JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Ağır yumurtalık disfonksiyonu olan hastalar için yumurtalık foliküllerinin ilaçsız in vitro aktivasyonu (IVA) için laboratuvar prosedürlerinin ayrıntılarını sunuyoruz. Bu yöntem yumurtalık hiperstimülasyonu başına alınabilir oosit sayısını artırabilir ve bu hastalar için doğurganlık korumasına fayda sağlayabilir.

Özet

Yumurtalık fonksiyonu yaşlanma sırasında ve karyotip anormalliği, otoimmün hastalıklar, kemoterapi ve radyasyon terapileri ve yumurtalık ameliyatları da dahil olmak üzere bazı patofizyolojik durumlarda giderek azalır. Şiddetli yumurtalık disfonksiyonu olan evli olmayan kadınlarda, doğurganlık koruması gelecekteki gebelikler için önemlidir. Her ne kadar oosit kriyoprezervasyonu doğurganlığın korunması için yerleşik bir yöntem olsa da, bu hastalar yumurtalık hiperstimülasyonundan sonra bile sadece sınırlı sayıda oosit koruyabilir ve gelecekteki gebeliği garanti etmek için yeterli oosit sağlamak için tekrarlanan stimülasyonlara yol açabilir. Bu sorunu çözmek için, yakın zamanda yumurtalık foliküllerinin erken evrelerini preantral folikül aşamasına kadar geliştirmemizi sağlayan ilaçsız bir in vitro aktivasyon (IVA) prosedürü geliştirdik. Bu preantral foliküller gonadotropin stimülasyonunun benzersiz protokolüne yanıt verebilir, bu da kriyoprezervasyon için yumurtalık stimülasyonu başına alınan oosit sayısının artmasına neden olur. İlaçsız IVA cerrahi yaklaşım ve yumurtalık stimülasyonundan oluşuyordu. Laparoskopik cerrahi altındaki hastalardan bir veya her iki yumurtalıktan korteksin bir kısmını çıkardık. Yumurtalık kortikal dokuları, Hippo sinyal yolunu bozmak ve erken evre foliküllerin gelişimini teşvik etmek için küçük küpler halinde kesildi. Bu küpler ortotropik olarak kalan yumurtalıklara ve her iki Fallop tüpünün serosasının altına aşılandı. İlaçsız IVA'nın cerrahi prosedürünü ve sonraki yumurtalık stimülasyon protokolünü zaten yayınladık, ancak burada ilaçsız IVA için gerekli laboratuvar yöntemlerinin ayrıntılarını sunuyoruz.

Giriş

Yumurtalık fonksiyonu yaşlanma sırasında ve karyotip anormalliği, otoimmün hastalıklar, kemoterapi ve radyasyon tedavileri ve yumurtalık ameliyatları gibi bazı patofizyolojik durumlar sırasında giderek azalır. Doğurganlığın korunması, gelecekteki gebelik potansiyellerini korumak için şiddetli yumurtalık disfonksiyonu olan evli olmayan kadınlar için en iyi seçeneklerden biridir. Doğurganlığın korunması için, şu anda çoğunlukla onko-doğurganlık alanında iki yöntem mevcuttur. Oosit kriyoprezervasyonu, doğurganlığın korunması için iyi kurulmuş bir prosedürdür ve birçok başarılı vaka bildirilmiştir1,2. Öte yandan, kanser hastalarında doğurganlığın korunması için yumurtalık dokusu kriyoprezervasyonu da kurulmuştur, ancak yine de deneysel bir stratejidir3,4. Her iki yöntemde de gebeliğin gerçekleşmesi için birden fazla sayıda olgun oosit gereklidir. Genellikle, prematüre yumurtalık yetersizliği (POI) olan hastalar, 40 yaşından önce amenore haline gelen ve düşük yumurtalık rezervine sahip orta yaşlı kadınlar, olgun oositler5,6,7vermek için yumurtalık stimülasyonuna zayıf yumurtalık yanıtı (POR) göstermiştir. Ayrıca, antral folikül sayısı düşük olan genç hastalar da yumurtalık stimülasyonuna POR göstermiştir7. Bu hastalar, uygun yumurtalık hiperstimülasyonundan sonra bile çok sınırlı sayıda alınabilir oositlere sahiptir, bu nedenle hamilelik için yeterli sayıda oosit sağlamak için birden fazla pahalı prosedür gerektirir.

Oosit bağışı ve ardından kocanın sperm ve embriyo transferi (ET) ile in vitro fertilizasyon (IVF) kendi oositlerini elde etmekte zorlanan bu POI ve POR hastaları için tek seçenek8,9,10. Bununla birlikte, oosit bağışı etik konuların yanı sıra otoimmün ve gebelik komplikasyonları11 , 12,13,14ile karmaşıktır. Bu sorunların çözümü için hastaların kendi oositleri kullanılarak kısırlık tedavisinin kurulması istenmek istenmemektedir. İçN hastaları için, başarılı folikül büyümesine ve olgun oositlerin üretilmesine izin vermek için in vitro aktivasyon (IVA) yaklaşımını geliştirdik, bir dizi hamilelik ve doğuma öncülükediyoruz 15. IVA'da, laparoskopik cerrahi altında yumurtalıkların çıkarılmasından sonra yumurtalık kortekslerini parçaladık ve Akt uyarıcı ilaçlarla folikülleri aktive etmek için iki gün boyunca kültürledik ve daha sonra ikinci laparoskopik cerrahi altında Fallop tüplerinin serosasının altında yapılan yapay torbalara heterotopik greftleme gerçekleştirdik15. Bu prosedür, Hippo sinyal bozulmasını teşvik etmek için yumurtalık korteks parçalanması sonrası ilkel, birincil ve ikincil foliküllerin büyümesini teşvik etti16, ardından Akt sinyal uyarıcıları ile iki günlük kültür17.

Şiddetli İçN vakalarının aksine, yumurtalık rezervi azalmış POR hastalarında birden fazla sekonder folikül vardır. Hippo sinyal bozulması tek başına ikincil folikül büyümesini teşvik etmede etkili olduğundan16, son zamanlarda Akt uyarıcı ilaçların tedavisi olmadan kortikal parçalanma ve ortotopik greftleme içeren ilaçsız IVA prosedürünü kullanarak POR hastaları için başarılı gebelikler ve doğumlar gösterdik. İlaçsız IVA, yumurtalık foliküllerinin erken evresini sadece bir ameliyattan sonra preantral folikül aşamasına gelişmesi için uyarır ve IVF-embriyo transferi için alınan oosit sayısını artırır15,18. İlaçsız IVA yaklaşımı, orijinal IVA'mızla karşılaştırıldığında 1) kültür sırasında potansiyel folikül kaybından kaçınmak, 2) ikinci ameliyatın invazivliğini ve maliyetlerini en aza indirmek, 3) sadece kısa süreli ameliyat sonrası yatak istirahatini ve 4) ortotopik aşılamaya bağlı spontan gebelik potansiyelini içeren çeşitli avantajlara sahiptir. Kısa bir süre önce ilaçsız IVA19'un cerrahi prosedürlerini ve ameliyattan sonra yumurtalık stimülasyonunun ayrıntılı protokollerini gösteren bir video makale yayınladık20. Burada, ilaçsız IVA için gerekli laboratuvar yöntemlerinin ayrıntılarını sunuyoruz.

Protokol

İlaçsız IVA tedavisine kaydolan yumurtalık rezervi azalan her POR hastasından yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. Bu çalışma Uluslararası Sağlık ve Refah Üniversitesi etik komitesi (No. 17-S-21) tarafından onaylanmıştır. Klinik çalışma UMIN000034464 numarası altında kaydedilmiş ve Dünya Tabipler Birliği Etik Kuralları (Helsinki Bildirgesi) uyarınca gerçekleştirilmiştir.

1. Yumurtalık korteksi ekstraksiyonu

  1. Yumurtalık korteksinin bir kısmını (10 x 10 mm, 2-3 mm kalınlık) daha önce açıklandığı gibi laparoskopik cerrahi ile genel anestezi altında bir veya her iki yumurtalıktan çıkarın19,20.
  2. Toplanan yumurtalık kortekslerini 37 °C'de 10 mL modifiye HTF (mHTF) içeren steril bir kaba yerleştirin.

2. Yumurtalık korteksi parçalanması

NOT: Yumurtalık korteksinin diseksiyonu öncesinde mHTF'yi 37 °C'ye ısıtın. İşlem boyunca steril koşulları koruyun. Bu yordamın tüm araçları Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

