JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ידוע שרמות איתות מווסתות את גורל התא, מה שמצביע על כך שוויסות איתות Wnt מהווה מטרה טיפולית מעניינת. כאן, אנו מתארים שיטות ניתוח ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופיה קונפוקלית עבור מודל מדווח איתות Wnt קנוני עכברי חזק המודד רמות איתות Wnt מובהקות.

Abstract

מדידת רמות ביטוי Wnt חיונית כאשר מנסים לזהות או לבדוק מטרות טיפוליות חדשות של Wnt. מחקרים קודמים הראו כי איתות Wnt קנוני פועל באמצעות מנגנון מונע מינון, מה שמניע את הצורך לחקור ולמדוד איתות Wnt בסוגי תאים שונים. למרות שהוצעו מספר מודלים מדווחים לייצוג ביטוי Wnt פיזיולוגי, ההקשר הגנטי או חלבון המדווח השפיעו מאוד על התוקף, הדיוק והגמישות של כלים אלה. מאמר זה מתאר שיטות לרכישה וניתוח נתונים המתקבלים עם מודל הדיווח של עכבר Axin2-mTurquoise2 Wnt, המכיל אלל Axin2em1Fstl שעבר מוטציה. מודל זה מקל על חקר איתות Wnt קנוני אנדוגני בתאים בודדים על פני טווח רחב של פעילות Wnt.

פרוטוקול זה מתאר כיצד להעריך באופן מלא את פעילות המדווח של Axin2-mTurquoise2 באמצעות ניתוח אוכלוסיית תאים של המערכת ההמטופויאטית, בשילוב עם סמני פני התא או צביעה תוך-תאית של β-catenin . הליכים אלה משמשים בסיס ליישום ורבייה ברקמות או תאים מעניינים אחרים. על ידי שילוב של מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות והדמיה קונפוקלית, ניתן לדמיין רמות ביטוי Wnt קנוניות מובהקות. אסטרטגיות המדידה והניתוח המומלצות מספקות נתונים כמותיים על רמות הביטוי הפלואורסצנטי להערכה מדויקת של איתות Wnt קנוני. שיטות אלו יהיו שימושיות עבור חוקרים שרוצים להשתמש במודל Axin2-mTurquise2 עבור דפוסי ביטוי Wnt קנוניים.

Introduction

איתות Wnt קנוני הוא מסלול איתות משומר המעורב בהומאוסטזיס של רקמות בריאות כמו גם במחלות. ויסות מדויק של רמות איתות Wnt הוכח כחשוב בהתפתחות העוברית, אך יש לו חשיבות רבה גם ברקמות בוגרות. נמצא כי איתות Wnt קנוני ממלא תפקיד חשוב בהתחדשות רקמות של מספר איברים כגון המעיים, העור והמערכת ההמטופויאטית. לפיכך, כאשר איתות Wnt אינו מוסדר, מתעוררות פתולוגיות קשות. סרטן המעי הגס, הכבד והעור, מחלות נוירולוגיות, כמו גם ממאירויות המטולוגיות מסוימות הן פתולוגיות מופתיות שבהן איתות Wnt לא מוסדר הוא הגורם הסיבתי או התורם1. לכן, מספר מעכבים למטרות Wnt שונות נבדקים כעת בניסויים קליניים כטיפולי סרטן הקשורים ל-Wnt2.

בנוסף, התקדמות מעניינת מתרחשת בפוטנציאל הטיפולי של Wnt להתאוששות נוירולוגית, הפרעות נוירולוגיות הקשורות לגיל והפרעות מולדות על הספקטרום האוטיסטי 3,4,5. אותות Wnt נחקרו להרחבה ex vivo של תאי גזע להשתלה לאחר מכן6. עם זאת, מיקוד טיפולי של איתות Wnt קנוני הוא מאמץ קשה בשל חשיבותו בתפקודי תאים בסיסיים רבים ודיבור צולב עם מסלולים אחרים 7,8,9, וכתוצאה מכך הצורך למדוד במדויק את ההשפעות של חומרים טיפוליים אלה של Wnt במודל קל לפרשנות. איתות Wnt קנוני מונע על ידי ליגנדים Wnt מסיסים קצרי טווח, המופרשים על ידי תאים שכנים או כהפרשה אוטוקרינית כפי שדווח בסוגים שונים של תאי גזע המגיבים ל-Wnt.

קולטני Wnt Frizzled וחלבון הקשור לקולטן ליפופרוטאין (LRP) מגיבים לליגנדים אלה, מה שמפעיל מפל איתות תוך תאי. כאשר איתות Wnt כבוי, קומפלקס הרס המורכב ממעכב ציר (Axin), תוצר גן מדכא גידול, אדנומטוס פוליפוזיס קולי (APC), קזאין קינאז 1 (CK1α) וגליקוגן סינתאז קינאז (GSK-3β), מונע הצטברות של β-catenin (CTNNB1) על ידי פירוק פרוטאזומלי. עם קשירת קולטן ליגנד Wnt, קומפלקס ההרס מושבת, מה שמוביל להצטברות וייצוב של β-catenin בציטופלזמה. ה-β-catenin הפעיל יכול לנדוד לגרעין, שם הוא נקשר לגורמי השעתוק של גורם השעתוק/גורם הקישור למשפר הלימפה (TCF/LEF) כדי ליזום את השעתוק של גני המטרה של Wnt. Axin2 נחשב לגן מטרה מכיוון שהוא מטרה ישירה של מסלול Wnt10. בנוסף, Axin2 משמש כמווסת שלילי כמו גם כגן מדווח לאיתות Wnt קנוני פעיל11,12.

מספר מדווחי איתות Wnt קנוניים תוארו בספרות והיו שימושיים מאוד בהבנת תפקידו של איתות Wnt בהתפתחות העוברית. רוב המדווחים הללו עושים שימוש באתרי קשירה TCF/LEF שהוכנסו באופן סינתטי, שאינם משתמשים בגן מטרה אנדוגני 13,14,15,16,17,18,19. בנוסף, נעשה שימוש באסטרטגיות דפיקה של Axin2 המכבדות את המיקום הטבעי של הגן 11,20,21,22,23, מתוכם Axin2-LacZ מקובל בדרך כלל כמדווח Wnt הקנוני החזק ביותר 11. עם זאת, החלבון המדווח LacZ, אם כי קל לשימוש ברוב הרקמות, דורש מצע β-גלקטוזידאז, המוכר כקשה לתאים חיים24. במיוחד עבור תאי גזע ותימוציטים, תנאי הזיהוי הקשים של LacZ מגבירים את המוות התאי (נתונים לא מדווחים משלו) בעת טיפול בתרחיפי תאים.

למרות שהגברת האות הנגרמת על ידי צביעת LacZ נוחה לזיהוי אותות נמוכים, היא הופכת את הכימות לפחות ישיר ולכן ניתן לטעון פחות אמין. לכן, מודל מדווח עכברים תוכנן לחקות את האסטרטגיה הגנטית של Axin2-LacZ , אך עם חלבון מדווח mTurquoise221, כדי לספק קריאה ישירה יותר וקרובה יותר לרמות הביטוי הפיזיולוגיות. החלבון הפלואורסצנטי mTurquoise2 הוא תחליף מצוין ל-LacZ בשל הבהירות הגבוהה שלו (תפוקה קוונטית (QY) = 0.93), גמישותו בשילוב עם חלבונים פלואורסצנטיים אחרים לאפיון נרחב של פני התא, והיעדר צורך במצע אקסוגני. יתר על כן, הקשר הגנטי ההדוק שלו לחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מציע את האפשרות להשתמש ברוב הנוגדנים הפלואורסצנטיים המזהים GFP לזיהוי אותות חזק יותר, במידת הצורך, בתאים רגישים מאוד ל-Wnt25.

מודל Axin2-mTurquoise2 הוא לא רק מדווח Wnt קנוני, אלא גם מציע אפשרות לחקור פנוטיפים הטרוזיגוטיים והומוזיגוטים של Axin2 (נוק-אאוט Axin2 ). ההחדרה הממוקדת של mTurquoise2 באתר ההתחלה של Axin2 גורמת לשיבוש חלבון Axin221. מכיוון ש-Axin2, הידוע גם בשם Conductin, הוא חלק ממכלול ההרס Wnt, ומתחם ההרס מווסת היטב את השעתוק בתיווך β-catenin, היעדרו החלקי או המוחלט יכול להיות מעניין לחקור פתולוגיות מגוונות. לדוגמה, בסרטן המעי הגס, רמות Axin2 גבוהות יחסית עקב היפראקטיביות Wnt11; עם זאת, תפקידו בפתולוגיות אחרות עדיין לא ידוע במידה רבה. למרות ש-Axin2 נחשב כממלא תפקיד מוגבל בפירוק של β-catenin, ניתן לשפר את תפקידו בוויסות Wnt על ידי הוספת פפטיד קטן, החוסם את צמיחת סרטן המעי הגס בתיווך Wnt26.

