Preservação da fertilidade em pacientes com disfunção ovariana grave

Resumo

Apresentamos detalhes de procedimentos laboratoriais para ativação in vitro livre de drogas (IVA) de folículos ovarianos para pacientes com disfunção ovariana grave. Este método poderia aumentar o número de oócitos recuperáveis por hiperestimulação ovariana e beneficiar a preservação da fertilidade para esses pacientes.

Resumo

A função ovariana diminui progressivamente durante o envelhecimento e em algumas condições fisioterológicas, incluindo anormalidade do karyótipo, doenças autoimunes, quimioterapia e radioterapia, bem como cirurgias ovarianas. Em mulheres solteiras com disfunção ovariana grave, a preservação da fertilidade é importante para futuras gestações. Embora a criopreservação de oócito seja um método estabelecido para a preservação da fertilidade, esses pacientes só poderiam preservar um número limitado de oócitos mesmo após a hiperestimulação ovariana, levando a estimulações repetidas para garantir oócitos suficientes para garantir a gravidez futura. Para resolver esse problema, desenvolvemos recentemente um procedimento de ativação in vitro (IVA) livre de drogas, que nos permite estimular estágios iniciais de folículos ovarianos a se desenvolverem até a fase do folículo pré-natural. Estes folículos pré-orais podem responder ao protocolo único de estimulação da gonadotropina, resultando em um aumento do número de oócitos recuperados por estimulação ovariana para criopreservação. O IVA livre de drogas compreendeu-se da abordagem cirúrgica e estimulação ovariana. Removemos uma parte do córtex de um ou ambos os ovários de pacientes sob cirurgia laparoscópica. Os tecidos cortical ovarianos foram cortados em pequenos cubos para interromper a via de sinalização do Hipopótamo e estimular o desenvolvimento de folículos em estágio inicial. Estes cubos foram enxertados ortotropicamente em ovários remanescentes, bem como sob a serosa de ambos os tubos de Falópio. Já publicamos o procedimento cirúrgico da IVA livre de drogas e o protocolo de estimulação ovariana subsequente, mas aqui apresentamos os detalhes dos métodos laboratoriais necessários para a IVA livre de drogas.

Introdução

A função ovariana diminui progressivamente durante o envelhecimento e algumas condições fisioterológicas, incluindo anormalidade do karyótipo, doenças autoimunes, terapias de quimioterapia e radiação e cirurgias ovarianas. A preservação da fertilidade é uma das melhores opções para mulheres solteiras com disfunção ovariana severa para preservar seu potencial para futura gravidez. Para a preservação da fertilidade, atualmente dois métodos estão disponíveis principalmente no campo onco-fertilidade. A criopreservação oócito é um procedimento bem estabelecido para a preservação da fertilidade e muitos casos de sucesso foram relatados^1,2. Por outro lado, a criopreservação do tecido ovariano também foi estabelecida para preservação da fertilidade em pacientes com câncer, mas ainda é uma estratégia experimental^3,4. Em ambos os métodos, são necessários múltiplos números de oócitos maduros para que a gravidez ocorra. Geralmente, pacientes com insuficiência ovariana prematura (POI), que se tornam amorréia antes dos 40 anos de idade, e mulheres de meia-idade com baixa reserva ovariana apresentaram baixa resposta ovariana (POR) à estimulação ovariana por produzir oócitos maduros^5,6,7. Além disso, pacientes jovens com baixo número de folículos antral também mostraram POR para a estimulação ovariana⁷. Esses pacientes têm oócitos muito limitados mesmo após a hiperestimulação ovariana adequada, exigindo assim múltiplos procedimentos caros para garantir um número suficiente de oócitos para a gravidez.

A doação de oócitos seguida de fertilização in vitro (FIV) com a transferência de espermatozoides e embriões do marido (ET) é a única opção para esses pacientes POI e POR que têm dificuldades para obter seus próprios oócitos^8,9,10. No entanto, a doação de oócitos é complicada por questões éticas, bem como complicações autoimunes e de gravidez^11,12,13,14. Para resolver essas questões, deseja-se o estabelecimento do tratamento de infertilidade utilizando o próprio oócito dos pacientes. Para pacientes com POI, desenvolvemos a abordagem de ativação in vitro (IVA) para permitir o crescimento bem-sucedido do folículo e a geração de oócitos maduros, liderando uma série de gestações e partos¹⁵. No IVA, fragmentamos córtex ovariano após a remoção de ovários sob cirurgia laparoscópica e os cultivaram por dois dias para ativar folículos por drogas estimulantes de Akt e, em seguida, realizar enxerto heterotópico de volta em bolsas artificiais feitas sob a serosa de tubos de Falópio sob a segunda cirurgia laparoscópica¹⁵. Este procedimento promoveu o crescimento de folículos primordiais, primários e secundários após a fragmentação do córtex ovariano para promover a interrupção da sinalização de Hipopótamo^16,seguido por dois dias de cultura com estimuladores de sinalização Akt¹⁷.

Em contraste com os casos graves de POI, os pacientes com reserva ovariana reduzida têm múltiplos folículos secundários. Como a interrupção da sinalização de Hipopótamo por si só é eficaz na promoção do crescimento secundário do folículo^16,recentemente demonstramos gestações e entregas bem sucedidas para pacientes por usando o procedimento IVA livre de drogas envolvendo fragmentação cortical e enxerto ortotópico sem tratamento das drogas estimulantes Akt. IVA livre de drogas estimula o estágio inicial dos folículos ovarianos a se desenvolverem para o estágio do folículo pré-cirúrgico após apenas uma cirurgia e aumentou o número de oócitos recuperados para transferência de embriões de FIV^15,18. A abordagem IVA livre de medicamentos tem várias vantagens em comparação com o nosso IVA original por 1) evitar a perda potencial de folículo durante a cultura, 2) minimizar a invasividade e os custos da segunda cirurgia, 3) envolvendo apenas repouso pós-cirurgia de curto prazo e 4) potencial de gravidez espontânea devido ao enxerto ortotópico. Recentemente publicamos um artigo em vídeo mostrando os procedimentos cirúrgicos do IVA¹⁹ sem drogas e protocolos detalhados de estimulação ovariana após a cirurgia²⁰. Aqui, apresentamos detalhes dos métodos laboratoriais necessários para o IVA livre de drogas.

Protocolo

O consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente por com diminuição da reserva ovariana que se inscreveu no tratamento IVA livre de medicamentos. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Internacional de Saúde e Bem-Estar (nº 17-S-21). O ensaio clínico foi registrado sob o número UMIN000034464 e realizado de acordo com o Código de Ética da Associação Médica Mundial (Declaração de Helsinque).

1. Extração do córtex ovariano

1. Remova parte do córtex ovariano (10 x 10 mm, 2-3 mm de espessura) de um ou ambos os ovários sob anestesia geral através de cirurgia laparoscópica como descrito anteriormente^19,20.
2. Coloque os córtex ovarianos coletados em um recipiente estéril contendo 10 mL de HTF modificado (mHTF) a 37 °C.

2. Fragmentação do córtex ovariano

NOTA: Antes da dissecação do córtex ovariano, aqueça mHTF a 37 °C. Mantenha condições estéreis durante todo o procedimento. Todas as ferramentas para este procedimento estão listadas na Tabela de Materiais.

1. Coloque os córtex ovarianos coletados em um prato plástico contendo 5-10 mL de mHTF a 37 °C e coloque-os na placa de calor para manter o tecido a 37 °C (Figura 2A).
2. Tire uma foto de cada córtex usando uma câmera digital com o nome do paciente antes de iniciar o próximo procedimento para vincular dados de fundo do paciente.
3. Coloque um córtex individual em uma gaze estéril umedeçada com mHTF(Figura 2B).
   NOTA: Aplique mHTF adicional com uma pipeta descartável na gaze para evitar que a superfície do córtex seja seca durante este procedimento.
4. Remova o tecido de medula residual onde parece rosa usando uma micro-tesoura para que a espessura do tecido atinja 1-2 mm(Figura 2C e D).
   NOTA: Para evitar a perda de folículos em estágio inicial, não prepare as tiras corticais com menos de 1 mm de espessura, pois os folículos em estágio inicial estão localizados dentro de 1-2 mm da superfície do córtex ovariano²¹.
5. Disseque uma peça de tecido de 1 mm x 1 mm x 5 mm de cada tira cortical ovariana utilizando um bisturi fino e submeta-o à análise histológica para determinar a presença de folículos residuais como descrito anteriormente¹⁸ (Figura 2E).
   NOTA: Os tecidos dissecados para histologia estão imersos em mHTF e mantêm-se a 4 °C até a fixação(Figura 2F, ver Passo 4).
6. Corte o córtex em tiras de 1mm x 1 mm x 10 mm usando um bisturi fino(Figura 2G).
   NOTA: É mais fácil cortar pressionando o bisturi do que puxando-o.
7. Corte essas tiras de tecido em cubos pequenos de 1 mm x 1 mm(Figura 2H).
   NOTA: Para evitar alterações de pressão osmótica no meio, adicione mHTF com moderação antes do autoenxerto tecidual.