  1. Toplanan yumurtalık kortekslerini 37 °C'de 5-10 mL mHTF içeren plastik bir kaba yerleştirin ve dokuyu 37 °C'de tutmak için ısı plakasınayerleştirin (Şekil 2A).
  2. Hasta arka plan verilerini bağlamak için bir sonraki prosedüre başlamadan önce hastanın adının yer alacağı bir dijital kamera kullanarak her korteksin fotoğrafını çekin.
  3. mHTF ile nemlendirilmiş steril bir gazlı bez üzerine tek bir korteks yerleştirin (Şekil 2B).
    NOT: Bu işlem sırasında korteks yüzeyinin kurumasını önlemek için gazlı bez üzerine tek kullanımlık pipet ile ek mHTF uygulayın.
  4. Doku kalınlığının 1-2 mm'ye ulaşması için mikro makas kullanarak pembe görünen artık medulla dokusunu çıkarın(Şekil 2C ve D).
    NOT: Erken aşamada folikül kaybını önlemek için, kortikal şeritleri kalınlığı 1 mm'den az hazırlamayın, çünkü erken evre foliküller yumurtalık korteksi21yüzeyinden 1-2 mm içinde bulunur.
  5. Her yumurtalık kortikal şeridinden ince bir neşter kullanarak 1 mm x 1 mm x 5 mm'lik bir doku parçasını parçalara ayırın ve daha önce açıklandığı gibi artık foliküllerin varlığını belirlemek için histolojik analize tabi tutulun18 (Şekil 2E).
    NOT: Histoloji için parçalanmış dokular mHTF'ye daldırılır ve sabitlenene kadar 4 °C'de tutar (Şekil 2F, bkz. Adım 4).
  6. Korteksi ince bir neşter kullanarak 1 mm x 1 mm x 10 mm şeritler halinde kesin (Şekil 2G).
    NOT: Neşterin üzerine bastırarak kesmek, üzerine çekmekten daha kolaydır.
  7. Bu doku şeritlerini 1 mm x 1 mm x 1 mm küçük küpler halinde kesin (Şekil 2H).
    NOT: Ortamdaki ozmotik basınç değişikliklerini önlemek için, doku otomatikgrafasyonundan önce ılımlı olarak mHTF ekleyin.

3. Yumurtalık kortikal parçalarının otomatik olarak aşılanması

  1. IVA cannula paketini açın ve steril bir örtüye koyun.
  2. MHTF'yi birkaç kez aspire ederek ve boşaltarak mHTF ile IVA canüllerinin içini durulayın.
  3. Yükleme sırasında kortikal küplerin kurumasını önlemek için IVA canülünün ucunu doldurmak için 100-200 μL mHTF epiratlayın (Şekil 3A).
  4. Kortikal küpleri ince bir cımbız kullanarak IVA canülünün ucuna yükleyin (Şekil 3B-E).
    NOT: Yükleme için kortikal küplerin sayısı aşılama bölgesine bağlıdır. Genellikle, 20-30 küp ortotropik kalan bir yumurtalığa nakledilebilirken, Fallop tüpünün serosasının altındaki bir keseye 10-15 küp nakledilebilir.
  5. Kortikal küpleri yükledikten sonra, IVA canülünü bir cerraha aktarana kadar kortikal küpleri içeren damarın ucunu parmaklarından tutun. Bu, küp sıcaklığının düşmesini önleyecektir.
    NOT: Laparoskopik cerrahi altında otografting prosedürünün detayları daha öncebildirilmiştir 19. Yumurtalık kortikal küplerinin aşıları için, işbirlikçimiz Kitazato Corporation tarafından kavun şeklinde bir cihaz (IVA cannula) geliştirilmiştir.

4. Yumurtalık korteksinin histolojik analizi

NOT: Kalan folikül sayısını saymak için, daha önce açıklandığı gibi histolojik analiz yapın15.

  1. Örnek fiksasyondan önce kortikal şerit yüzeyini bir doku işaretleme boyası ile işaretleyin. Bu, korteksin histoloji için şeritteki tarafını gösterecektir.
  2. Bouin'in çözeltisini kullanarak doku şeritlerini gece boyunca 4 °C'de sabitle.
    NOT: Atretic folikülleri tespit etmek için, oosit sitoplazmasının büzülmesini önlemek için sabitleme için paraformaldehit kullanılmasını önermiyoruz.
  3. Doku şeritlerini parafin içine susuz ve gömün.
  4. Doku örneğini içeren parafin bloğunu seri olarak bölümlere ayrın.
  5. Folikülleri görselleştirmek için hematoksilin ve eozin kullanarak her bölümü lekele.
  6. Folikülleri daha önce açıklandığı gibi sayın17.

Sonuçlar

IVA yaklaşım15'inilk yayınında yumurtalık kortikal küplerini laparoskopik cerrahi altında aşılama bölgelerine tek tek naklettik (Şekil 1A). 100-150 yumurtalık küpü kullanıldığı için laparoskopik cerrahi altında doku nakli 3-4 saat sürdü. Ayrıca, aşılamadan önce bazı yumurtalık küpleri kaybedildi. Çünkü IVA canül bir seferde 20-30 küpü bir aşılama bölgesine aktarabiliyordu(Şekil 1B), ameliyat süresin...

Tartışmalar

Bu yazıda, ilaçsız IVA için ayrıntılı bir laboratuvar protokolü gösterdik. İlaçsız IVA, ikincil folikül büyümesini teşvik etmek için yumurtalık rezervi azalan POR hastası için yeni bir kısırlık tedavisi yaklaşımıdır, yumurtalık stimülasyonundan sonra daha olgun oositler elde edilmesine ve başarılı gebelikte artmasına neden olur20. Yumurtalık rezervi azalan 15 POR hastasında, bu yaklaşım bir spontan gebelik elde etti, in vitro fertilizasyon-embriyo transferi, de...

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını doğruluyorlar.

Teşekkürler

Tatsuji Ihana, Sachiyo Kurimoto, Kazuko Takahasih, Yuki Yoshizawa, Maho Arashi, Kentaro Fujita, Erina Kudo, Yuka Kurimoto ve Mayuko Wakatsuki'ye ilaçsız IVA prosedürünü desteklemiş oldukları için ve Prof. Aaron J.W. Hsueh'e (Stanford Üniversitesi Tıp Fakültesi, Stanford, CA) makalenin eleştirel okunması ve düzenlenmesi için teşekkür ederiz. Rebecca Truman ve Gregory Truman'a da İngilizce anlatım ekledikleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma Japonya Bilimi Destekleme Derneği (JSPS), Bilimsel Araştırma B (19H03801) ve Zorlu Keşif Araştırmaları (18K19624) tarafından desteklendi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
4.5 onz specimen containerFALCON354013Other products may also be suitable
60mm dishFALCON351007Other products may also be suitable
50 x 50 cm sterile drapeHOGY MedicalSR-823Any type of sterile produsts may also be suitable
Disposable pippeteFALCON357575Other products may also be suitable
Fine scissors, CurvedWPI#14224-GAlthough other products may also be suitable, we strongly recommend use this products
Hot plateTOKAI HITTPiE-SPUse at operation room to maintain the temperature of dishes containing ovarian tissue before transplantation
Human Serum Albumin SolutionIrvine Scientific9988Medium for handling ovarian tissue
IVA cannuleKITAZATO446030 IVA-6030ESpecific cannula for tissue autografting
KAI medical Disposable scalpelWPI#5 10-AAlthough other products may also be suitable, we strongly recommend use this products
Micro scissors, CurvedWPI#503364Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products
Modified HTF Medium-HEPESIrvine Scientific90126Medium for handling ovarian tissue
Sterile gauzeOsaki Medical15004Any type of sterile produsts may also be suitable
Swiss Tweezers, Curved TipsKAI#504505Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products