בסך הכל, ויסות Wnt זהיר באמצעות יעדים טיפוליים של Wnt יכול לפתוח הזדמנויות לשנות את הופעתן או התפתחותן של פתולוגיות חמורות ויש לחקור אותן עוד יותר במודלים עם יכולת דיווח. בדוח זה, אנו מסבירים את שיטת הניתוח המומלצת שלנו של מודל העכברים Axin2-mTurquoise2 לזרימה ציטומטרית והדמיה קונפוקלית. בהקשר של רמות מינון Wnt, קשה לזהות רמות איתות Wnt קנוניות נמוכות מאוד, שעבורן יכולות זיהוי וניתוח מתקדמות מספקות יתרון כדי להפיק את מלוא היתרונות של מודל זה. תימוציטים משמשים כמערכת מודל בשל כדאיות התאים השבריריים שלהם, ביטוי איתות Wnt קנוני נמוך ואזור הציטופלזמה המעובה כדי לייצג את רגישות הזיהוי של מודל Axin2-mTurquoise2. בנוסף, מוסבר הליך צביעה היסטולוגי כולל של β-catenin עבור תרחיפי תאי תימוציטים כדי למדוד רמות β-catenin ציטופלזמיות ולאמת איתות Wnt קנוני פעיל גרעיני בשילוב עם המדווח.

Protocol

הערה: כל הליכי העכברים בוצעו באישור הוועדה האתית של המרכז הרפואי של אוניברסיטת ליידן (LUMC) לניסויים בבעלי חיים. זכר ונקבה, בני 6-12 שבועות, מסוג בר (wt), שאין להם החדרה של מבנה המדווח Axin2-mTurquoise2, הטרוזיגוט (Tg/0) עם החדרה אחת של מבנה המדווח Axin2-murquoise2 וכך, גן Axin2 משובש אחד, והומוזיגוטי (Tg/Tg) עם החדרת מבנה המדווח Axin2-mTurquoise2 בשני האללים וכך, שני גנים משובשים של Axin2 ; Axin2-mטורקיז2 עכברים (B6; CBA-Axin2em1Fstl/J עכברים) שימשו בניסויים. בעלי החיים הוקרבו על ידי המתת חסדCO2 לפני בידוד האיברים. לאורך כל ההליך, צמצם את חשיפת הדגימות לאור, ושמור על קרח או 4 מעלות צלזיוס בכל עת, אלא אם כן צוין אחרת. מכסים את הדגימות בנייר אלומיניום. יש לבצע את כל השלבים במעבדה סטנדרטית עם ארון בטיחות ביולוגית.

1. הכנת תרחיף תאי תימוציט

  1. קצרו את בלוטת התימוס מעכברים בזהירות ללא זיהום דם על ידי חיתוך הבטן של העכברים וחילוץ התימוס בעזרת מלקחיים. אחסון/הובלה זמנית במדיום Dulbecco's Modified (IMDM) של Iscove המכיל 2.5% סרום עגל עוברי (FCS).
    הערה: כדי למנוע שפיכת דם ונזק אפשרי לתימוס, אין להקריב את העכברים על ידי פריקת צוואר הרחם.
  2. הכן צינור של 50 מ"ל עם מסננת תאים של 70 מיקרומטר, והרטיב את המסנן עם 1 מ"ל של IMDM קר/2.5% מדיום FCS.
  3. מועכים את האיבר עם הקצה האחורי של בוכנת מזרק של 1 מ"ל תוך כדי שטיפה פעמיים עם IMDM קר/2.5% מדיום FCS (איור 1A). אם תרצה, הוסף ריכוז סופי של 50 U/mL של DNAse I למדיום IMDM/2.5% FCS כדי למנוע גוש תאים מתים. שטפו את המסנן פעמיים עם IMDM קר/2.5% מדיום FCS, והשעו בעדינות בצינור של 50 מ"ל.
    הערה: אין לחרוג מנפח קצה כולל של 10 מ"ל. שמור תאים על קרח ובחושך לשלבים הבאים וכאשר לא מטפלים.
  4. צנטריפוגה ב-330 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, ושואב בעדינות את הסופרנטנט מכדור התא. השעו מחדש את גלולת התא בעדינות במדיום IMDM / 2.5% FCS קר ולא שלם, והתכוננו לספירת תאים.
    הערה: במידת הצורך, הקפיאו ואחסנו את התימוציטים בחנקן נוזלי ב-FCS-10% דימתיל-סולפוקסיד לניסויים מאוחרים יותר. הקפאה והפשרה נכונה של תאים יפחיתו מוות מוגזם של תאים. בממוצע, מחצית מהתימוציטים יכולים להיות אפופטוטיים לאחר ההפשרה עקב הברירה הטבעית של תאי T בתימוס, שיש לקחת בחשבון כאשר מחליטים כמה תימוציטים להקפיא לכל בקבוקון קריו. יש להקפיא לא פחות מ -2.5 × 106 תימוציטים לכל בקבוקון.

