שימור פוריות בחולים עם תפקוד לקוי של השחלות חמורות

Summary

אנו מציגים פרטים של נהלי מעבדה להפעלה במבחנה ללא סמים (IVA) של זקיקי השחלות לחולים עם תפקוד לקוי של השחלות חמורות. שיטה זו יכולה להגדיל את מספר ביציות לאחזור לכל hyperstimulation השחלות לטובת שימור פוריות עבור חולים אלה.

Abstract

תפקוד השחלות יורד בהדרגה במהלך ההזדקנות ובתנאים פתופיזיולוגיים מסוימים כולל חריגות קריוטיפיות, מחלות אוטואימוניות, טיפולי כימותרפיה והקרנות, כמו גם ניתוחי שחלות. אצל נשים לא נשואות עם תפקוד לקוי של השחלות חמורות, שימור פוריות חשוב עבור הריונות עתידיים. למרות ההקפאה ביצית היא שיטה הוקמה לשימור פוריות, חולים אלה יכולים רק לשמר מספר מוגבל של ביציות גם לאחר גירוי יתר השחלות, המוביל גירויים חוזרים ונשנים כדי להבטיח מספיק ביציות כדי להבטיח הריון בעתיד. כדי לפתור בעיה זו, פיתחנו לאחרונה הליך הפעלה במבחנה ללא סמים (IVA), המאפשרים לנו לעורר שלבים מוקדמים של זקיקי השחלות להתפתח לשלב הזקיק preantral. זקיקים טרום-אנליטיים אלה יכולים להגיב לפרוטוקול הייחודי של גירוי גונדוטרופין, וכתוצאה מכך מספר מוגבר של ביציות מאוחזרות לכל גירוי השחלות עבור cryopreservation. IVA ללא סמים מורכב הגישה הכירורגית וגירוי השחלות. הסרנו חלק מקליפת המוח מהשחלה אחת או משתיהן מחולים שעברו ניתוח לפרוסקופי. רקמות קליפת המוח השחלות נחתכו לקוביות קטנות כדי לשבש את מסלול איתות היפו ולעורר את התפתחות זקיקים בשלב מוקדם. קוביות אלה הושתלו אורתוטרופית לתוך השחלות הנותרות, כמו גם מתחת לסרוסה של שתי החצוצרות. כבר פרסמנו את ההליך הכירורגי של IVA ללא סמים ואת הפרוטוקול של גירוי השחלות הבאים, אבל בזאת אנו מציגים את הפרטים של שיטות מעבדה הנדרשות עבור IVA ללא סמים.

Introduction

תפקוד השחלות יורד בהדרגה במהלך ההזדקנות וכמה מצבים פתופיזיולוגיים כולל חריגות קריוטיפיות, מחלות אוטואימוניות, טיפולי כימותרפיה והקרנות וניתוחי שחלות. שימור פוריות היא אחת האפשרויות הטובות ביותר עבור נשים לא נשואות עם תפקוד לקוי של השחלות חמורות כדי לשמר את הפוטנציאל שלהם להריון בעתיד. לשימור פוריות, כיום שתי שיטות זמינות בעיקר בתחום אונקו-פוריות. Oocyte cryopreservation הוא הליך מבוסס היטב לשימור פוריות ומקרים מוצלחים רבים דווחו^1,2. מצד שני, cryopreservation רקמת השחלות הוקמה גם לשימור פוריות בחולי סרטן אבל זה עדיין אסטרטגיה ניסיונית^3,4. בשתי השיטות, מספר רב של ביציות בוגרות נדרשים כדי שההריון יתרחש. בדרך כלל, חולים עם אי ספיקת שחלות מוקדמת (POI), אשר הופכים אמנוריאה לפני גיל 40, ונשים בגיל העמידה עם רזרבה השחלות נמוכה הראו תגובה השחלות עניים (POR) כדי גירוי השחלות להניב ביציות בוגרות^5,6,7. יתר על כן, חולים צעירים עם מספר נמוך של זקיקים antral הראו גם POR לגירוי השחלות⁷. חולים אלה יש מספר מוגבל מאוד של ביציות לאחזור גם לאחר hyperstimulation השחלות הנכון, ובכך דורש הליכים יקרים מרובים כדי להבטיח מספר מספיק של ביציות להריון.

תרומת ביצית ואחריה הפריה חוץ גופית (הפריה חוץ גופית) עם הזרע של הבעל והעברת עוברים (ET) היא האפשרות היחידה עבור חולי POI ו- POR אלה המתקשים להשיג ביציות משלהם^8,9,10. עם זאת, תרומת ביצית מסובכת על ידי בעיות אתיות, כמו גם סיבוכים אוטואימוניים והריון^11,12,13,14. כדי לפתור בעיות אלה, הקמת טיפול פוריות באמצעות ביציות של המטופלים עצמו רצוי. עבור חולי POI, פיתחנו את הגישה להפעלה במבחנה (IVA) כדי לאפשר צמיחה מוצלחת של זקיקים ויצירת ביציות בוגרות, המוביל מספר הריונות ומשלוחים¹⁵. ב- IVA, פיצלנו את קליפות השחלות לאחר הסרת השחלות בניתוח לפרוסקופי ותרביתנו אותן במשך יומיים כדי להפעיל זקיקים על ידי תרופות מגרה אקט ולאחר מכן לבצע השתלה הטרוטופית בחזרה לתוך שקיות מלאכותיות שנעשו מתחת לסרוסה של חצוצרות תחת ניתוח לפרוסקופי שני¹⁵. הליך זה קידם צמיחה של זקיקים ראשוניים, ראשוניים ומשניים לאחר פיצול קליפת המוח השחלתית כדי לקדם את שיבוש איתות היפו¹⁶, ואחריו יומיים תרבות עם Akt איתות גירויים¹⁷.

בניגוד למקרי POI חמורים, חולי POR עם ירידה בשחלות מילואים יש זקיקים משניים מרובים. מכיוון שהפרעה באיתות היפו לבדה יעילה בקידום צמיחת זקיק^{משנית 16}, הדגמנו לאחרונה הריונות ומשלוחים מוצלחים לחולי POR באמצעות הליך IVA ללא סמים הכולל פיצול קליפת המוח והשתלה אורתוטופית ללא טיפול בתרופות מגרה Akt. IVA ללא סמים מגרה שלב מוקדם של זקיקי השחלות להתפתח לשלב הזקיק preantral לאחר ניתוח אחד בלבד והגדיל את מספר הביציות שאוחזרו עבור העברת הפריה חוץ גופית-עובר^15,18. הגישה IVA ללא סמים יש מספר יתרונות לעומת IVA המקורי שלנו על ידי 1) הימנעות אובדן זקיק פוטנציאלי במהלך התרבות, 2) מזעור פולשנות ועלויות של הניתוח השני, 3) מעורבים רק לטווח קצר לאחר הניתוח מנוחה במיטה ו 4) פוטנציאל של הריון ספונטני עקב השתלה אורתוטופית. לאחרונה פרסמנו מאמר וידאו המציג את ההליכים הכירורגיים של IVA ללא סמים¹⁹ ופרוטוקולים מפורטים של גירוי השחלות לאחר הניתוח²⁰. כאן, אנו מציגים פרטים של שיטות מעבדה הנדרשות עבור IVA ללא סמים.

Protocol

הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל חולה POR עם רזרבת שחלות פוחתת שנרשם לטיפול IVA ללא סמים. מחקר זה אושר על ידי הוועדה האתית של האוניברסיטה הבינלאומית לבריאות ורווחה (מס ' 17-S-21). הניסוי הקליני נרשם תחת מספר UMIN000034464 ובוצע בהתאם לקוד האתיקה של ההסתדרות הרפואית העולמית (הצהרת הלסינקי).

1. מיצוי קליפת המוח השחלתית

1. הסר חלק מקליפת המוח השחלתית (10 x 10 מ"מ, עובי 2-3 מ"מ) מהשחלה אחת או משתיהן בהרדמה כללית באמצעות ניתוח לפרוסקופי כפי שתואר קודם^19,20.
2. מניחים את קליפות השחלות שנאספו במיכל סטרילי המכיל 10 מ"ל של HTF שונה (mHTF) ב 37 מעלות צלזיוס.

2. פיצול קליפת המוח השחלות

הערה: לפני הניתוח של קליפת השחלות, לחמם mHTF כדי 37 °C (69 °F). לשמור על תנאים סטריליים לאורך כל ההליך. כל הכלים עבור הליך זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. מניחים את קליפות השחלות שנאספו בצלחת פלסטיק המכילה 5-10 מ"ל של mHTF ב 37 מעלות צלזיוס ומניחים אותם על צלחת החום כדי לשמור על הרקמה ב 37 °C(איור 2A).
2. צלם תמונה של כל קליפת המוח באמצעות מצלמה דיגיטלית עם שם המטופל לפני שתתחיל בהליך הבא כדי לקשר בין נתוני הרקע של המטופל.
3. הניחו קליפת המוח הבודדת על גזה סטרילית לחה עם mHTF (איור 2B).
   הערה: החל mHTF נוסף עם פיפטה חד פעמית על הגזה כדי למנוע את פני השטח של קליפת המוח להיות מיובש במהלך הליך זה.
4. הסר רקמת מדולה שיורית שבה נראה ורוד באמצעות מיקרו-מספריים כך שעובי הרקמה יגיע ל-1.2 מ"מ(איור 2C ו-D).
   הערה: כדי למנוע אובדן זקיקים בשלב מוקדם, לא להכין את רצועות קליפת המוח פחות מ 1 מ"מ עובי, כי זקיקים בשלב מוקדם ממוקמים בתוך 1-2 מ"מ מפני השטח של קליפת המוח השחלות²¹.
5. לנתח 1 מ"מ x 1 מ"מ x 5 מ"מ של חתיכת רקמה מכל רצועת קליפת המוח השחלתית באמצעות אזמל דק ולהכפיף אותו לניתוח היסטולוגי כדי לקבוע את נוכחותם של זקיקים שיורית כפי שתואר קודם¹⁸ (איור 2E).
   הערה: הרקמות המנותחות להיסטולוגיה שקועות ב-mHTF ושומרות על 4 מעלות צלזיוס עד לתיקון(איור 2F,ראו שלב 4).
6. חותכים את קליפת המוח לרצועות 1 מ"מ x 1 מ"מ x 10 מ"מ באמצעות אזמל דק(איור 2G).
   הערה: קל יותר לחתוך על ידי לחיצה על האזמל מאשר על ידי משיכתו.
7. חותכים רצועות רקמות אלה לקוביות קטנות של 1 מ"מ x 1 מ"מ x 1 מ"מ (איור 2H).
   הערה: כדי למנוע שינויים של לחץ אוסמוטי במדיום, להוסיף mHTF במתינות לפני autografting רקמה.

3. השתלה אוטומטית של שברי קליפת המוח השחלות

1. פתח את החבילה של הצינורית IVA ולשים אותו על וילון סטרילי.
2. יש לשטוף בתוך הצינורית IVA עם mHTF על ידי שאיפה ופריצה של mHTF מספר פעמים.
3. שאפו 100-200 μL של mHTF כדי למלא את קצה הצינורית של IVA כדי למנוע מהקוביות הקורטיקליות להתייבש במהלך הטעינה (איור 3A).
4. טען את קוביות קליפת המוח לקצה הצינורית של IVA באמצעות פינצטהעדינה (איור 3B-E).
   הערה: מספר הקוביות הקורטיקליות לטעינה תלוי באתר ההשתלה. בדרך כלל, 20-30 קוביות ניתן להשתיל לתוך השחלה הנותרת אורתוטרופית, ואילו 10-15 קוביות ניתן להשתיל לתוך שקית מתחת לסרוסה של החצוצרה.
5. לאחר טעינת קוביות קליפת המוח, להחזיק את קצה הצינורית המכילה את קוביות קליפת המוח על ידי האצבעות עד העברת הצינורית IVA למנתח. זה ימנע את טמפרטורת הקוביה כדי ירידות.
   הערה: הפרטים של הליך autografting תחת ניתוח לפרוסקופי דווחו בעבר¹⁹. עבור השתלת קוביות קליפת המוח השחלות, מכשיר בצורת קנולה (קנולה IVA) פותחה על ידי המשתף פעולה שלנו, תאגיד Kitazato.

