي B (19H03801)، والبحوث الاستكشافية الصعبة (18K19624).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
4.5 onz specimen containerFALCON354013Other products may also be suitable
60mm dishFALCON351007Other products may also be suitable
50 x 50 cm sterile drapeHOGY MedicalSR-823Any type of sterile produsts may also be suitable
Disposable pippeteFALCON357575Other products may also be suitable
Fine scissors, CurvedWPI#14224-GAlthough other products may also be suitable, we strongly recommend use this products
Hot plateTOKAI HITTPiE-SPUse at operation room to maintain the temperature of dishes containing ovarian tissue before transplantation
Human Serum Albumin SolutionIrvine Scientific9988Medium for handling ovarian tissue
IVA cannuleKITAZATO446030 IVA-6030ESpecific cannula for tissue autografting
KAI medical Disposable scalpelWPI#5 10-AAlthough other products may also be suitable, we strongly recommend use this products
Micro scissors, CurvedWPI#503364Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products
Modified HTF Medium-HEPESIrvine Scientific90126Medium for handling ovarian tissue
Sterile gauzeOsaki Medical15004Any type of sterile produsts may also be suitable
Swiss Tweezers, Curved TipsKAI#504505Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products

References

  1. Liang, T., Motan, T. Mature Oocyte Cryopreservation for Fertility Preservation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 951, 155-161 (2016).
  2. Yoon, T. K., et al. Live births after vitrification of oocytes in a stimulated in vitro fertilization-embryo transfer program. Fertility and Sterility. 79 (6), 1323-1326 (2003).
  3. Donnez, J., et al. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. Lancet. 364 (9443), 1405-1410 (2004).
  4. Meirow, D., et al. Pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a patient with ovarian failure after chemotherapy. New England Journal of Medicine. 353 (3), 318-321 (2005).
  5. De Vos, M., Devroey, P., Fauser, B. C. Primary ovarian insufficiency. Lancet. 376 (9744), 911-921 (2010).
  6. Scott, R. T., et al. Follicle-stimulating hormone levels on cycle day 3 are predictive of in vitro fertilization outcome. Fertility and Sterility. 51 (4), 651-654 (1989).
  7. Ferraretti, A. P., et al. ESHRE consensus on the definition of 'poor response' to ovarian stimulation for in vitro fertilization: the Bologna criteria. Human Reproduction. 26 (7), 1616-1624 (2011).
  8. Huhtaniemi, I., et al. Advances in the Molecular Pathophysiology, Genetics, and Treatment of Primary Ovarian Insufficiency. Trends in Endocrinology and Metabolism. 29 (6), 400-419 (2018).
  9. Męczekalski, B., Maciejewska-Jeske, M., Podfigurna, A. Reproduction in premature ovarian insufficiency patients - from latest studies to therapeutic approach. Prz Menopauzalny. 17 (3), 117-119 (2018).
  10. Baker, V. Life plans and family-building options for women with primary ovarian insufficiency. Seminars in Reproductive Medicine. 29 (4), 362-372 (2011).
  11. Englert, Y., Govaerts, I. Oocyte donation: particular technical and ethical aspects. Human Reproduction. 13, 90-97 (1998).
  12. Englert, Y., Rodesch, C., Laruelle, C., Govoerts, I. Oocyte donation: ethical aspects related to the donor. Contraception, Fertilite, Sexualite. 25 (3), 251-257 (1997).
  13. Storgaard, M., et al. Obstetric and neonatal complications in pregnancies conceived after oocyte donation: a systematic review and meta-analysis. BJOG: An International Journal of Obstetrics and Gynaecology. 124 (4), 561-572 (2017).
  14. Storgaard, M., Malchau, S., Loft, A., Larsen, E., Pinborg, A. Oocyte donation is associated with an increased risk of complications in the pregnant woman and the fetus. Ugeskrift for Laeger. 179 (11), (2017).
  15. Kawamura, K., et al. Hippo signaling disruption and Akt stimulation of ovarian follicles for infertility treatment. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17474-17479 (2013).
  16. Hsueh, A. J., Kawamura, K., Cheng, Y., Fauser, B. C. Intraovarian control of early folliculogenesis. Endocrine Reviews. 36 (1), 1-24 (2015).
  17. Li, J., et al. Activation of dormant ovarian follicles to generate mature eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10280-10284 (2010).
  18. Suzuki, N., et al. Successful fertility preservation following ovarian tissue vitrification in patients with primary ovarian insufficiency. Human Reproduction. 30 (3), 608-615 (2015).
  19. Tanaka, Y., Hsueh, A. J., Kawamura, K. Surgical approaches of drug-free in activation and laparoscopic ovarian incision to treat patients with ovarian infertility. Fertility and Sterility. , (2020).
  20. Kawamura, K., Ishizuka, B., Hsueh, A. J. W. Drug-free in-vitro activation of follicles for infertility treatment in poor ovarian response patients with decreased ovarian reserve. Reproductive Biomedicine Online. 40 (2), 245-253 (2020).
  21. Haino, T., et al. Determination of Follicular Localization in Human Ovarian Cortex for Vitrification. Journal of Adolescent and Young Adult Oncology. 7 (1), 46-53 (2018).
  22. Baird, D. T., Webb, R., Campbell, B. K., Harkness, L. M., Gosden, R. G. Long-term ovarian function in sheep after ovariectomy and transplantation of autografts stored at -196 C. Endocrinology. 140 (1), 462-471 (1999).
  23. Qin, Y., Jiao, X., Simpson, J. L., Chen, Z. J. Genetics of primary ovarian insufficiency: new developments and opportunities. Human Reproduction Update. 21 (6), 787-808 (2015).
  24. Domniz, N., Meirow, D. Premature ovarian insufficiency and autoimmune diseases. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 60, 42-55 (2019).
  25. Laven, J. S. Primary Ovarian Insufficiency. Seminars in Reproductive Medicine. 34 (4), 230-234 (2016).
  26. Grynberg, M., et al. Fertility preservation in Turner syndrome. Fertility and Sterility. 105 (1), 13-19 (2016).
  27. Tomao, F., Spinelli, G. P., Panici, P. B., Frati, L., Tomao, S. Ovarian function, reproduction and strategies for fertility preservation after breast cancer. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 76 (1), 1-12 (2010).
  28. Kim, S., Lee, Y., Lee, S., Kim, T. Ovarian tissue cryopreservation and transplantation in patients with cancer. Obstetrics & Gynecology Science. 61 (4), 431-442 (2018).
  29. Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue freezing: current status. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 27 (3), 222-230 (2015).
  30. Wu, R. C., Kuo, P. L., Lin, S. J., Liu, C. H., Tzeng, C. C. X chromosome mosaicism in patients with recurrent abortion or premature ovarian failure. Journal of the Formosan Medical Association. 92 (11), 953-956 (1993).
  31. De Munck, N., Vajta, G. Safety and efficiency of oocyte vitrification. Cryobiology. 78, 119-127 (2017).
  32. Argyle, C. E., Harper, J. C., Davies, M. C. Oocyte cryopreservation: where are we now. Human Reproduction Update. 22 (4), 440-449 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

169 IVA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved