قياس التدفق الخلوي وتحليل التصوير متحد البؤر للتعبير المنخفض في الخلايا الزعترية Axin2-mTurquoise2 Reporter

Summary

من المعروف أن مستويات الإشارات تنظم مصير الخلية ، مما يشير إلى أن تنظيم إشارات Wnt يشكل هدفا علاجيا مثيرا للاهتمام. هنا ، نصف قياس التدفق الخلوي وطرق تحليل الفحص المجهري متحد البؤر لنموذج مراسل إشارات Wnt الكنسي القوي للفئران الذي يقيس مستويات إشارات Wnt المميزة.

Abstract

يعد قياس مستويات تعبير Wnt أمرا ضروريا عند محاولة تحديد أو اختبار أهداف علاجية جديدة ل Wnt. أظهرت الدراسات السابقة أن إشارات Wnt الكنسية تعمل عبر آلية تعتمد على الجرعة ، مما يحفز الحاجة إلى دراسة وقياس إشارات Wnt في أنواع مختلفة من الخلايا. على الرغم من اقتراح العديد من نماذج المراسلين لتمثيل تعبير Wnt الفسيولوجي ، إلا أن السياق الجيني أو بروتين المراسل أثر بشكل كبير على صحة ودقة ومرونة هذه الأدوات. تصف هذه الورقة طرق الحصول على البيانات التي تم الحصول عليها وتحليلها باستخدام نموذج مراسل Wnt للفأر Axin2-mTurquoise2 ، والذي يحتوي على أليل Axin2^em1Fstl متحور. يسهل هذا النموذج دراسة إشارات Wnt الكنسية الذاتية في الخلايا الفردية على مدى مجموعة واسعة من نشاط Wnt.

يصف هذا البروتوكول كيفية تقدير نشاط مراسل Axin2-mTurquoise2 بشكل كامل باستخدام تحليل مجموعات الخلايا لنظام المكونة للدم ، جنبا إلى جنب مع علامات سطح الخلية أو تلطيخ β-catenin داخل الخلايا. تعمل هذه الإجراءات كقاعدة للتنفيذ والتكاثر في الأنسجة أو الخلايا الأخرى ذات الأهمية. من خلال الجمع بين فرز الخلايا المنشطة بالفلورة والتصوير متحد البؤر ، يمكن تصور مستويات تعبير Wnt الكنسية المتميزة. توفر استراتيجيات القياس والتحليل الموصى بها بيانات كمية عن مستويات التعبير الفلوري من أجل التقييم الدقيق لإشارات Wnt الكنسية. ستكون هذه الطرق مفيدة للباحثين الذين يرغبون في استخدام نموذج Axin2-mTurquise2 لأنماط تعبير Wnt الكنسية.

Introduction

إشارات Wnt الكنسية هي مسار إشارات محفوظ متورط في توازن الأنسجة السليمة وكذلك في المرض. ثبت أن التنظيم الدقيق لمستويات إشارات Wnt مهم في التطور الجنيني ، ولكنه أيضا ذو أهمية كبيرة في الأنسجة البالغة. تم العثور على إشارات Wnt الكنسية لتلعب دورا مهما في تجديد أنسجة العديد من الأعضاء مثل الأمعاء والجلد والجهاز المكونة للدم. ومن ثم ، عندما يتم إلغاء تنظيم إشارات Wnt ، تنشأ أمراض شديدة. سرطان القولون والمستقيم والكبد والجلد والأمراض العصبية ، بالإضافة إلى بعض الأورام الخبيثة الدموية هي أمراض نموذجية حيث تكون إشارات Wnt غير المنظمة هي العامل المسبب أو المساهم¹. لذلك ، يتم حاليا اختبار العديد من مثبطات أهداف Wnt المختلفة في التجارب السريرية مثل علاجات السرطان المرتبطة ب Wnt².

بالإضافة إلى ذلك ، تحدث تطورات مثيرة للاهتمام في الإمكانات العلاجية ل Wnt للتعافي العصبي ، والاضطرابات العصبية المرتبطة بالعمر ، واضطرابات طيف التوحد الخلقي^3،4،5. تم استكشاف إشارات Wnt لتوسيع الخلايا الجذعية خارج الجسم الحي للزرع^{اللاحق 6}. ومع ذلك ، فإن الاستهداف العلاجي لإشارات Wnt الكنسية هو مسعى صعب نظرا لأهميته في العديد من وظائف الخلية الأساسية والحديث المتبادل مع المسارات الأخرى^7،8،9 ، مما يؤدي إلى الحاجة إلى قياس تأثيرات هذه العوامل العلاجية Wnt بدقة في نموذج سهل التفسير. يتم تشغيل إشارات Wnt الكنسية بواسطة روابط Wnt قصيرة المدى قابلة للذوبان ، والتي تفرزها الخلايا المجاورة أو كإفراز أوتوكرين كما هو مذكور في أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية المستجيبة ل Wnt.

تستجيب المستقبلات المشتركة لمستقبلات Wnt المجعد والبروتين المرتبط بمستقبلات البروتين الدهني (LRP) لهذه الروابط ، مما يؤدي إلى سلسلة إشارات داخل الخلايا. عند إيقاف تشغيل إشارات Wnt ، يمنع مركب التدمير المكون من مثبط المحور (Axin) ، ومنتج الجين المثبط للورم ، والحمائل القولونية الغدية (APC) ، والكازين Kinase1 (CK1α) ، و Glycogen Synthase Kinase (GSK-3β) ، تراكم β-catenin (CTNNB1) عن طريق التحلل البروتيازوي. عند ارتباط مستقبلات الترابط Wnt ، يتم تعطيل مركب التدمير ، مما يؤدي إلى تراكم وتثبيت β-catenin في السيتوبلازم. يمكن أن ينتقل β-catenin النشط إلى النواة حيث يرتبط بعوامل النسخ / عامل ربط محسن اللمفاوي (TCF / LEF) لبدء نسخ الجينات المستهدفة Wnt. يعتبر Axin2 جينا مستهدفا لأنه هدف مباشر لمسار Wnt¹⁰. بالإضافة إلى ذلك ، يعمل Axin2 كمنظم سلبي بالإضافة إلى جين مراسل لإشارات Wnt الكنسية النشطة^11،12.

تم وصف العديد من مراسلي إشارات Wnt المتعارف عليها في الأدبيات وكان لهم فائدة كبيرة في فهم دور إشارات Wnt في التطور الجنيني. يستفيد معظم هؤلاء المراسلين من مواقع ربط TCF / LEF التي يتم إدخالها صناعيا ، والتي لا تستخدم الجين المستهدف الداخلي^{13،14،15،16،17،18،19}. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام استراتيجيات Axin2 التي تحترم الموقع الطبيعي للجين^{11،20،21،22،23} ، منها Axin2-LacZ مقبول بشكل عام باعتباره أقوى مراسل Wnt^{الكنسي 11}. ومع ذلك ، فإن بروتين المراسل LacZ ، على الرغم من أنه سهل الاستخدام في معظم الأنسجة ، يتطلب ركيزة β-galactosidase ، والتي من المعروف أنها قاسية على الخلايا^{الحية 24}. خاصة بالنسبة للخلايا الجذعية والخلايا الزعترية ، تزيد ظروف الكشف القاسية عن LacZ من الموت الخلوي (البيانات الخاصة غير المبلغ عنها) عند التعامل مع معلقات الخلايا.

على الرغم من أن تضخيم الإشارة الناجم عن تلطيخ LacZ مناسب لاكتشاف الإشارات المنخفضة ، إلا أنه يجعل القياس الكمي أقل مباشرة وبالتالي يمكن القول إنه أقل موثوقية. لذلك ، تم تصميم نموذج مراسل الفئران لتقليد الإستراتيجية الجينية Axin2-LacZ ، ولكن مع بروتين مراسل mTurquoise2²¹ ، لتوفير قراءة أكثر مباشرة وأقرب إلى مستويات التعبير الفسيولوجي. يعد بروتين الفلورسنت mTurquoise2 بديلا ممتازا ل LacZ نظرا لسطوعه العالي (العائد الكمي (QY) = 0.93) ، والمرونة مع البروتينات الفلورية الأخرى لتوصيف سطح الخلية على نطاق واسع ، وافتقاره إلى الحاجة إلى ركيزة خارجية. علاوة على ذلك ، توفر علاقته الجينية الوثيقة ببروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) إمكانية استخدام معظم الأجسام المضادة الفلورية التي تتعرف على GFP لاكتشاف إشارة أقوى ، إذا لزم الأمر ، في الخلايا شديدة الحساسية ل Wnt²⁵.

نموذج Axin2-mTurquoise2 ليس فقط مراسلا كنونيا، ولكنه يوفر أيضا إمكانية دراسة الأنماط الظاهرية لزيجوت متغاير الزيجوت ومماثل الزيجوت (Axin2 بالضربة القاضية). يؤدي الإدخال المستهدف ل mTurquoise2 في موقع بداية Axin2 إلى تعطيل بروتين Axin2²¹. نظرا لأن Axin2 ، المعروف أيضا باسم Conductin ، هو جزء من مجمع تدمير Wnt ، وينظم مجمع التدمير بإحكام النسخ بوساطة β-catenin ، فقد يكون غيابه الجزئي أو الكامل ذا أهمية لدراسة الأمراض المتنوعة. على سبيل المثال ، في سرطان القولون والمستقيم ، تكون مستويات Axin2 مرتفعة نسبيا بسبب فرط نشاط Wnt¹¹. ومع ذلك ، فإن دورها في الأمراض الأخرى لا يزال مجهولا إلى حد كبير. على الرغم من أن Axin2 يعتبر دورا محدودا في تدهور β-catenin ، إلا أنه يمكن تعزيز دوره في تنظيم Wnt عن طريق إضافة ببتيد صغير ، والذي يمنع نمو سرطان القولون والمستقيم بوساطة Wnt²⁶.

إجمالا ، يمكن أن يفتح التنظيم الدقيق ل Wnt عبر الأهداف العلاجية ل Wnt فرصا لتغيير ظهور أو تطور الأمراض الشديدة ويجب إجراء مزيد من التحقيق في النماذج ذات القدرة على المراسل. في هذا التقرير ، نوضح طريقة تحليل أفضل الممارسات لدينا لنموذج الفئران Axin2-mTurquoise2 لقياس التدفق الخلوي والتصوير متحد البؤر. في سياق مستويات جرعة Wnt ، يصعب اكتشاف مستويات إشارات Wnt الكنسية المنخفضة جدا ، والتي توفر قدرات الكشف والتحليل المتقدمة ميزة لاشتقاق فوائد هذا النموذج بشكل كامل. تستخدم الخلايا الزعترية كنظام نموذجي نظرا لقابليتها للحياة الخلوية الهشة ، وتعبير إشارات Wnt المتعارف عليها المنخفض ، ومنطقة السيتوبلازم المكثفة لتمثيل حساسية الكشف عن نموذج Axin2-mTurquoise2. بالإضافة إلى ذلك ، يتم شرح إجراء تلطيخ β الكاتينين الكلي النسيجي لمعلقات الخلايا الزعترية لقياس مستويات β-catenin السيتوبلازمية والتحقق من إشارات Wnt الكنسية النووية النشطة بالاشتراك مع المراسل.

Protocol

ملاحظة: تم تنفيذ جميع إجراءات الفأر بموافقة اللجنة الأخلاقية للتجارب على التابعة للمركز الطبي بجامعة ليدن (LUMC). ذكر وإناث ، من 6 إلى 12 أسبوعا ، من النوع البري (بالوزن) ، والتي لا تحتوي على إدراج لبناء مراسل Axin2-mTurquoise2 ، متغايرة الزيجوت (Tg / 0) مع إدخال واحد لبناء مراسل Axin2-murquoise2 ، وبالتالي ، تعطل جين Axin2 ، ومتماثل اللواقح (Tg / Tg) مع إدخال بناء مراسل Axin2-mTurquoise2 في كل من الأليلات وبالتالي ، اثنين من جينات Axin2 المعطلة ؛ Axin2-mTurquoise2 الفئران (B6; CBA-Axin2^em1Fstl / J الفئران) في التجارب. تم التضحية بالحيوانات عن طريق القتل الرحيم لثاني أكسيد الكربون₂ قبل عزل الأعضاء. طوال الإجراء ، قلل من تعرض العينات للضوء ، واستمر في وضع الثلج أو 4 درجات مئوية في جميع الأوقات ، ما لم يذكر بشكل مختلف. قم بتغطية العينات بورق الألمنيوم. يجب تنفيذ جميع الخطوات في مختبر قياسي مع خزانة للسلامة البيولوجية.

1. تحضير تعليق خلية الغدة الدرقية

1. احصد الغدة الصعترية من الفئران بعناية دون تلوث الدم عن طريق قطع بطن الفئران واستخراج الغدة الصعترية بالملقط. قم بتخزين/نقل مؤقتا في وسط Dulbecco المعدل (IMDM) من Iscove المثلج البارد الذي يحتوي على 2.5٪ مصل ربلة الساق الجنينية (FCS).
   ملاحظة: لتجنب انسكاب الدم وتلف الغدة الصعترية المحتمل ، لا تضحي بالفئران عن طريق خلع عنق الرحم.
2. قم بإعداد أنبوب سعة 50 مل بمصفاة خلية 70 ميكرومتر ، وبلل الفلتر ب 1 مل من وسيط IMDM / 2.5٪ FCS البارد.
3. اهرسي العضو بالطرف الخلفي لمكبس حقنة سعة 1 مل أثناء غسله مرتين بوسيط IMDM / 2.5٪ FCS بارد (الشكل 1 أ). إذا رغبت في ذلك ، أضف تركيزا نهائيا قدره 50 وحدة / مل من DNAse I إلى وسيط IMDM / 2.5٪ FCS لمنع تكتل الخلايا الميتة. اشطف الفلتر مرتين بوسيط IMDM / 2.5٪ FCS بارد ، وأعد تعليقه برفق في أنبوب 50 مل.
   ملاحظة: لا تتجاوز الحجم النهائي الإجمالي البالغ 10 مل. احتفظ بالخلايا على الجليد وفي الظلام للخطوات اللاحقة وعند عدم التعامل معها.
4. جهاز طرد مركزي عند 330 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وشفط المادة الطافية برفق من حبيبات الخلية. أعد تعليق حبيبات الخلية برفق في وسط IMDM / 2.5٪ FCS البارد غير المكتمل ، واستعد لعد الخلايا.
   ملاحظة: إذا لزم الأمر ، قم بتجميد الخلايا الصعترية وتخزينها في النيتروجين السائل في FCS-10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد للتجارب اللاحقة. سيقلل تجميد الخلايا وإذابتها بشكل صحيح من الموت المفرط للخلايا. في المتوسط ، يمكن أن يكون نصف الخلايا الزعترية موت الخلايا الصعترية بعد الذوبان بسبب اختيار الخلايا التائية الطبيعية في الغدة الصعترية ، والتي يجب مراعاتها عند تحديد عدد الخلايا الزعترية التي يجب تجميدها لكل قارورة تبريد. يجب تجميد ما لا يقل عن 2.5 × 10⁶ خلايا الغدة الزعترية لكل قارورة.

2. تحضير قياس تدفق الخلايا الصعترية

1. تحضير الخلايا الزعترية لإجراء تلطيخ سطح الخلية عن طريق تحضير 2.5 × 10⁶ خلايا زعترية لكل عينة تلطيخ في محلول ملحي مخزن بالفوسفات المثلج (PBS ، درجة الحموضة 7.4) (الشكل 1 ب). أعد حساب عدد الخلايا الحية بعد الذوبان ، إذا كانت الخلايا الزعترية قد تم تجميدها مسبقا. إذا لزم الأمر ، أضف تركيزا نهائيا قدره 50 وحدة / مل من DNAse I لمنع تكتل الخلايا الميتة.
2. استخدم ألواح تلطيخ الأجسام المضادة لتوصيف سطح الخلية لمجموعة فرعية كاملة من الخلايا الزعترية.
   ملاحظة: يمكن اختيار مجموعات أخرى من الفلوروكروم. حدد علامات سكانية نادرة للفلوروكروم الفلوري الساطع ، وإذا أمكن ، أضف علامة حية ميتة. لا ينبغي استخدام الفلوروكروم V450 أو V500 بالاشتراك مع مراسل الفلورسنت mTurquoise2 بسبب التداخل الطيفي. تحقق دائما من أطياف التألق ل mTurquoise2 مع الفلوروكرومات الزرقاء والخضراء (الشكل التكميلي 1 أ).
   1. امزج الأجسام المضادة بنسب محددة مسبقا لألواح السلبية للنسب (Lin-) بشكل منفصل في PBS / 0.2٪ ألبومين مصل البقر (BSA) / 0.1٪ NaN₃ (أزيد الصوديوم).
      ملاحظة: يتم تلطيخ جميع الخلايا غير المرغوب فيها (غير الخلايا الزعترية الموجودة في الغدة الصعترية) في عملية من خطوتين باستخدام جسم مضاد ثانوي للستربتافيدين (في هذا المثال ، phycoerythrin (Pe) -Cy7 و allophycocyanin (APC) -Cy7) ويمكن استبعادها باستخدام "بوابة تفريغ" في تحليل قياس التدفق الخلوي.
   2. امزج الأجسام المضادة بنسب محددة مسبقا للوحة التلوين السلبية المزدوجة (DN) مع الجسم المضاد الثانوي الستربتافيدين Pe-Cy7 في PBS / 0.2٪ BSA / 0.1٪ NaN₃ العازلة. استبعاد لوحة Lin- من هذا المزيج (الجدول 1).
   3. امزج الأجسام المضادة بنسب محددة مسبقا من لوحة التلوين الإيجابية المفردة غير الناضجة (ISP) والإيجابية المزدوجة (DP) والإيجابية المفردة (SP) مع الجسم المضاد الثانوي للستربتافيدين APC-Cy7 في PBS / 0.2٪ BSA / 0.1٪ NaN₃ المخزن المؤقت. استبعاد لوحة Lin- من هذا المزيج (الجدول 1).
   4. أولا ، قم بتلطيخ الخلايا الزعترية بمجموعات الخلايا غير التائية غير المرغوب فيها باستخدام مزيج الأجسام المضادة الأولية للبيوتين من ألواح Lin لمدة 30 دقيقة على الجليد في الظلام.
      ملاحظة: كل لوحة Lin- عبارة عن مجموعة مختلفة من الخلايا وبالتالي لا ينبغي تلطيخها معا في عينة واحدة.
   5. قم بالدوران عند 300 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ثم قم بإزالة المادة الطافية. اغسل الخلايا الصعترية ب 150 ميكرولتر من PBS المثلج / 0.2٪ BSA / 0.1٪ NaN₃ المؤقت ، وقم بالدوران عند 300 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
   6. قم بتلطيخ لوحة DN ولوحة ISP / DP / SP الخاصة بتلطيخ Lin المقابل لمدة 30 دقيقة على الجليد في الظلام. قم بالدوران عند 300 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم قم بإزالة المادة الطافية. اغسل الخلايا الزعترية ب 150 ميكرولتر من PBS المثلج / 0.2٪ BSA / 0.1٪ NaN₃ المؤقت ، وقم بالدوران عند 300 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
3. قم بإعداد الخلايا لقياس قياس التدفق الخلوي عن طريق التجانس باستخدام أنبوب مصفاة خلية 35 ميكرومتر ورفع الخلايا في PBS / 0.2٪ BSA / 0.1٪ NaN₃ عازلة. حماية الخلايا من الضوء ، والحفاظ على الجليد حتى وأثناء قياس مقياس التدفق الخلوي.
   ملاحظة: NaN₃ (أزيد الصوديوم) شديد السمية وقاتل. يجب توخي الحذر بشكل خاص عند العمل مع هذه المادة. اغسل يديك جيدا بعد التعامل معه ، واتصل على الفور بمركز مكافحة السموم أو الطبيب / الطبيب إذا تم ابتلاع NaN₃ .

3. قياس مقياس التدفق الخلوي

ملاحظة: يجب على المستخدمين عديمي الخبرة أولا تدريب مقياس التدفق الخلوي لأن قياس إشارة mTurquoise2 بالاشتراك مع العديد من الفلوروكرومات الأخرى يتطلب خبرة وتخطيطا درايا للتجربة. راجع جدول المواد للحصول على معلومات حول مقياس التدفق الخلوي.

1. ابدأ تشغيل مقياس التدفق الخلوي وفقا لدليل المستخدم أو أي بروتوكول آخر محدد. تحقق ، وإذا لزم الأمر ، قم بضبط مرشح ممر النطاق في مقياس التدفق الخلوي للحصول على استراتيجية مثالية للكشف عن التألق.
   ملاحظة: المرشح الموصى به ل mTurquoise2 هو 470/20 نانومتر على خط الليزر فوق البنفسجي 405 نانومتر أو 407 نانومتر أو خط الليزر الأقل شيوعا 440 نانومتر.
2. قم بمعايرة مقياس التدفق الخلوي عن طريق إنشاء إعدادات التعويض باستخدام حبات التعويض المتوفرة تجاريا وخلايا 293T المنقولة بثبات ، والتي تعبر عن mTurquoise2.
   ملاحظة: يمكن استخدام الخلايا الزعترية أحادية الصبغة بدلا من حبات التعويض. في هذه الحالة ، كان التعويض بالخرز بنفس القدر من الكفاءة وأكثر ملاءمة من استخدام الخلايا.
   1. قم بتسمية الخرزات بكل فلوروكروم فردي مستخدم في التجربة ، وقم بتضمين الخرز غير الملطخ. قم بقياس الخرزات لإعداد لوحة إعداد التعويض ، وقياس خلايا 293T التي تعبر عن التركاز التركوزي2 حيث لا يوجد فلوروكروم مطابق ل mTurquoise2 ، والذي يمكن استخدامه على الخرز. احفظ إعدادات التعويض لاستخدامها في التجربة الفعلية.
      ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا التعبيرية عن mTurquoise2 المستخدمة في إعداد التعويض أكثر سطوعا أو إشراقا من الخلايا الزعترية التي تعبر عن mTurquoise2 للتجربة الفعلية. تأكد من وجود خلايا 293T سالبة mTurquoise2.
   2. بالنسبة للتجربة ، قم بتضمين التألق ناقص واحد (FMO) الخلايا الزعترية الملطخة ب Tg / Tg ، بما في ذلك عينة بالوزن ل mTurquoise2 FMO وعينة غير ملوثة من الخلايا الزعترية لكل نمط جيني للفأر كعناصر تحكم إيجابية لجزء التحليل.
      ملاحظة: عناصر التحكم هذه مهمة لتعيين البوابات للخلايا الموجبة بشكل صحيح. يتم تلطيخ بقية العينات التجريبية بلوحة التلوين الكاملة (الجدول 1).
      1. قم بإنشاء تجربة ، وأضف وتسمية عدد الأنابيب في برنامج مقياس التدفق الخلوي ، وقم بإنشاء مخططات مبعثرة لتصور الخلايا الملطخة لمجموعة كاملة من الفلوروكروم.
      2. قم بتطبيق إعدادات التعويض التي تم إنشاؤها مسبقا على التجربة. اضبط التشتت الأمامي (FSC) والمبعثر الجانبي (SSC) باستخدام الخلايا الزعترية غير الملوثة حتى يظهر عدد الخلايا الكامل في المخطط المبعثر. قم بقياس الخلايا الزعترية غير الملوثة ب Tg / Tg mTurquoise2 التي تعبر عن الخلايا الزعترية أولا للتأكد من أن السكان الإيجابيين مرئيون.
      3. قم بقياس عينة من الخلايا الزعترية الملطخة بالكامل Tg / Tg ، وتحقق من جميع تركيبات الفلوروكروم. إذا لزم الأمر، اضبط قيم التعويض المحددة مسبقا للفلوروكرومات التي تظهر تعويضا غير صحيح. قم بقياس باقي العينات التجريبية ، ولا تقم بضبط أي إعدادات أثناء قياس العينات.
         ملاحظة: يمكن أيضا إجراء تعديل التعويض اللاحق في حزمة برامج التحليل. على الرغم من أن عدد الخلايا المتاحة يمكن أن يكون عاملا مقيدا ، فمن المستحسن تنفيذ هذه الخطوة أثناء القياس. حافظ على الإعدادات متساوية بين جميع العينات لمقارنة قيم شدة mTurquoise2.

4. تحليل التدفق الخلوي

ملاحظة: تم إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي باستخدام برنامج محدد مذكور في جدول المواد. ومع ذلك ، تتوفر أيضا برامج تحليل التدفق الخلوي الأخرى.

1. بوابة الخلايا الحية والمجموعات الفرعية للخلايا الزعترية وفقا لقيم FSC و SSC.
2. تحقق من إعدادات التعويض في مربع حوار مصفوفة التعويض الموجود على يسار العينة للتأكد من عدم وجود تداخل في الفلوروكروم وحدوث تعويض مناسب لتجنب الامتداد أو النزيف.
   1. إذا كان لا بد من تعديل المصفوفة المحددة بالاكتساب ، فقم بتغيير القيم في مصفوفة التعويض ببساطة عن طريق زيادة أو تقليل قيمة التعويض لكل تركيبة فلوروكروم بحيث لا يظهر السكان خطا أفقيا أو رأسيا مثاليا تقريبا (الشكل التكميلي 1 ب).
3. لنشر شدة mTurquoise2 بصريا للحصول على بوابات إيجابية مناسبة ، قم بتغيير عرض المحور X mTurquoise2 إلى خطي (الشكل التكميلي 2).
   1. استخدم عنصر تحكم mTurquoise2 FMO كعنصر تحكم سلبي لبوابة الإشارة الإيجابية mTurquoise2. راجع بوابة العتبة الصحيحة لكل مجموعة خلية (الشكل 2).
      ملاحظة: لا تحتوي خلايا التحكم mTurquoise2 FMO (بالوزن) على علامة mTurquoise2 ، وبالتالي ، يمكن استخدامها كعتبة خلفية لنشاط مراسل Axin2.
4. بوابة الخلايا الإيجابية mTurquoise2 مع قناة الكشف المناسبة لتحديد عدد الخلايا موجبة Wnt.
5. احسب المتوسط الهندسي والوسيط لتحديد مقدار شدة الفلورسنت في الخلايا ذات الاهتمام.
   1. اضغط على الإحصائيات | أضف إحصائية داخل اللوحة توضح الخلايا الإيجابية ل mTurquoise2.
   2. حدد طريقة الإحصاء والسكان محل الاهتمام وقناة الكشف عن mTurquoise2 ، وانقر فوق إضافة. تمثيل المتوسط الهندسي ومتوسط شدة الفلورسنت بالوحدات التعسفية (AU) لرسم الرسوم البيانية.
      ملاحظة: يمثل الوسيط القيمة المتوسطة لشدة الفلورسنت ، وبالتالي يوفر معلومات حول التحول السكاني لكثافة الفلورسنت. إذا لزم الأمر ، يمكن أن يساعد تصحيح الخلفية في الحصول على تصور أوضح للنطاق الديناميكي لنشاط مراسل mTurquoise2. يمكن القيام بذلك عن طريق طرح ترددات تلطيخ الخلفية بالوزن من التردد الكلي للخلايا الإيجابية mTurquoise2 من نوع الخلية المحدد المبوابة.

5. تحضير الخلايا الزعترية للتصوير متحد البؤر

ملاحظة: يوصى باستخدام الخلايا الزعترية عند العمل مع معلقات الخلايا للخلايا غير الملتصقة. نظرا لأن التعبير عن Axin2-mTurquoise2 في الخلايا الغدة الصعترية أقل منه في الخلايا الظهارية الصعترية ، فقد تم استخدام معلقات خلايا الغدة الصعترية المفلترة للتصوير.

1. ابدأ بتعليق خلوي من الخلايا الصعترية التي تم حصادها حديثا أو المجمدة. قم بتعليق ~ 20,000 من الخلايا الزعترية في 100 ميكرولتر من PBS البارد / 0.5٪ BSA / 10٪ FCS لكل نمط وراثي للخلايا الزعترية.
   ملاحظة: إذا لزم الأمر ، قم بإذابة الخلايا برفق للحفاظ على أقصى قدر من صلاحية الخلية عند العمل مع الخلايا الصعترية المجمدة مسبقا. سيساعد هذا في تقليل التألق الذاتي عند تصوير الخلايا. تحقق من صلاحية الخلية لضمان جودة العينة. يستخدم إجراء Cytospin قوة ميكانيكية تم تكييفها مع الخلية الزعترية الهشة. ومع ذلك ، فإنه يتطلب مجموعة سكانية قابلة للحياة للغاية. لضمان بقاء أعلى ، ينصح بالبدء بالخلايا الصعترية التي تم حصادها حديثا بدلا من الخلايا الصعترية المجمدة.
2. قم بتبلل المنطقة المحيطة بفتحة بطاقات التصفية باستخدام PBS. قم بتجميع حامل غرفة عينة السيتوبين وفقا للدليل (الشكل 1 ج).
   1. ضع بطاقة الفلتر على شريحة الصقيع (الجانب الأملس مقابل الشريحة الزجاجية). ضع كلا العنصرين على حامل غرفة العينة. احرص على وضع بطاقة المرشح بالضبط على فتحة حامل غرفة العينة ، وضع حامل غرفة العينة الكامل في الدوار.
3. أعد تعليق الخلايا الزعترية بعناية ، وأضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في غرف العينة. قم بتدوير تعليق الخلايا الزعترية لمدة 4 دقائق عند ~ 350 × جم على شرائح الصقيع. قم بإزالة بطاقة الفلتر بعناية من شريحة الصقيع دون لمس الخلايا. جفف الغمات الخلوية في الهواء لفترة تتراوح من 1 ساعة حتى بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: عند العمل مع أنواع الخلايا الأخرى ، اختبر كثافات الخلايا المختلفة للحصول على أفضل النتائج. يمكن تجميد Cytospins عند -20 درجة مئوية في صندوق مغلق للتجارب اللاحقة. قم بإذابة الجليد لمزيد من المعالجة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.

6. تلطيخ المناعي Cytospin مع إجمالي β-catenin

1. قم بإصلاح الدوران الخلوي لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في 100٪ من الميثانول. جفف الشرائح بالهواء لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ارسم دائرة حول مجموعة الخلايا الزعترية على الشريحة الزجاجية بقلم كاره للماء.
   ملاحظة: تم تحسين خطوة التثبيت هذه خصيصا لتلوين β-catenin.
2. ضع الشرائح في PBS / 0.05٪ Tween-20 لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم انقلها إلى صندوق رطب داكن أثناء خطوات الحظر والحضانة. أضف 100 ميكرولتر من مصل الماوس العادي PBS / 10٪ (NMS) لكل شريحة ، واتركه في الصندوق الرطب لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اضغط على الشريحة لإزالة 10٪ NMS ، وأضف 100 ميكرولتر من PBS / 10٪ مصل الماعز العادي (NGS) لكل شريحة ، واتركه في الصندوق الرطب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: الحضانة باستخدام PBS / 10٪ NMS تمنع ارتباط الأجسام المضادة الأولية غير المحددة (الشكل 1D) ، بينما يمنع PBS / 10٪ NGS ارتباط الأجسام المضادة الثانوية غير المحددة.
3. تحضير أجسام مضادة إضافية للتلوين الخلوي. امزج 0.5 ميكروغرام من إجمالي الجسم المضاد β-catenin مع الأجزاء المسماة AF568.
   ملاحظة: في هذا الإعداد ، تم استخدام مجموعة أدوات وضع العلامات المتوفرة تجاريا لوضع العلامات المسبقة على إجمالي β-catenin الأساسي المضاد للفأر مع شظايا IgG1 Fab الثانوية المضادة للفأر مع ملصق Alexa Fluor 568 (AF568) قبل إضافته إلى الخلايا الزعترية. قم بإجراء الملصقات وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة حيث قد يلزم اختبار العديد من التركيزات. استخدم الجسم المضاد الكلي المسمى β-catenin-AF568 في غضون 30 دقيقة.
4. أضف 50 ميكرولتر (0.5 ميكروجرام) من إجمالي الجسم المضاد المسمى β-catenin-AF568 لكل شريحة تدور الخلوي طوال الليل عند 4 درجات مئوية في صندوق رطب. قم بتضمين عنصر تحكم سلبي في التلوين وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة أو عنصر تحكم في النمط المتماثل في حالة وجود بروتوكول وضع العلامات المباشر.
5. يغسل لمدة 20 دقيقة باستخدام PBS / 0.05٪ Tween-20 في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسلها لمدة 20 دقيقة باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة في برطمان مع التحريك. قم بإجراء خطوة تثبيت ثانية لضمان ارتباط الجسم المضاد بالمستضد: 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع 100 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في PBS في صندوق رطب.
   ملاحظة: احتفظ بالشرائح في الظلام. لن يؤثر تثبيت الميثانول ولا PFA بشكل كبير على تعبير mTurquoise2²⁷.
6. اغمس الشرائح في PBS. قم بإجراء تلطيخ نووي باستخدام 50 ميكرولتر من TO-PRO-3 (1: 1500) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الصندوق الرطب. اغسل الشرائح لمدة 20 دقيقة باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة في مرطبان مع التحريك.
   ملاحظة: يمكن معايرة تركيز TO-PRO3 اعتمادا على استخدام الفلوروكرومات الأخرى ذات الأطياف الفلورية القريبة.
7. قم بتضمين العينات بكاشف مضاد للبهتان وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ، وقم بتغطيتها بغطاء يجفف في الهواء لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة. اعرض الشرائح مباشرة تحت المجهر الفلوري أو متحد البؤر ، أو قم بتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية للتصوير لاحقا.

7. القياس المجهري متحد البؤر

ملاحظة: انظر جدول المواد للحصول على معلومات حول المجهر متحد البؤر.

1. قم بتشغيل المجهر متحد البؤر وفقا للدليل أو البروتوكول المعمول به. استخدم عناصر التحكم في خط الخلايا الصلبة والإيجابية المنقولة بشكل ثابت mTurquoise2 293T للضبط الأولي للإعدادات متحدة البؤر. بعد ذلك ، استخدم الخلايا الزعترية wt Axin2-mTurquoise2 و Tg / Tg (بالضربة القاضية) Axin2-mTurquoise2 كعناصر تحكم سلبية وإيجابية ، على التوالي ، لضمان عدم التعرض المنخفض لإشارة mTurquoise2.
2. قم بإعداد البرنامج للمسح المتسلسل عن طريق برمجة أشعة الليزر وعرض المرشح. ابدأ بأعلى خط ليزر بطول موجي أولا ، واعمل على أقل طول موجي. عند تثبيت جميع خطوات المسح المتسلسلة، قم بتحميل العينة على مرحلة المجهر، وركز العينة، واضغط على Live لتحسين طاقة الليزر والكسب الذكي باستخدام الأزرار المعنية على البرنامج متحد البؤر أو اللوحة اليدوية الاختيارية.
   ملاحظة: لا ينبغي تصوير قسم العينة من الشريحة لقياس الإشارة حيث من المحتمل أن يحدث تبييض ضوئي. ومع ذلك ، فإن mTurquoise2 لديه ثبات ضوئي عال²⁵.
3. في حالة تعبير mTurquoise2 المنخفض جدا ، قم بزيادة طاقة الليزر والكسب الذكي حتى يتم ملاحظة إشارة الفلورسنت ، وتحقق من عينة التحكم السلبية للتأكد من إشارة إيجابية حقيقية. تصور الخلايا الزعترية باستخدام عدسة زيتية 40 × 1.4 أو عدسة زيتية 63 × 1.4 أو عدسة زيت 100 × 1.4.
   ملاحظة: تم استخدام مجهر Leica SP5 لهذه الدراسة.
4. استخدم إعدادات التصوير متحد البؤر هذه على المجهر قبل قياس العينة.
   1. اضبط نطاق قيمة الشدة على صورة 12 بت بالنقر فوق التكوين | الإعدادات | قم بالتغيير إلى 12 بت في خيار عمق البت لإنشاء مقياس أوسع للشدة وبالتالي ، مزيد من التمييز بين إشارات الفلورسنت المنخفضة والعالية.
   2. اضبط دقة التصوير بالنقر فوق XY ، وقم بزيادة التنسيق إلى 1024 × 1024 ، مما سيضاعف أيضا وقت المسح. اضبط سرعة المسح الضوئي على 400-600 هرتز بالنقر فوق السرعة | المزيد لتغيير الإعدادات يدويا. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتنشيط خيار المسح ثنائي الاتجاه.
   3. اضبط شريط تمرير الحساسية لتقليل إشارة الخلفية. قم بتحسين طاقة الليزر الصحيحة والكسب الذكي باستخدام خيار Quick LUT (جدول البحث).
      ملاحظة: في الصورة 12 بت، يحتوي شريط التمرير على قيمة شدة مقياس رمادي من 0 إلى 4095. يمكن القيام بذلك أيضا بعد ذلك باستخدام برنامج Las X المجاني غير المتصل بالإنترنت. سيظهر اللون الأخضر الخلفية السوداء ، ويظهر اللون الأزرق وحدات البكسل المشبعة للعينة.
5. عندما يتم تحسين جميع إعدادات التصوير ، قم بقياس العينة بالنقر فوق ابدأ ، والذي سيبدأ التصوير المتسلسل لجميع القنوات الثلاث.
   1. قم بقياس إشارة الفلورسنت النووية TO-PRO-3. اكتشف TO-PRO-3 باستخدام ليزر 633 نانومتر و HyD 640-750 نانومتر.
      ملاحظة: في هذا الإعداد ، تم استخدام طاقة ليزر بنسبة 6٪ بكسب ذكي بنسبة 15٪. يمكن أن يتغير هذا الإعداد اعتمادا على شدة تلطيخ TO-PRO-3. إذا كان ساطعا جدا ، فقد يؤثر على الفلوروكرومات منخفضة الكثافة عند الإفراط في الإثارة. في مثل هذه الحالة ، قلل من تركيز تلطيخ.
   2. قياس إشارات الفلورسنت النووية والسيتوبلازمية β-catenin. اكتشف β-catenin باستخدام ليزر 561 نانومتر و HyD 580-605 نانومتر. قم بتجميع ما يصل إلى 2 عمليات مسح ضوئي لصورة واحدة عن طريق ضبط الإعداد في مربع XY في البرنامج بمتوسط الخط 2 في حالة انخفاض إشارة AF568.
      ملاحظة: في هذا الإعداد ، تم استخدام طاقة ليزر بنسبة 85٪ بكسب ذكي بنسبة 87٪.
   3. قم بقياس إشارة الفلورسنت السيتوبلازمية mTurquoise2. اكتشف mTurquoise2 باستخدام ليزر 458 نانومتر و HyD 490-600 نانومتر. قم بتجميع ما يصل إلى 4 عمليات مسح لصورة واحدة عن طريق ضبط الإعداد في مربع XY في البرنامج بمتوسط الخط 4 في حالة انخفاض إشارة mTurquoise2.
      ملاحظة: نظرا لليزر القديم على المجهر متحد البؤر المستخدم لهذا البروتوكول وإشارة mTurquoise2 المنخفضة ، تم استخدام 405 نانومتر بقوة ليزر 90٪ ، جنبا إلى جنب مع ليزر 458 نانومتر و 476 نانومتر بقوة ليزر 100٪ مع HyD 490-550 نانومتر عند كسب ذكي بنسبة 100٪. الليزر 440 نانومتر هو الأمثل ، وإن كان أقل شيوعا في المجهر متحد البؤر. يجب التعامل مع طاقة الليزر العالية بعناية وتنفيذها فقط بالتصوير المسلسل. تأكد من وضع إعدادات الطوارئ لتجنب التعرض المفرط للكاشف. يمكن أن تكون طاقة الليزر على المجاهر متحدة البؤر الأخرى أدنى من تلك المقترحة في هذا البروتوكول بسبب الليزر الأكثر فعالية أو الأحدث. يمكن إجراء اختبار التبييض لضمان عدم فقد إشارة الفلورسنت قبل التصوير. في الإعداد المقترح ، كان التبييض الضوئي ل mTurquoise2 مقبولا.
   4. قم بإجراء تصوير المجال الساطع لتصور الخلية الكلي. اكتشف الخلايا الصعترية باستخدام ليزر 488 نانومتر و PMT Scan-DIC. تصدير ملفات Lif لتحليل الصور.
      ملاحظة: في هذا الإعداد ، تم استخدام طاقة ليزر بنسبة 59٪ بكسب 212 فولت وإزاحة بيانات -4.3٪. يمكن قراءة ملفات Lif في برنامج LAS x غير المتصل بالإنترنت لتصحيح الصور.

8. تحليل الفحص المجهري متحد البؤر

1. قم بتحليل الصور باستخدام برنامج معالجة الصور²⁸ (الشكل التكميلي 3). قم بتحميل الصور في البرنامج.
   ملاحظة: يتم قبول تنسيقات متعددة، ولكن يوصى باستخدام ملفات TIFF المزودة بجدول البحث أو الاستيراد المباشر لملفات Lif إلى برنامج معالجة الصور.
2. قم بقياس إشارة β-catenin النشطة في نوى الخلايا الزعترية.
   1. حدد نوى الخلايا الزعترية الملطخة ب TO-PRO-3 في صورة القيمة الرمادية الحمراء لتحليل β-catenin النشط. قم بذلك يدويا ، أو استخدم التحديد التلقائي للخلية في البرنامج.
      ملاحظة: قد يحتاج الاختيار التلقائي للخلية إلى معالجة الصور من أجل العتبة المناسبة وتحليل الجسيمات. يمكن أن يكون الاختيار اليدوي للخلية شاقا ، ولكنه لا يتطلب بشكل عام أي معالجة للصور ويوصى به في هذا البروتوكول.
   2. قم بتنشيط التحديد اليدوي باستخدام أي من أدوات التحديد في شريط العمل.
      1. حدد محيط النواة، وأضفه إلى مدير منطقة الاهتمام (ROI). قم بتنشيط مدير عائد الاستثمار بالنقر فوق تحليل | أدوات | مدير عائد الاستثمار ، وعند فتح نافذة مدير عائد استثمار جديدة ، انقر فوق الخيار الأول إضافة (ر) ، أو استخدم اختصار لوحة المفاتيح t. كرر الخطوة السابقة حتى يتم تحديد جميع النوى وإضافتها إلى مدير عائد الاستثمار. استخدم الخيار إظهار الكل في مدير عائد الاستثمار لتصور الخلايا المحددة.
   3. حدد >3 مناطق خلفية لا توجد فيها خلايا، وأضفها إلى مدير عائد الاستثمار.
      ملاحظة: الحجم والشكل غير مهمان في هذه الحالة. ستكون هذه المناطق بمثابة قياسات ضوضاء الخلفية للحساب النهائي.
      1. حدد القياس على الصورة بالنقر فوق تحليل | تعيين القياسات. في النافذة الجديدة التي تفتح بخيارات قياس مختلفة ، قم بتنشيط المساحة والكثافة المتكاملة ومتوسط القيمة الرمادية | انقر فوق موافق.
      2. قم بتنشيط صورة القيمة الرمادية β-catenin بالنقر فوقها ، وتصور النوى المحددة ومناطق الخلفية بالنقر فوق إظهار الكل في مدير عائد الاستثمار. لاحظ جميع المناطق المحددة التي تظهر الآن في صورة β-catenin.
      3. انقر فوق قياس في مدير عائد الاستثمار أو انقر فوق تحليل | قياس. راقب نافذة النتائج الجديدة التي تفتح ، والتي تعرض نتائج إشارة β-catenin داخل عائد الاستثمار.
      4. انقل النتائج إلى برنامج حساب جداول البيانات بالنقر فوق تحرير | حدد الكل؛ وانسخ / الصق القائمة في جدول البيانات لمزيد من الحساب. احفظ مدير عائد الاستثمار للرجوع إليه في المستقبل دون الحاجة إلى تكرار تحديد النوى بالنقر فوق المزيد | أنقذ....
   4. للتحديد التلقائي للخلية، قم بإجراء التكرارات (لوحة المفاتيح Ctrl D) للصورة المراد معالجتها حيث لا يمكن التراجع عن العديد من إعدادات معالجة الصور.
      ملاحظة: تتطلب الملصقات النووية المؤتمتة معالجة الصور، في معظم الحالات، لتحديد النوى تلقائيا وبدقة. يجب أن تتم معالجة الصور فقط لأغراض اختيار المنطقة. الصور المعالجة ليست مفيدة لقياس شدة الفلورسنت لأنه يتم تغيير قيم البكسل.
      1. قم بإجراء مرشح Gaussian بالنقر فوق Process | الفلاتر | Gaussian Blur لتنعيم الصورة. اختبر قيم Sigma (نصف القطر) متعددة ، وقم بتنشيط خيار المعاينة لتصور التأثير قبل النقر فوق موافق.
      2. اقلب الصورة بالنقر فوق تحرير | انعكاس. تحقق من السطوع والتباين بالنقر فوق الصورة | ضبط | السطوع / التباين. استخدم الخيار تلقائي أو يفضل تغيير القيم يدويا.
         ملاحظة: لا تقم بتطبيق التغييرات لأن هذا قد يغير خصائص الصورة. ما عليك سوى إغلاق نافذة B&C عند الحصول على الصورة المطلوبة.
      3. إنشاء حد بالنقر فوق صورة | ضبط | Threshold ، وتحديد أفضل إعدادات Threshold حيث تكون جميع الخلايا مرئية في الغالب. انقر فوق تطبيق لتطبيق إعدادات الحد.
         ملاحظة: إذا لم يتم تطبيق عتبة على الخلايا التي تظهر ثقوبا ، فانقر فوق عملية | ثنائي | املأ الثقوب لملء الفجوات داخل الخلايا. إذا تم دمج الخلايا مع إعدادات العتبة ، فانقر فوق عملية | ثنائي | مستجمعات المياه لفصل هذه الخلايا. سيفصل الخط الدقيق بحجم 1 بكسل أي خلية يفسرها البرنامج على أنها مدمجة.
      4. حدد أصغر وأكبر نواة في الصورة عن طريق تحديد النواة التي تختارها يدويا باستخدام أداة التحديد اليدوية ، وإضافتها إلى مدير عائد الاستثمار ، وقياس المنطقة.
      5. تحليل الجسيمات (النوى) بالنقر فوق تحليل | قم بتحليل الجسيمات، وأدخل أصغر مساحة وأكبر مساحة في مربع الحجم (^2) مع واصلة (-) بينهما. قم بتنشيط مربعات عرض النتائج والإضافة إلى المدير والاستبعاد على الحواف قبل النقر فوق موافق. تابع الخطوة 8.2.3 لإكمال البروتوكول.
3. قم بقياس إشارات السيتوبلازمية mTurquoise2 و β-catenin في الخلايا الزعترية.
   1. حدد محيط الخلايا الزعترية الكاملة في صورة الحقل الساطع باتباع نفس الخطوات المذكورة أعلاه.
   2. حدد >3 مناطق خلفية لا توجد فيها خلايا، وأضفها إلى مدير عائد الاستثمار.
      ملاحظة: الحجم والشكل غير ضروريين في هذه الحالة. ستكون هذه المناطق بمثابة قياسات ضوضاء الخلفية للحساب النهائي.
      1. قم بتنشيط صورة القيمة الرمادية mTurquoise2 بالنقر فوقها ، وتصور إجمالي عائد الاستثمار للخلية المحددة ومناطق الخلفية بالنقر فوق إظهار الكل في مدير عائد الاستثمار. راقب جميع المناطق المحددة المرئية في صورة mTurquoise2.
      2. انقر فوق قياس في مدير عائد الاستثمار ، أو انقر فوق تحليل | قياس. راقب نافذة النتائج الجديدة التي تفتح بنتائج قياس إشارة mTurquoise2.
      3. انقل النتائج إلى برنامج حساب جداول البيانات بالنقر فوق تحرير | حدد الكل ، وانسخ / الصق القائمة في جدول البيانات لمزيد من الحساب.
      4. قم بتنشيط صورة القيمة الرمادية β-catenin بالنقر فوقها ، وتصور إجمالي عائد الاستثمار للخلية المحددة ومناطق الخلفية بالنقر فوق إظهار الكل في مدير عائد الاستثمار. راقب جميع المناطق المحددة المرئية في صورة β-catenin.
      5. انقر فوق قياس في مدير عائد الاستثمار ، أو انقر فوق تحليل | قياس. لاحظ نافذة النتائج الجديدة التي تفتح بنتائج القياس لإجمالي إشارة β-catenin الخلوية.
      6. انقل النتائج إلى برنامج حساب جداول البيانات بالنقر فوق تحرير | حدد الكل ، وانسخ / الصق القائمة في جدول البيانات لمزيد من الحساب. احفظ مدير عائد الاستثمار للرجوع إليه في المستقبل دون الحاجة إلى تكرار تحديد الخلية بالنقر فوق المزيد | أنقذ....
4. احسب التألق النووي الكلي المصحح (CTNF) ل β-catenin النشط باستخدام المعادلة 1.
   CTNF = الكثافة المتكاملة - (متوسط المنطقة × متوسط مناطق الخلفية) (1)
5. احسب مضان الخلية الكلي المصحح (CTCF) ل mTurquoise2 باستخدام المعادلة 2.
   CTCF = الكثافة المتكاملة - (متوسط المنطقة × متوسط مناطق الخلفية) (2)
6. التفريق بين β-catenin النووي النشط و β-catenin السيتوبلازمي عن طريق طرح قيم β-catenin النووية التي تم الحصول عليها في الخطوة 8.2.3.3. من إجمالي قيم β-catenin الخلية التي تم الحصول عليها في الخطوة 8.3.2.5 للحصول على β-catenin السيتوبلازمي غير النشط.
   ملاحظة: تأكد من إجراء القياسات داخل نفس الخلية.
   1. احسب متوسط شدة مناطق الخلفية. احسب CTNF و CTCF باستخدام المعادلتين 1 و 2. ضع في اعتبارك IntDen (مجموع جميع وحدات البكسل داخل المنطقة المحددة) على أنه الكثافة المتكاملة وليس RawIntDen.
   2. إذا لزم الأمر، احسب الانحراف المعياري لقيم IntDen لرسم الرسوم البيانية. ضع في اعتبارك ما يصل إلى 200 خلية منفصلة للتحليل الإحصائي باستخدام اختبار Mann-Whitney U.
7. ارسم النتائج في رسم بياني فردي لنقطة البيانات ، وقم بتسمية المحور y بقيم CTNF أو CTCF كوحدات فلورية نسبية (RFU).

