Сохранение фертильности у пациенток с тяжелой дисфункцией яичников

Резюме

Представлены подробные сведения о лабораторных процедурах безмедикаментозной активации in vitro (IVA) фолликулов яичников у пациенток с тяжелой дисфункцией яичников. Этот метод может увеличить количество извлекаемых ооцитов на гиперстимуляцию яичников и принести пользу сохранению фертильности для этих пациентов.

Аннотация

Функция яичников постепенно снижается во время старения и в некоторых патофизиологических условиях, включая аномалии кариотипа, аутоиммунные заболевания, химио- и лучевую терапию, а также операции на яичниках. У незамужних женщин с тяжелой дисфункцией яичников сохранение фертильности важно для будущих беременностей. Хотя криоконсервация ооцитов является признанным методом сохранения фертильности, эти пациенты могут сохранять только ограниченное количество ооцитов даже после гиперстимуляции яичников, что приводит к повторным стимуляциям для обеспечения достаточного количества ооцитов, чтобы гарантировать будущую беременность. Чтобы решить эту проблему, мы недавно разработали процедуру безлекарстванной активации in vitro (IVA), которая позволяет нам стимулировать ранние стадии фолликулов яичников развиваться до стадии преантрального фолликула. Эти преантральные фолликулы могут реагировать на уникальный протокол стимуляции гонадотропином, что приводит к увеличению количества извлеченных ооцитов на стимуляцию яичников для криоконсервации. Безмедикаментозная ИВА состоит из хирургического подхода и стимуляции яичников. Мы удалили часть коры из одного или обоих яичников у пациенток с помощью лапароскопической хирургии. Кортикальные ткани яичников были разрезаны на небольшие кубики, чтобы нарушить сигнальный путь гиппопотама и стимулировать развитие фолликулов на ранней стадии. Эти кубики были привиты ортотропически в оставшиеся яичники, а также под серозу обеих фаллопиевых труб. Мы уже публиковали хирургическую процедуру безмедикаментозной ИВА и протокол последующей стимуляции яичников, но здесь мы представляем подробности лабораторных методов, необходимых для безмедикаментозной ИВА.

Введение

Функция яичников постепенно снижается во время старения и некоторых патофизиологических состояний, включая аномалии кариотипа, аутоиммунные заболевания, химио- и лучевую терапию и операции на яичниках. Сохранение фертильности является одним из лучших вариантов для незамужних женщин с тяжелой дисфункцией яичников, чтобы сохранить их потенциал для будущей беременности. Для сохранения плодовитости в настоящее время доступны два метода, в основном в области онко-фертильности. Криоконсервация ооцитов является хорошо отлаженной процедурой сохранения фертильности, и было зарегистрировано много успешных случаев^1,2. С другой стороны, криоконсервация ткани яичников также была установлена для сохранения фертильности у больных раком, но это все еще экспериментальная стратегия^3,4. В обоих методах для наступления беременности необходимо множественное количество зрелых ооцитов. Как правило, пациентки с преждевременной недостаточностью яичников (POI), у которых аменорея в возрасте до 40 лет, и женщины среднего возраста с низким оварианным резервом показали плохую реакцию яичников (POR) на стимуляцию яичников для получения зрелых ооцитов^5,6,7. Кроме того, у молодых пациенток с низким количеством антральных фолликулов также показал POR стимуляции яичников^7. Эти пациентки имеют очень ограниченное количество извлекаемых ооцитов даже после правильной гиперстимуляции яичников, что требует нескольких дорогостоящих процедур для обеспечения достаточного количества ооцитов для беременности.

Донорство ооцитов с последующим экстракорпоральное оплодотворением (ЭКО) спермой мужа и переносом эмбрионов (ET) является единственным вариантом для этих пациентов POI и POR, которые испытывают трудности с получением собственных ооцитов^8,9,10. Однако донорство ооцитов осложняется этическими проблемами, а также аутоиммунными осложнениями и осложнениями беременности^{11, 12,13,14.} Для решения этих вопросов желательно налаживание лечения бесплодия с использованием собственных ооцитов пациентов. Для пациентов с POI мы разработали подход in vitro activation (IVA), чтобы обеспечить успешный рост фолликулов и генерацию зрелых ооцитов, что привело к ряду беременностей и родов^15. В IVA мы фрагментировали кору яичников после удаления яичников под лапароскопической хирургией и культивировали их в течение двух дней, чтобы активировать фолликулы акт-стимулирующими препаратами, а затем выполнили гетеротопическую пересадку обратно в искусственные мешочки, сделанные под серозой фаллопиевых труб при второй лапароскопической операции^15. Эта процедура способствовала росту первичных, первичных и вторичных фолликулов после фрагментации коры яичников, чтобы способствовать нарушению передачи сигналов гиппопотамов^16,с последующей двухдневной культурой с сигнальными стимуляторами Akt^17.

В отличие от тяжелых случаев POI, пациентки POR со сниженным овариалистным резервом имеют множественные вторичные фолликулы. Поскольку нарушение передачи сигналов гиппо гиппоспособникам само по себе эффективно способствует росту вторичного фолликула^16,мы недавно продемонстрировали успешную беременность и родов для пациентов с ПОР, используя процедуру IVA без лекарств, включающую кортикальное фрагментирование и ортотопическую трансплантацию без лечения стимулирующими препаратами Akt. Безлекарстванная ИВА стимулирует раннюю стадию фолликулов яичников к развитию до стадии преантрального фолликула уже после одной операции и увеличивает количество извлеченных ооцитов для ЭКО-переноса эмбрионов^{на 15,18.} Безмедикаментозный подход IVA имеет несколько преимуществ по сравнению с нашим оригинальным IVA: 1) избегая потенциальной потери фолликулов во время посева, 2) сводя к минимуму инвазивность и затраты на вторую операцию, 3) включая только краткосрочный послеоперационный постельный режим и 4) потенциал спонтанной беременности из-за ортотопической пересадки. Недавно мы опубликовали видео-статью, показывающую хирургические процедуры безмедикаментозного IVA¹⁹ и подробные протоколы стимуляции яичников после операции^20. Здесь мы представляем подробную информацию о лабораторных методах, необходимых для безнаркотатической ИВА.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Письменное информированное согласие было получено от каждой пациентки POR с уменьшающимся оварианным резервом, которая была включена в лечение IVA без лекарств. Это исследование было одобрено этическим комитетом Международного университета здравоохранения и социального обеспечения (No 17-S-21). Клиническое исследование было зарегистрировано под номером UMIN000034464 и проводилось в соответствии с Кодексом этики Всемирной медицинской ассоциации (Хельсинкская декларация).

1. Извлечение коры яичников

1. Удалить часть коры яичников (10 х 10 мм, толщина 2-3 мм) из одного или обоих яичников под общим наркозом посредством лапароскопической операции, как описано^{ранее 19,20.}
2. Поместите собранные коры яичников в стерильный контейнер, содержащий 10 мл модифицированного HTF (mHTF) при 37 °C.

2. Фрагментация коры яичников

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед рассечением коры яичников разогрейте mHTF до 37 °C. Поддерживайте стерильные условия на протяжении всей процедуры. Все инструменты для этой процедуры перечислены в Таблице материалов.

1. Поместите собранные коры яичников в пластиковую посуду, содержащую 5-10 мл mHTF при 37 °C и поместите их на тепловую пластину для поддержания ткани при 37 °C(рисунок 2A).
2. Сделайте снимок каждой коры головного мозга с помощью цифровой камеры с именем пациента перед началом следующей процедуры, чтобы связать фоновые данные пациента.
3. Поместите индивидуальную кору головного мозга на стерильную марлю, смоченную mHTF(рисунок 2B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесите дополнительный mHTF с одноразовой пипеткой на марлю, чтобы предотвратить высыханию поверхности коры во время этой процедуры.
4. Удаляют остаточную ткань продолговатого мозга там, где она выглядит розовой, с помощью микро-ножниц, чтобы толщина ткани достигала 1-2 мм(рис. 2С и D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать потери фолликулов на ранней стадии, не подготавливайте кортикальные полоски толщиной менее 1 мм, поскольку фолликулы ранней стадии расположены в пределах 1-2 мм от поверхности коры яичников^21.
5. Рассейте кусок ткани размером 1 мм х 1 мм х 5 мм от каждой кортикальной полоски яичника с помощью тонкого скальпеля и подвергте его гистологическому анализу для определения наличия остаточных фолликулов, как описано^{ранее 18} (рисунок 2E).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рассеченные ткани для гистологии погружают в mHTF и держат при 4 °C до фиксации(рисунок 2F,см. Шаг 4).
6. Разрежьте кору на полоски 1 мм x 1 мм x 10 мм с помощью тонкого скальпеля(рисунок 2G).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Его легче разрезать, надавливая на скальпель, чем натягивая на него.
7. Разрежьте эти полоски ткани на мелкие кубики размером 1 мм x 1 мм(рисунок 2H).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать изменения осмотического давления в среде, добавляйте mHTF в умеренных количествах перед аутотрансплантацией тканей.

3. Аутоплантатирование корковых фрагментов яичников

1. Откройте упаковку канюли IVA и наденьте ее на стерильную драпировку.
2. Промыть внутрь канюли IVA с помощью mHTF путем аспирации и разрядки mHTF несколько раз.
3. Аспират 100-200 мкл mHTF для заполнения кончика канюли IVA, чтобы избежать высыхания кортиковых кубиков во время загрузки(рисунок 3A).
4. Загрузите кортикальные кубики в кончик канюли IVA с помощью тонкого пинцета(рисунок 3B-E).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество кортиковых кубиков для загрузки зависит от места прививки. Как правило, 20-30 кубиков могут быть пересажены в ортотропный оставшийся яичник, тогда как 10-15 кубиков могут быть пересажены в мешочек под серозой фаллопиевой трубы.
5. После загрузки кортикальных кубиков держите кончик канюли, содержащей кортикальные кубики, за пальцы до передачи канюли IVA хирургу. Это позволит избежать снижения температуры куба.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подробности процедуры аутотрансплантата в рамках лапароскопической хирургии были сообщены^{ранее 19}. Для пересадки корковых кубиков яичников нашим сотрудником, корпорацией Kitazato, было разработано устройство в форме канюли (IVA cannula).

4. Гистологический анализ коры яичников

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы подсчитать количество остаточных фолликулов, выполните гистологический анализ, как описано^{ранее 15.}

1. Перед фиксацией образца пометьте поверхность кортикальной полосы красителем для маркировки ткани. Это укажет сторону коры в полосе для гистологии.
2. Зафиксируйте полоски тканей на ночь при 4 °C с помощью раствора Буэна.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для обнаружения атретических фолликулов мы не рекомендуем использовать параформальдегид для фиксации, чтобы избежать усадки цитоплазмы ооцитов.
3. Обезвоживать и встраивать тканевые полоски в парафин.
4. Последовательно разделять парафиновый блок, содержащий образец ткани.
5. Окрашивайте каждый участок, используя гематоксилин и эозин для визуализации фолликулов.
6. Подсчитайте фолликулы, как описано^{ранее 17}.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В первой публикации подхода IVA¹⁵мы пересадили корковые кубики яичников один за другим в места пересадки при лапароскопической хирургии(рисунок 1A). Поскольку было использовано 100-150 кубиков яичников, для пересадки тканей при лапароскопической операции потре?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этой рукописи мы показали подробный лабораторный протокол для IVA без лекарств. Безлекарствующий IVA - это новый подход к лечению бесплодия для пациентки POR с уменьшающимся овариалистным резервом для стимулирования роста вторичных фолликулов, что приводит к образованию более зрелых оо?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4.5 onz specimen container	FALCON	354013	Other products may also be suitable
60mm dish	FALCON	351007	Other products may also be suitable
50 x 50 cm sterile drape	HOGY Medical	SR-823	Any type of sterile produsts may also be suitable
Disposable pippete	FALCON	357575	Other products may also be suitable
Fine scissors, Curved	WPI	#14224-G	Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products
Hot plate	TOKAI HIT	TPiE-SP	Use at operation room to maintain the temperature of dishes containing ovarian tissue before transplantation
Human Serum Albumin Solution	Irvine Scientific	9988	Medium for handling ovarian tissue
IVA cannule	KITAZATO	446030 IVA-6030E	Specific cannula for tissue autografting
KAI medical Disposable scalpel	WPI	#5 10-A	Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products
Micro scissors, Curved	WPI	#503364	Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products
Modified HTF Medium-HEPES	Irvine Scientific	90126	Medium for handling ovarian tissue
Sterile gauze	Osaki Medical	15004	Any type of sterile produsts may also be suitable
Swiss Tweezers, Curved Tips	KAI	#504505	Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products