Referanslar

  1. Liang, T., Motan, T. Mature Oocyte Cryopreservation for Fertility Preservation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 951, 155-161 (2016).
  2. Yoon, T. K., et al. Live births after vitrification of oocytes in a stimulated in vitro fertilization-embryo transfer program. Fertility and Sterility. 79 (6), 1323-1326 (2003).
  3. Donnez, J., et al. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. Lancet. 364 (9443), 1405-1410 (2004).
  4. Meirow, D., et al. Pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a patient with ovarian failure after chemotherapy. New England Journal of Medicine. 353 (3), 318-321 (2005).
  5. De Vos, M., Devroey, P., Fauser, B. C. Primary ovarian insufficiency. Lancet. 376 (9744), 911-921 (2010).
  6. Scott, R. T., et al. Follicle-stimulating hormone levels on cycle day 3 are predictive of in vitro fertilization outcome. Fertility and Sterility. 51 (4), 651-654 (1989).
  7. Ferraretti, A. P., et al. ESHRE consensus on the definition of 'poor response' to ovarian stimulation for in vitro fertilization: the Bologna criteria. Human Reproduction. 26 (7), 1616-1624 (2011).
  8. Huhtaniemi, I., et al. Advances in the Molecular Pathophysiology, Genetics, and Treatment of Primary Ovarian Insufficiency. Trends in Endocrinology and Metabolism. 29 (6), 400-419 (2018).
  9. Męczekalski, B., Maciejewska-Jeske, M., Podfigurna, A. Reproduction in premature ovarian insufficiency patients - from latest studies to therapeutic approach. Prz Menopauzalny. 17 (3), 117-119 (2018).
  10. Baker, V. Life plans and family-building options for women with primary ovarian insufficiency. Seminars in Reproductive Medicine. 29 (4), 362-372 (2011).
  11. Englert, Y., Govaerts, I. Oocyte donation: particular technical and ethical aspects. Human Reproduction. 13, 90-97 (1998).
  12. Englert, Y., Rodesch, C., Laruelle, C., Govoerts, I. Oocyte donation: ethical aspects related to the donor. Contraception, Fertilite, Sexualite. 25 (3), 251-257 (1997).
  13. Storgaard, M., et al. Obstetric and neonatal complications in pregnancies conceived after oocyte donation: a systematic review and meta-analysis. BJOG: An International Journal of Obstetrics and Gynaecology. 124 (4), 561-572 (2017).
  14. Storgaard, M., Malchau, S., Loft, A., Larsen, E., Pinborg, A. Oocyte donation is associated with an increased risk of complications in the pregnant woman and the fetus. Ugeskrift for Laeger. 179 (11), (2017).
  15. Kawamura, K., et al. Hippo signaling disruption and Akt stimulation of ovarian follicles for infertility treatment. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17474-17479 (2013).
  16. Hsueh, A. J., Kawamura, K., Cheng, Y., Fauser, B. C. Intraovarian control of early folliculogenesis. Endocrine Reviews. 36 (1), 1-24 (2015).
  17. Li, J., et al. Activation of dormant ovarian follicles to generate mature eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10280-10284 (2010).
  18. Suzuki, N., et al. Successful fertility preservation following ovarian tissue vitrification in patients with primary ovarian insufficiency. Human Reproduction. 30 (3), 608-615 (2015).
  19. Tanaka, Y., Hsueh, A. J., Kawamura, K. Surgical approaches of drug-free in activation and laparoscopic ovarian incision to treat patients with ovarian infertility. Fertility and Sterility. , (2020).
  20. Kawamura, K., Ishizuka, B., Hsueh, A. J. W. Drug-free in-vitro activation of follicles for infertility treatment in poor ovarian response patients with decreased ovarian reserve. Reproductive Biomedicine Online. 40 (2), 245-253 (2020).
  21. Haino, T., et al. Determination of Follicular Localization in Human Ovarian Cortex for Vitrification. Journal of Adolescent and Young Adult Oncology. 7 (1), 46-53 (2018).
  22. Baird, D. T., Webb, R., Campbell, B. K., Harkness, L. M., Gosden, R. G. Long-term ovarian function in sheep after ovariectomy and transplantation of autografts stored at -196 C. Endocrinology. 140 (1), 462-471 (1999).
  23. Qin, Y., Jiao, X., Simpson, J. L., Chen, Z. J. Genetics of primary ovarian insufficiency: new developments and opportunities. Human Reproduction Update. 21 (6), 787-808 (2015).
  24. Domniz, N., Meirow, D. Premature ovarian insufficiency and autoimmune diseases. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 60, 42-55 (2019).
  25. Laven, J. S. Primary Ovarian Insufficiency. Seminars in Reproductive Medicine. 34 (4), 230-234 (2016).
  26. Grynberg, M., et al. Fertility preservation in Turner syndrome. Fertility and Sterility. 105 (1), 13-19 (2016).
  27. Tomao, F., Spinelli, G. P., Panici, P. B., Frati, L., Tomao, S. Ovarian function, reproduction and strategies for fertility preservation after breast cancer. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 76 (1), 1-12 (2010).
  28. Kim, S., Lee, Y., Lee, S., Kim, T. Ovarian tissue cryopreservation and transplantation in patients with cancer. Obstetrics & Gynecology Science. 61 (4), 431-442 (2018).
  29. Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue freezing: current status. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 27 (3), 222-230 (2015).
  30. Wu, R. C., Kuo, P. L., Lin, S. J., Liu, C. H., Tzeng, C. C. X chromosome mosaicism in patients with recurrent abortion or premature ovarian failure. Journal of the Formosan Medical Association. 92 (11), 953-956 (1993).
  31. De Munck, N., Vajta, G. Safety and efficiency of oocyte vitrification. Cryobiology. 78, 119-127 (2017).
  32. Argyle, C. E., Harper, J. C., Davies, M. C. Oocyte cryopreservation: where are we now. Human Reproduction Update. 22 (4), 440-449 (2016).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 169la s z IVAdo urganl k korumafolik l b y mesiHippo sinyalik s rl kIn vitro aktivasyonyumurtal k disfonksiyonu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır