Fruchtbarkeitserhaltung bei Patientinnen mit schwerer Ovarialfunktionsstörung

Zusammenfassung

Wir präsentieren Details zu Laborverfahren zur medikamentenfreien In-vitro-Aktivierung (IVA) von Eierstockfollikeln für Patientinnen mit schwerer Ovarialfunktionsstörung. Diese Methode könnte die Anzahl der abrufbaren Eizellen pro ovarieller Hyperstimulation erhöhen und die Erhaltung der Fruchtbarkeit für diese Patientinnen verbessern.

Zusammenfassung

Die Ovarialfunktion nimmt während des Alterns und bei einigen pathophysiologischen Zuständen, einschließlich Karyotypanomalien, Autoimmunerkrankungen, Chemo- und Strahlentherapien sowie Eierstockoperationen, allmählich ab. Bei unverheirateten Frauen mit schwerer Ovarialfunktionsstörung ist die Erhaltung der Fruchtbarkeit wichtig für zukünftige Schwangerschaften. Obwohl die Kryokonservierung von Eizellen eine etablierte Methode zur Erhaltung der Fruchtbarkeit ist, konnten diese Patientinnen auch nach einer Überstimulation der Eierstöcke nur eine begrenzte Anzahl von Eizellen konservieren, was zu wiederholten Stimulationen führte, um genügend Eizellen zu gewährleisten, um eine zukünftige Schwangerschaft zu gewährleisten. Um dieses Problem zu lösen, haben wir kürzlich ein medikamentenfreies In-vitro-Aktivierungsverfahren (IVA) entwickelt, mit dem wir frühe Stadien der Eierstockfollikel stimulieren können, um sich bis zum präantralen Follikelstadium zu entwickeln. Diese präantralen Follikel können auf das einzigartige Protokoll der Gonadotropinstimulation reagieren, was zu einer erhöhten Anzahl von entnommenen Eizellen pro ovarieller Stimulation für die Kryokonservierung führt. Die medikamentenfreie IVA bestand aus dem chirurgischen Ansatz und der Stimulation der Eierstöcke. Wir entfernten einen Teil des Kortex aus einem oder beiden Eierstöcken von Patientinnen unter laparoskopischer Operation. Das kortikale Gewebe der Eierstöcke wurde in kleine Würfel geschnitten, um den Hippo-Signalweg zu stören und die Entwicklung von Follikeln im Frühstadium zu stimulieren. Diese Würfel wurden orthotrop in die verbleibenden Eierstöcke sowie unter die Serosa beider Eileiter gepfropft. Wir haben bereits den chirurgischen Eingriff der medikamentenfreien IVA und das Protokoll der anschließenden Ovarialstimulation veröffentlicht, aber hier stellen wir die Details der Labormethoden vor, die für eine medikamentenfreie IVA erforderlich sind.

Einleitung

Die Eierstockfunktion nimmt während des Alterns und einiger pathophysiologischer Zustände, einschließlich Karyotyp-Anomalien, Autoimmunerkrankungen, Chemo- und Strahlentherapien und Eierstockoperationen, allmählich ab. Die Erhaltung der Fruchtbarkeit ist eine der besten Optionen für unverheiratete Frauen mit schwerer Ovarialfunktionsstörung, um ihr Potenzial für eine zukünftige Schwangerschaft zu erhalten. Zur Erhaltung der Fruchtbarkeit stehen derzeit zwei Methoden zur Verfügung, hauptsächlich im Bereich der Onkofruchtbarkeit. Die Kryokonservierung von Eizellen ist ein etabliertes Verfahren zur Erhaltung der Fruchtbarkeit und viele erfolgreiche Fälle wurden berichtet^1,2. Auf der anderen Seite wurde die Kryokonservierung von Eierstockgewebe auch zur Erhaltung der Fruchtbarkeit bei Krebspatienten etabliert, aber es ist immer noch eine experimentelle Strategie^3,4. Bei beiden Methoden sind mehrere reife Eizellen erforderlich, damit eine Schwangerschaft stattfinden kann. Im Allgemeinen zeigten Patientinnen mit vorzeitiger Ovarialinsuffizienz (POI), die vor dem 40. Lebensjahr zu Amenorrhoe werden, und Frauen mittleren Alters mit niedriger Ovarialreserve eine schlechte ovarielle Reaktion (POR) auf die Stimulation der Eierstöcke zur Ermöglichen reifer Eizellen^5,6,7. Darüber hinaus zeigten junge Patientinnen mit einer geringen Anzahl von Antralfollikeln auch POR zur Stimulation der Eierstöcke⁷. Diese Patientinnen haben selbst nach richtiger Überstimulation der Eierstöcke eine sehr begrenzte Anzahl von abrufbaren Eizellen, so dass mehrere teure Verfahren erforderlich sind, um eine ausreichende Anzahl von Eizellen für die Schwangerschaft zu gewährleisten.

Die Eizellspende gefolgt von einer In-vitro-Fertilisation (IVF) mit dem Sperma des Ehemannes und dem Embryotransfer (ET) ist die einzige Option für diese POI- und POR-Patienten, die Schwierigkeiten haben, ihre eigenen Eizellen zu erhalten^8,9,10. Die Eizellspende wird jedoch durch ethische Fragen sowie Autoimmun- und Schwangerschaftskomplikationen erschwert^11,12,13,14. Um diese Probleme zu lösen, ist die Etablierung einer Unfruchtbarkeitsbehandlung mit eigenen Eizellen der Patientin erwünscht. Für POI-Patientinnen haben wir den In-vitro-Aktivierungsansatz (IVA) entwickelt, um ein erfolgreiches Follikelwachstum und die Erzeugung reifer Eizellen zu ermöglichen, was zu einer Reihe von Schwangerschaften und Entbindungen^{führt 15}. In IVA fragmentierten wir Eierstockkortexen nach Entfernung der Eierstöcke unter laparoskopischer Operation und kultivierten sie für zwei Tage, um Follikel durch Akt-stimulierende Medikamente zu aktivieren und dann heterotope Transplantationen zurück in künstliche Beutel durchzuführen, die unter der Serosa der Eileiter unter der zweiten laparoskopischen Operation hergestellt wurden¹⁵. Dieses Verfahren förderte das Wachstum von primordialen, primären und sekundären Follikeln nach der Fragmentierung des Eierstockkortex, um die Hippo-Signalstörung zu fördern^16,gefolgt von einer zweitägigen Kultur mit Akt-Signalstimulatoren¹⁷.

Im Gegensatz zu schweren POI-Fällen haben POR-Patientinnen mit verminderter Ovarialreserve mehrere sekundäre Follikel. Da die Hippo-Signalstörung allein wirksam ist, um das sekundäre Follikelwachstum zu fördern¹⁶, haben wir kürzlich erfolgreiche Schwangerschaften und Entbindungen für POR-Patienten gezeigt, die das medikamentenfreie IVA-Verfahren mit kortikaler Fragmentierung und orthotopischer Transplantation ohne Behandlung der Akt-stimulierenden Medikamente verwenden. Die medikamentenfreie IVA stimuliert das Frühstadium der Eierstockfollikel, um sich nach nur einer Operation in das präantrale Follikelstadium zu entwickeln, und erhöht die Anzahl der entnommenen Eizellen für den IVF-Embryotransfer^15,18. Der medikamentenfreie IVA-Ansatz hat mehrere Vorteile im Vergleich zu unserer ursprünglichen IVA, indem 1) potenzieller Follikelverlust während der Kultur vermieden wird, 2) die Invasivität und die Kosten der zweiten Operation minimiert werden, 3) nur kurzfristige Bettruhe nach der Operation und 4) das Potenzial einer spontanen Schwangerschaft aufgrund orthotopischer Transplantationen besteht. Wir haben kürzlich einen Videoartikel veröffentlicht, der die chirurgischen Verfahren der medikamentenfreien IVA¹⁹ und detaillierte Protokolle der Ovarialstimulation nach der Operation^{zeigt 20}. Hier stellen wir Ihnen Details zu den Labormethoden vor, die für eine medikamentenfreie IVA erforderlich sind.

Protokoll

Von jeder POR-Patientin mit abnehmender ovarieller Reserve, die sich für die medikamentenfreie IVA-Behandlung einschrieb, wurde eine schriftliche Einwilligung nach Aufklärung eingeholt. Diese Studie wurde vom Ethikkomitee der International University of Health and Welfare (Nr. 17-S-21) genehmigt. Die klinische Studie wurde unter der Nummer UMIN000034464 registriert und in Übereinstimmung mit dem Ethikkodex des Weltärztebundes (Deklaration von Helsinki) durchgeführt.

1. Extraktion des Ovarialkortex

1. Entfernen Sie einen Teil des Eierstockkortex (10 x 10 mm, 2-3 mm Dicke) aus einem oder beiden Eierstöcken unter Vollnarkose durch laparoskopische Chirurgie wie zuvor beschrieben^19,20.
2. Legen Sie die gesammelten Ovarialkortex in einen sterilen Behälter mit 10 ml modifiziertem HTF (mHTF) bei 37 °C.

2. Fragmentierung des Ovarialkortex

HINWEIS: Vor der Dissektion des Ovarialkortex mHTF auf 37 °C aufwärmen. Halten Sie während des gesamten Verfahrens sterile Bedingungen aufrecht. Alle Werkzeuge für dieses Verfahren sind in der Materialtabelleaufgeführt.

1. Legen Sie die gesammelten Ovarialkortex in eine Kunststoffschale mit 5-10 ml mHTF bei 37 °C und legen Sie sie auf die Wärmeplatte, um das Gewebe bei 37 °C zu halten (Abbildung 2A).
2. Machen Sie ein Bild von jedem Kortex mit einer Digitalkamera mit dem Namen des Patienten, bevor Sie mit dem nächsten Verfahren beginnen, um die Hintergrunddaten des Patienten zu verknüpfen.
3. Legen Sie einen individuellen Kortex auf eine sterile Gaze, die mit mHTF befeuchtet ist (Abbildung 2B).
   HINWEIS: Tragen Sie zusätzliche mHTF mit einer Einwegpipette auf die Gaze auf, um zu verhindern, dass die Oberfläche des Kortex während dieses Verfahrens ausgetrocknet wird.
4. Entfernen Sie restes Medulla-Gewebe, das rosa aussieht, mit einer Mikroschere, so dass die Dicke des Gewebes 1-2 mm erreicht(Abbildung 2C und D).
   HINWEIS: Um den Verlust von Follikeln im Frühstadium zu vermeiden, bereiten Sie die kortikalen Streifen mit einer Dicke von weniger als 1 mm nicht vor, da sich die Follikel im Frühstadium innerhalb von 1-2 mm von der Oberfläche des Eierstockkortex²¹befinden.
5. Sezieren Sie ein 1 mm x 1 mm x 5 mm Gewebestück aus jedem kortikalen Eierstockstreifen mit einem feinen Skalpell und lästen Sie es einer histologischen Analyse, um das Vorhandensein von Restfollikeln wie zuvor beschrieben zu bestimmen¹⁸ (Abbildung 2E).
   HINWEIS: Die sezierten Gewebe für die Histologie werden in mHTF eingetaucht und bis zur Fixierung bei 4 °C gelagert(Abbildung 2F,siehe Schritt 4).
6. Schneiden Sie den Kortex mit einem feinen Skalpell in 1 mm x 1 mm x 10 mm große Streifen (Abbildung 2G).
   HINWEIS: Es ist einfacher, durch Drücken auf das Skalpell zu schneiden als durch Ziehen daran.
7. Schneiden Sie diese Gewebestreifen in 1 mm x 1 mm x 1 mm kleine Würfel (Abbildung 2H).
   HINWEIS: Um Veränderungen des osmotischen Drucks im Medium zu vermeiden, fügen Sie mHTF in Maßen vor der Gewebeautotransplantation hinzu.

3. Automatische Transplantation von kortikalen Ovarialfragmenten

1. Öffnen Sie die Packung der IVA-Kanüle und legen Sie sie auf einen sterilen Vorhang.
2. Spülen Sie das Innere der IVA-Kanüle mit mHTF aus, indem Sie mHTF mehrmals absaugen und entladen.
3. Saugen Sie 100-200 μL mHTF an, um die Spitze der IVA-Kanüle zu füllen, um zu verhindern, dass die kortikalen Würfel während des Ladens austrocknen (Abbildung 3A).
4. Laden Sie die kortikalen Würfel mit einer feinen Pinzette in die Spitze der IVA-Kanüle (Abbildung 3B-E).
   HINWEIS: Die Anzahl der kortikalen Würfel zum Laden hängt von der Transplantationsstelle ab. Im Allgemeinen können 20-30 Würfel in einen orthotropen verbleibenden Eierstock transplantiert werden, während 10-15 Würfel in einen Beutel unter der Serosa des Eileiters transplantiert werden können.
5. Nachdem Sie die kortikalen Würfel geladen haben, halten Sie die Spitze der Kanüle, die die kortikalen Würfel enthält, an den Fingern, bis Die IVA-Kanüle an einen Chirurgen übertragen wird. Dadurch wird vermieden, dass die Würfeltemperatur sinkt.
   HINWEIS: Die Details des Autografting-Verfahrens unter laparoskopischer Chirurgie wurden zuvor^{berichtet 19}. Für die Transplantation von kortikalen Eierstockwürfeln wurde von unserem Mitarbeiter, der Kitazato Corporation, ein kanülenförmiges Gerät (IVA-Kanüle) entwickelt.

4. Histologische Analyse des Ovarialkortex

HINWEIS: Um die Anzahl der Restfollikel zu zählen, führen Sie eine histologische Analyse wie zuvor beschrieben^{durch 15}.

1. Markieren Sie die kortikale Streifenoberfläche vor der Probenfixierung mit einem Gewebemarkierungsfarbstoff. Dies zeigt die Seite des Kortex im Streifen für die Histologie an.
2. Fixieren Sie die Gewebestreifen über Nacht bei 4 °C mit Bouins Lösung.
   HINWEIS: Um Atretenfollikel nachzuweisen, empfehlen wir nicht, Paraformaldehyd zur Fixierung zu verwenden, um eine Schrumpfung des Zytoplasmas der Eizellen zu vermeiden.
3. Dehydrieren und die Gewebestreifen in Paraffin einbetten.
4. Teilen Sie den Paraffinblock, der die Gewebeprobe enthält, seriell auf.
5. Färben Sie jeden Abschnitt mit Hämatoxylin und Eosin, um die Follikel zu visualisieren.
6. Zählen Sie die Follikel wie zuvor beschrieben¹⁷.

Ergebnisse

In der ersten Veröffentlichung des IVA-Ansatzes¹⁵haben wir die kortikalen Eierstockwürfel nacheinander in die Transplantatstellen der laparoskopischen Chirurgie transplantiert (Abbildung 1A). Da 100-150 Eierstockwürfel verwendet wurden, dauerte es 3-4 Stunden für die Gewebetransplantation unter laparoskopischer Operation. Auch einige Eierstockwürfel gingen vor dem Pfropfen verloren. Da die IVA-Kanüle 20-30 Würfel gleichzeitig an eine Transplantatstelle übertra...

Diskussion

In diesem Manuskript haben wir ein detailliertes Laborprotokoll für drogenfreie IVA gezeigt. Die medikamentenfreie IVA ist ein neuer Ansatz der Unfruchtbarkeitsbehandlung für POR-Patientinnen mit abnehmender Ovarialreserve, um das Wachstum der sekundären Follikel zu fördern, was zu reiferen Eizellen nach der Stimulation der Eierstöcke führt und bei erfolgreicher Schwangerschaft^{zunimmt 20}. Bei 15 POR-Patientinnen mit abnehmender Ovarialreserve erreichte dieser Ansatz eine spontane Schwangersc...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4.5 onz specimen container	FALCON	354013	Other products may also be suitable
60mm dish	FALCON	351007	Other products may also be suitable
50 x 50 cm sterile drape	HOGY Medical	SR-823	Any type of sterile produsts may also be suitable
Disposable pippete	FALCON	357575	Other products may also be suitable
Fine scissors, Curved	WPI	#14224-G	Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products
Hot plate	TOKAI HIT	TPiE-SP	Use at operation room to maintain the temperature of dishes containing ovarian tissue before transplantation
Human Serum Albumin Solution	Irvine Scientific	9988	Medium for handling ovarian tissue
IVA cannule	KITAZATO	446030 IVA-6030E	Specific cannula for tissue autografting
KAI medical Disposable scalpel	WPI	#5 10-A	Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products
Micro scissors, Curved	WPI	#503364	Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products
Modified HTF Medium-HEPES	Irvine Scientific	90126	Medium for handling ovarian tissue
Sterile gauze	Osaki Medical	15004	Any type of sterile produsts may also be suitable
Swiss Tweezers, Curved Tips	KAI	#504505	Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products