3. Enxerto automático de fragmentos cortical ovarianos

1. Abra o pacote da cânula IVA e coloque-a em uma cortina estéril.
2. Enxágüe dentro da cânula IVA com mHTF aspirando e descarregando mHTF várias vezes.
3. Aspire 100-200 μL de mHTF para encher a ponta da cânula IVA para evitar que os cubos corticais sequem durante o carregamento(Figura 3A).
4. Carregue os cubos cortical na ponta da cânula IVA usando uma pinça fina (Figura 3B-E).
   NOTA: O número de cubos corticais para carregamento depende do local de enxerto. Geralmente, 20-30 cubos podem ser transplantados em um ovário remanescente ortotrópico, enquanto 10-15 cubos podem ser transplantados em uma bolsa sob a serosa do tubo de Falópio.
5. Depois de carregar os cubos corticais, segure a ponta da cânula contendo os cubos corticais pelos dedos até transferir a cânula IVA para um cirurgião. Isso evitará que a temperatura do cubo diminua.
   NOTA: Os detalhes do procedimento de autoenxerção sob cirurgia laparoscópica foram relatados anteriormente¹⁹. Para enxerto de cubos cortical ovariano, um dispositivo em forma de cânula (IVA cannula) foi desenvolvido pelo nosso colaborador, a Kitazato Corporation.

4. Análise histológica do córtex ovariano

NOTA: Para contar o número de folículos residuais, realize análise histológica conforme descrito^{anteriormente 15}.

1. Marque a superfície da tira cortical com um corante de marcação tecidual antes da fixação da amostra. Isso indicará o lado do córtex na tira para histologia.
2. Fixar as tiras de tecido durante a noite a 4 °C usando a solução de Bouin.
   NOTA: Para detectar folículos atreéticos, não recomendamos o uso de paraformaldeído para fixação para evitar o encolhimento do citoplasma oócito.
3. Desidratar e incorporar as tiras de tecido em parafina.
4. Seção em série do bloco de parafina contendo a amostra de tecido.
5. Manche cada seção usando hematoxilina e eosina para visualizar os folículos.
6. Conte os folículos como descrito anteriormente¹⁷.

Resultados

Na primeira publicação da abordagem IVA^15,transplantamos os cubos cortical ovariano um a um nos locais de enxerto sob cirurgia laparoscópica(Figura 1A). Como 100-150 cubos ovarianos foram usados, levou de 3 a 4 horas para enxerto de tecido sob cirurgia laparoscópica. Além disso, alguns cubos ovarianos foram perdidos antes do enxerto. Como a cânula IVA poderia transferir 20-30 cubos para um local de enxerto de uma só vez(Figura 1B),...

Discussão

Neste manuscrito, mostramos um protocolo laboratorial detalhado para IVA livre de drogas. O IVA sem medicamentos é uma nova abordagem do tratamento da infertilidade para pacientes com POR com diminuição da reserva ovariana para promover o crescimento de folículos secundários, resultando em produzir oócitos mais maduros após a estimulação ovariana e aumentando na gravidez bem sucedida²⁰. Em 15 pacientes por com diminuição da reserva ovariana, essa abordagem alcançou uma gravidez espont?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4.5 onz specimen container	FALCON	354013	Other products may also be suitable
60mm dish	FALCON	351007	Other products may also be suitable
50 x 50 cm sterile drape	HOGY Medical	SR-823	Any type of sterile produsts may also be suitable
Disposable pippete	FALCON	357575	Other products may also be suitable
Fine scissors, Curved	WPI	#14224-G	Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products
Hot plate	TOKAI HIT	TPiE-SP	Use at operation room to maintain the temperature of dishes containing ovarian tissue before transplantation
Human Serum Albumin Solution	Irvine Scientific	9988	Medium for handling ovarian tissue
IVA cannule	KITAZATO	446030 IVA-6030E	Specific cannula for tissue autografting
KAI medical Disposable scalpel	WPI	#5 10-A	Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products
Micro scissors, Curved	WPI	#503364	Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products
Modified HTF Medium-HEPES	Irvine Scientific	90126	Medium for handling ovarian tissue
Sterile gauze	Osaki Medical	15004	Any type of sterile produsts may also be suitable
Swiss Tweezers, Curved Tips	KAI	#504505	Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products