2. הכנת ציטומטריית זרימת תימוציטים

  1. הכן תימוציטים להליך צביעת פני התא על ידי הכנת 2.5 ×10 6 תימוציטים לדגימת צביעה בתמיסת מלח עם פוספט קר כקרח (PBS, pH 7.4) (איור 1B). ספר מחדש את מספר התאים החיים לאחר ההפשרה, אם תימוציטים הוקפאו בעבר. במידת הצורך, הוסף ריכוז סופי של 50 U/mL של DNAse I כדי למנוע גוש תאים מתים.
  2. השתמש בלוחות צביעת הנוגדנים לאפיון פני התא של תת-קבוצה שלמה של תימוציטים.
    הערה: ניתן לבחור שילובים אחרים של פלואורוכרום. בחר סמני אוכלוסייה נדירים עבור פלואורוכרומים פלואורסצנטיים בהירים ואם אפשר, הוסף סמן חי-מת. אין להשתמש בפלואורוכרום V450 או V500 בשילוב עם מדווח הפלואורסצנטי mTurquoise2 עקב חפיפה ספקטרלית. בדוק תמיד את ספקטרום הקרינה של mTurquoise2 בשילוב עם פלואורוכרומים כחולים וירוקים (איור משלים 1A).
    1. מערבבים את הנוגדנים ביחסים שהוגדרו בעבר של לוחות השושלת השליליים (Lin-) בנפרד במאגר PBS/0.2% אלבומין בסרום בקר (BSA)/0.1% NaN3 (נתרן אזיד).
      הערה: כל התאים הלא רצויים (שאינם תימוציטים הקיימים בתימוס) נצבעים בתהליך דו-שלבי בנוגדנים משניים של סטרפטווידין (בדוגמה זו, פיקואריתרין (Pe)-Cy7 ואלופיקוציאנין (APC)-Cy7) וניתן לשלול אותם באמצעות "שער השלכה" בניתוח ציטומטריית הזרימה.
    2. ערבבו את הנוגדנים ביחסים שהוגדרו קודם לכן של לוח הצביעה הכפול השלילי (DN) עם הנוגדן המשני סטרפטווידין Pe-Cy7 במאגר PBS/0.2% BSA/0.1% NaN3 . אל תכלול את לוח ה-Lin מתערובת זו (טבלה 1).
    3. ערבבו את הנוגדנים ביחסים שהוגדרו קודם לכן של פאנל הצביעה הלא בוגר סינגל חיובי (ISP), דאבל חיובי (DP) וסינגל חיובי (SP) עם הנוגדן המשני סטרפטווידין APC-Cy7 במאגר PBS/0.2% BSA/0.1% NaN3 . אל תכלול את לוח ה-Lin מתערובת זו (טבלה 1).
    4. ראשית, צבעו את התימוציטים באוכלוסיות לא רצויות של תאים שאינם T על ידי שימוש בתערובות הנוגדנים הראשוניות של ביוטין של לוחות ה-Lin למשך 30 דקות על קרח בחושך.
      הערה: כל לוח Lin הוא קבוצה שונה של תאים ולכן אין לצבוע אותו יחד בדגימה אחת.
    5. יש לסובב בחום של 300 × גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולהוציא את הסופרנטנט. שטפו את התימוציטים עם 150 מיקרוליטר PBS קר כקרח/0.2% BSA/ 0.1% NaN3 buffer, וסובבו מטה ב-300 × גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    6. מכתים עם לוח ה-DN ולוח ה-ISP/DP/SP של ה-Lin- המתאים מכתים למשך 30 דקות על קרח בחושך. יש לסובב בטמפרטורה של 300 × גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולהוציא את הסופרנטנט. שטפו את התימוציטים עם 150 מיקרוליטר PBS קר כקרח/0.2% BSA/0.1% NaN3 buffer, וסובבו כלפי מטה ב-300 × גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  3. הכן את התאים למדידת זרימה ציטומטרית על ידי הומוגניזציה עם צינור מסננת תאים של 35 מיקרומטר והעלאת התאים במאגר PBS/0.2% BSA/0.1% NaN3 . הגן על התאים מפני אור, והשאר על קרח עד ובמהלך מדידת ציטומטר זרימה.
    הערה: NaN3 (נתרן אזיד) רעיל מאוד וקטלני. יש לנקוט בזהירות מיוחדת בעבודה עם חומר זה. יש לשטוף ידיים ביסודיות לאחר השימוש, ולהתקשר מיד למרכז למידע על הרעלות או לרופא/רופא במקרה של בליעת NaN3 .