النتائج

للتحقيق في دور إشارات Wnt الكنسية ، تم اختبار نموذج مراسل Wnt الكنسي Axin2-mTurquoise2 بالاشتراك مع تعبير بروتين β-catenin. من المعروف أن الخلايا الزعترية هشة ، وتظهر إشارات Wnt الكنسية المنخفضة في عدة مراحل من عملية نضج الخلايا الزعترية ، ولها نسبة منخفضة من السيتوبلازم إلى النووي. كل ه...

Discussion

يتوفر العديد من مراسلي Wnt الأساسيين بحساسية مختلفة للمراسل وبروتينات المراسل الفعلية. تتوفر نماذج المراسل التي تستخدم مواقع ربط TCF / LEF متعددة الإدخال صناعيا مع بروتينات مراسل الفلورسنت. ومع ذلك ، يمكن أن تفقد مثل هذه التكرارات للجينات المعدلة وراثيا أثناء التكاثر أو الت...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD FACScantoII flow cytometer	BD Biosciences	not aplicable	Serial number V96300710. The flow cytometer setup in this protocol contains a 405 nm laser line with 505 longpass filter and 530/30 nm bandpass filter, and 470/20 nm bandpass filter; a 488 nm laser with 735 nm longpass filter and 780/60 nm bandpass filter, 670 nm longpass filter and 655 nm longpass filter, 610 nm longpass filter, 550 nm longpass filter and 575/26 nm bandpass filter, 505 nm longpass filter and 530/30 nm bandpass filter, and 488/10 nm bandpass filter; and a 633 nm laser line with 735 nm longpass filter and 780/60 nm bandpass filter, 685 nm longpass filter, and 660/20 nm bandpass filter.
BSA	Sigma	A9647
Corning 70 μm cell strainer	Falcon/Corning	352350
Cytospin 4 Type A78300101	Thermo Scientific	not aplicable
DMSO	Sigma Aldrich	D5879-1L
DNAse I	Sigma	A9647
Falcon 50 mL Conical Centrifuge tubes	Greiner bio-one	227261
Falcon round-bottom Polystyrene Test tubes with cell strainer snap cap	Fisher Scientific	352235
Fetal Calf Serum (FCS)	Greiner Bio-One B.V.	not aplicable	Depends on origin
Fiji software	ImageJ	not aplicable	Version 1.53
Filter card white (for cytospin)	VWR	SHAN5991022
FlowJo 10 software	Treestar	not aplicable	Version 10.5.3
Frost slides	Klinipath
Gibco IMDM medium	Fisher Scientific	12440053
HCX PL APLO 40x 1.4 OIL lens	Leica microsystems	not aplicable
Hydrophobic pen: Omm Edge pen	Vector	not aplicable
Leica TCS SP5 DMI6000	Leica microsystems	not aplicable	The microscope setup in this protocol consisted of an HCX PL APO 40x/1.2 oil-immersion objective with 8-bit resolution, 1024 pixels x 1024 pixels, 400 Hz speed, pinhole 68 µm, and zoom factor of 1.5 at room temperature. This system contains a 405 diode laser, argon laser, DPSS 561 laser, HeNe 594 laser and HeNe 633 laser with 4 hybrid detectors (HyDs) and 5 photomultiplier tubes (PMTs).
Methanol	VWR	1060091000
NaN3/sodium azide	Hospital farmacy	not aplicable
Normal mouse serum	Own mice	not aplicable
PBS	Lonza	BE17-517Q
ProLong Diamond Antifade Mountant	Fisher Scientific	P36965
Purified mouse anti-β-catenin (CTNNB1)	BD Biosciences	610154
TO-PRO-3 Iodide	Thermofisher	T3605
Transparent nailpolish	at any drugstore	not aplicable
Tween-20	Sigma Aldrich	P1379-500ml
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 labeling kit	Thermofisher	Z25006