4. ניתוח היסטולוגי של קליפת המוח השחלות

הערה: כדי לספור את מספר זקיקים שיורית, לבצע ניתוח היסטולוגי כמו שתואר קודם¹⁵.

1. סמן את משטח הרצועה הקליפתית עם צבע סימון רקמה לפני קיבוע מדגם. זה יציין את הצד של קליפת המוח ברצועה להיסטולוגיה.
2. לתקן את רצועות הרקמה לילה ב 4 מעלות צלזיוס באמצעות הפתרון של Bouin.
   הערה: כדי לזהות זקיקים אטרטיים, אנחנו לא ממליצים להשתמש paraformaldehyde לתיקון כדי למנוע התכווצות של ציטופלסמה ביצית.
3. להתייבש ולהטמיע את רצועות הרקמה בפרפין.
4. באופן סדרתי קטע בלוק פרפין המכיל את דגימת הרקמה.
5. כתם כל קטע באמצעות המטוקסילין ואאוסין כדי לדמיין את הזקיקים.
6. לספור את הזקיקים כפי שתואר קודם^{לכן 17}.

תוצאות

בפרסום הראשון של גישה^{IVA 15}, השתלנו את קוביות קליפת המוח השחלות בזה אחר זה לתוך אתרי השתלה תחת ניתוח לפרוסקופי (איור 1A). בגלל 100-150 קוביות השחלות שימשו, זה לקח 3-4 שעות להשתיל רקמה תחת ניתוח לפרוסקופי. כמו כן, כמה קוביות השחלות אבדו לפני השתלה. מכיוון שהקנולה של IVA יכול...

Discussion

בכתב יד זה, הראינו פרוטוקול מעבדה מפורט עבור IVA ללא סמים. IVA ללא סמים היא גישה חדשה של טיפול פוריות עבור חולה POR עם ירידה בשחלות מילואים כדי לקדם צמיחה זקיקים משניים, וכתוצאה מכך מניב ביציות בוגרות יותר לאחר גירוי השחלות וגדל בהריון מוצלח²⁰. ב 15 חולי POR עם רזרבת השחלות פוחתת, גישה ז...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4.5 onz specimen container	FALCON	354013	Other products may also be suitable
60mm dish	FALCON	351007	Other products may also be suitable
50 x 50 cm sterile drape	HOGY Medical	SR-823	Any type of sterile produsts may also be suitable
Disposable pippete	FALCON	357575	Other products may also be suitable
Fine scissors, Curved	WPI	#14224-G	Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products
Hot plate	TOKAI HIT	TPiE-SP	Use at operation room to maintain the temperature of dishes containing ovarian tissue before transplantation
Human Serum Albumin Solution	Irvine Scientific	9988	Medium for handling ovarian tissue
IVA cannule	KITAZATO	446030 IVA-6030E	Specific cannula for tissue autografting
KAI medical Disposable scalpel	WPI	#5 10-A	Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products
Micro scissors, Curved	WPI	#503364	Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products
Modified HTF Medium-HEPES	Irvine Scientific	90126	Medium for handling ovarian tissue
Sterile gauze	Osaki Medical	15004	Any type of sterile produsts may also be suitable
Swiss Tweezers, Curved Tips	KAI	#504505	Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products