3. מדידת ציטומטר זרימה

הערה: משתמשים חסרי ניסיון צריכים תחילה לעבור אימון ציטומטר זרימה שכן מדידת האות mTurquoise2 בשילוב עם מספר פלואורוכרומים אחרים דורשת ניסיון ותכנון בקיא של הניסוי. עיין בטבלת החומרים למידע על ציטומטר הזרימה.

  1. הפעל את ציטומטר הזרימה בהתאם למדריך למשתמש או לפרוטוקול קבוע אחר. בדוק, ובמידת הצורך כוונן את מסנן פס הפס בציטומטר הזרימה לאסטרטגיית זיהוי פלואורסצנטי אופטימלית.
    הערה: מסנן מומלץ עבור mTurquoise2 הוא 470/20 ננומטר בקו הלייזר האולטרה סגול 405 ננומטר, 407 ננומטר או קו הלייזר הפחות נפוץ של 440 ננומטר.
  2. כייל את ציטומטר הזרימה על ידי קביעת הגדרות פיצוי עם חרוזי פיצוי זמינים מסחרית ותאי 293T מבטאים mTurquoise2 ביציבות.
    הערה: ניתן להשתמש בתימוציטים מוכתמים יחידים במקום חרוזי פיצוי. במקרה זה, הפיצוי בחרוזים היה יעיל ונוח באותה מידה משימוש בתאים.
    1. סמן את החרוזים עם כל פלואורוכרום בודד ששימש בניסוי, וכלול חרוזים לא מוכתמים. מדוד את החרוזים כדי להקים לוח הגדרת פיצוי, ומדוד תאי 293T המבטאים mTurquoise2 מכיוון שאין פלואורוכרום תואם ל-mTurquoise2, שניתן להשתמש בו על החרוזים. שמור את הגדרות הפיצוי לשימוש בניסוי בפועל.
      הערה: התאים המבטאים mTurquoise2 המשמשים להגדרת הפיצוי חייבים להיות בהירים או בהירים יותר מהתימוציטים המבטאים mTurquoise2 של הניסוי בפועל. ודא שיש גם תאי 293T שליליים mTurquoise2.
    2. לצורך הניסוי, כלול תימוציטים מוכתמים ב-Tg/Tg פלואורסצנטי מינוס אחד (FMO), כולל דגימת wt עבור mTurquoise2 FMO ודגימה לא מוכתמת של תימוציטים מכל גנוטיפ של עכבר כבקרות חיוביות לחלק הניתוח.
      הערה: פקדים אלה חשובים להגדרה נכונה של השערים עבור תאים חיוביים. שאר דגימות הניסוי מוכתמות בלוח הצביעה השלם (טבלה 1).
      1. צור ניסוי, הוסף ותן שם למספר הצינורות בתוכנת ציטומטר הזרימה, וצור עלילות פיזור כדי לדמיין את התאים המוכתמים עבור הסט השלם של פלואורוכרומים.
      2. החל את הגדרות הפיצוי שנקבעו בעבר על הניסוי. כוונן את הפיזור קדימה (FSC) ואת הפיזור הצדדי (SSC) עם תימוציטים wt לא מוכתמים עד שאוכלוסיית התאים המלאה נראית בתרשים הפיזור. מדוד תחילה את התימוציטים הלא מוכתמים Tg/Tg mTurquoise2 כדי לוודא שהאוכלוסייה החיובית נראית לעין.
      3. מדוד דגימת תימוציט מוכתמת לחלוטין של Tg/Tg, ובדוק אם יש את כל שילובי הפלואורוכרום. במידת הצורך, התאם את ערכי הפיצוי שנקבעו בעבר עבור הפלואורוכרומים המציגים פיצוי שגוי. מדוד את שאר דגימות הניסוי, ואל תתאים הגדרות כלשהן במהלך מדידת הדגימות.
        הערה: ניתן לבצע התאמת פיצוי לאחר מכן גם בחבילת תוכנת הניתוח. למרות שמספר התאים הזמינים יכול להוות גורם מגביל, רצוי לבצע שלב זה במהלך המדידה. שמור על ההגדרות שוות בין כל הדגימות להשוואה של ערכי העוצמה mTurquoise2.

4. אנליזה ציטומטרית זרימה

הערה: ניתוח ציטומטרי זרימה בוצע באמצעות תוכנה ספציפית המוזכרת בטבלת החומרים; עם זאת, קיימות גם תוכניות אחרות לניתוח זרימה ציטומטרית.

  1. שער תאים חיים ותת-קבוצות תימוציטים לפי ערכי FSC ו-SSC.
  2. בדוק את הגדרות הפיצוי בתיבת הדו-שיח של מטריצת הפיצוי שנמצאת משמאל לדגימה כדי לוודא שאין הפרעות פלואורוכרום ושהתרחש פיצוי מתאים כדי למנוע זליגה או דימום.
    1. אם יש להתאים את המטריצה המוגדרת-רכישה, שנה את הערכים במטריצת הפיצוי על ידי הגדלה או הקטנה של ערך הפיצוי של כל שילוב פלואורוכרום כך שהאוכלוסייה לא תראה קו אופקי או אנכי כמעט מושלם (איור משלים 1B).
  3. כדי לפזר חזותית את עוצמת mTurquoise2 עבור שער חיובי תקין, שנה את תצוגת ציר ה-X mTurquoise2 לליניארית (איור משלים 2).
    1. השתמש בבקרת mTurquoise2 FMO כבקרה שלילית עבור שער אות חיובי mTurquoise2. תקן את שער הסף הנכון לכל אוכלוסיית תאים (איור 2).
      הערה: לתאי הבקרה mTurquoise2 FMO (wt) אין את סמן mTurquoise2 ולכן ניתן להשתמש בהם כסף רקע לפעילות מדווח Axin2.
  4. תאים חיוביים ל-Gate mTurquoise2 עם ערוץ הזיהוי המתאים כדי להגדיר כמה תאים חיוביים ל-Wnt.
  5. חשב את הממוצע והחציון הגיאומטרי כדי להגדיר את כמות עוצמת הפלואורסצנט בתאים המעניינים.
    1. לחץ על סטטיסטיקה | הוסף סטטיסטיקה בתוך הפאנל המציג תאים חיוביים ל- mTurquoise2.
    2. הגדירו את השיטה הסטטיסטית, את אוכלוסיית העניין ואת ערוץ הזיהוי של mTurquoise2, ולחצו על הוסף. ייצג את הממוצע הגיאומטרי ואת עוצמת הפלואורסצנט החציונית ביחידות שרירותיות (AU) כדי לשרטט גרפים.
      הערה: החציון מייצג את הערך האמצעי של עוצמת הפלואורסצנט ומכאן מספק מידע על שינוי אוכלוסיית עוצמת הפלואורסצנט. במידת הצורך, תיקון רקע יכול לעזור להשיג הדמיה ברורה יותר של הטווח הדינמי של פעילות המדווח mTurquoise2. ניתן לעשות זאת על ידי הפחתת תדירות צביעת הרקע של wt מהתדר הכולל של תאים חיוביים mTurquoise2 מסוג התא הספציפי המגודר.

5. הכנת ציטוספינים של תימוציטים להדמיה קונפוקלית

הערה: ציטוספינים של תימוציטים מומלצים בעבודה עם תרחיפי תאים של תאים שאינם נדבקים. מכיוון שהביטוי של Axin2-mTurquoise2 בתימוציטים נמוך יותר מאשר בתאי האפיתל של התימוס, נעשה שימוש בתרחיפי תאי תימוציט מסוננים להדמיה.

  1. התחל עם תרחיף תאים של תימוציטים טריים או קפואים. השעו ~20,000 תימוציטים ב-100 מיקרוליטר של PBS קר/0.5% BSA/10% FCS לכל גנוטיפ תימוציט.
    הערה: במידת הצורך, הפשירו את התאים בעדינות כדי לשמור על כדאיות תאים מקסימלית בעת עבודה עם תימוציטים שהוקפאו בעבר. זה יסייע בפחות אוטופלואורסצנטיות בעת הדמיית התאים. בדוק את כדאיות התא כדי להבטיח את איכות הדגימה. הליך הציטוספין מפעיל כוח מכני שהותאם לתימוציט השביר; עם זאת, זה דורש אוכלוסייה התחלתית בת קיימא מאוד. כדי להבטיח כדאיות גבוהה יותר, רצוי להתחיל עם תימוציטים טריים שנקטפו במקום קפואים.
  2. הרטיבו מראש את האזור סביב פתיחת כרטיסי הסינון בעזרת PBS. הרכיבו את מחזיק תא הדגימה של הציטוספין לפי המדריך (איור 1C).
    1. הנח את כרטיס המסנן על מגלשת הכפור (הצד החלק כנגד מגלשת הזכוכית). הנח את שני הפריטים על מחזיק תא הדגימה. הקפד להניח את כרטיס המסנן בדיוק על חור מחזיק תא הדגימה, והנח את מחזיק תא הדגימה השלם ברוטור.
  3. השעו בזהירות את התימוציטים, והוסיפו 100 מיקרוליטר של תרחיף התאים בתאי הדגימה. סובב את מתלה התימוציט למשך 4 דקות בטמפרטורה של ~350 × גרם על מגלשות הכפור. הסר את כרטיס המסנן בזהירות ממגלשת הכפור מבלי לגעת בתאים. יבש את הציטוספינים באוויר לתקופה שנעה בין שעה עד לילה בטמפרטורת החדר.
    הערה: בעת עבודה עם סוגי תאים אחרים, בדוק צפיפויות תאים שונות לקבלת תוצאות מיטביות. ניתן להקפיא ציטוספינים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס בקופסה אטומה לניסויים מאוחרים יותר. הפשירו את הציטוספינים להמשך טיפול למשך שעה בטמפרטורת החדר.

6. צביעה חיסונית של ציטוספינים עם סה"כ β-קטנין

  1. תקן את הציטוספינים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ב 100% מתנול. יבש את המגלשות באוויר למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. צייר עיגול סביב אוכלוסיית התימוציטים על מגלשת הזכוכית בעזרת עט הידרופובי.
    הערה: שלב קיבוע זה מותאם במיוחד לצביעה β-קטנין.
  2. הנח את השקופיות ב-PBS/0.05% Tween-20 למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן, העביר אותן לקופסה לחה וחשוכה במהלך שלבי החסימה והדגירה. הוסף 100 מיקרוליטר של PBS/10% סרום עכבר רגיל (NMS) לכל שקופית, והשאיר בקופסה הלחה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הקש על השקופית כדי להסיר את 10% NMS, הוסף 100 מיקרוליטר של PBS/10% סרום עיזים רגיל (NGS) לכל שקופית, והשאיר בקופסה הלחה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: דגירה עם PBS/10% NMS חוסמת קשירת נוגדנים ראשוניים לא ספציפיים (איור 1D), בעוד PBS/10% NGS חוסם קשירת נוגדנים משניים לא ספציפיים.
  3. הכן נוגדנים נוספים לצביעה סלולרית. מערבבים 0.5 מיקרוגרם מסך הנוגדן β-catenin עם השברים המסומנים ב-AF568.
    הערה: בהגדרה זו, נעשה שימוש בערכת תיוג זמינה מסחרית לתיוג מראש של ה-β-catenin הראשוני נגד עכבר עם שברי IgG1 Fab משניים נגד עכבר עם תווית פלואורוכרום Alexa Fluor 568 (AF568) לפני הוספתו לתימוציטים. בצע את התיוג בהתאם לפרוטוקול היצרן מכיוון שייתכן שיהיה צורך לבדוק מספר ריכוזים. השתמש בנוגדנים הכוללים β-catenin-AF568 תוך 30 דקות.
  4. הוסף 50 מיקרוליטר (0.5 מיקרוגרם) מסך הנוגדן המסומן ב-β-catenin-AF568 לכל שקופית ציטוספין למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס בקופסה לחה. כלול בקרת צביעה שלילית בהתאם לפרוטוקול היצרן או בקרת איזוטיפ במקרה של פרוטוקול תיוג ישיר.
  5. יש לכבס במשך 20 דקות עם PBS/0.05% Tween-20 בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש לשטוף במשך 20 דקות עם PBS בטמפרטורת החדר בצנצנת תוך ערבוב. בצע שלב קיבוע שני כדי להבטיח את קשירת הנוגדן לאנטיגן: 10 דקות בטמפרטורת החדר עם 100 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-PBS בקופסה לחה.
    הערה: שמור את השקופיות בחושך. לא מתנול ולא קיבוע PFA ישפיעו באופן משמעותי על ביטוי mTurquoise227.
  6. טבלו את השקופיות ב-PBS. בצע צביעה גרעינית עם 50 מיקרוליטר של TO-PRO-3 (1:1500) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בקופסה הלחה. שוטפים את השקופיות למשך 20 דקות עם PBS בטמפרטורת החדר בצנצנת תוך ערבוב.
    הערה: ניתן לטטר את ריכוז TO-PRO3 בהתאם לשימוש בפלואורוכרומים אחרים עם ספקטרום פלואורסצנטי סמוך.
  7. הטמיעו את הדגימות עם מגיב נגד דהייה בהתאם לפרוטוקול היצרן, וכסו בכיסוי. יש לייבש באוויר במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר. צפה בשקופיות ישירות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי או קונפוקלי, או אחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס להדמיה מאוחרת יותר.

7. מדידה מיקרוסקופית קונפוקלית

הערה: עיין בטבלת החומרים למידע על המיקרוסקופ הקונפוקלי.

  1. הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקלי בהתאם לפרוטוקול הידני או שנקבע. השתמש בבקרות קו תאים mTurquoise2 293T שליליות וחיוביות להתאמה ראשונית של ההגדרות הקונפוקליות. לאחר מכן, השתמש בתימוציטים wt Axin2-mTurquoise2 ו-Tg/Tg (נוק-אאוט) Axin2-mTurquoise2 כבקרות שליליות וחיוביות, בהתאמה, כדי להבטיח שאין תת-חשיפה של האות mTurquoise2.
  2. הכן את התוכנה לסריקה רציפה על ידי תכנות הלייזרים ורוחב המסננים. התחל תחילה עם קו הלייזר באורך הגל הגבוה ביותר, ועבוד לכיוון אורך הגל הנמוך ביותר. כאשר כל שלבי הסריקה הרציפים מותקנים, טען את הדגימה על המיקרוסקופtagה, מקד את הדגימה ולחץ בשידור חי כדי לייעל את עוצמת הלייזר ואת הרווח החכם באמצעות הכפתורים המתאימים בתוכנה הקונפוקלית או בפאנל הידני האופציונלי.
    הערה: אין לצלם את קטע הדגימה של השקופית לצורך כימות האות מכיוון שפוטנציאל להלבנת אור עלול להתרחש. עם זאת, ל-mTurquoise2 יש יציבות פוטו-יציבות גבוהה25.
  3. במקרה של ביטוי mTurquoise2 נמוך מאוד, הגדל את עוצמת הלייזר ואת הרווח החכם עד שנצפה אות פלואורסצנטי, ובדוק עם דגימת הבקרה השלילית כדי להבטיח אות חיובי אמיתי. דמיין את התימוציטים עם עדשת שמן 40x 1.4, עדשת שמן 63x 1.4 או עדשת שמן 100x 1.4.
    הערה: מיקרוסקופ Leica SP5 שימש למחקר זה.
  4. השתמש בהגדרות הדמיה קונפוקליות אלה במיקרוסקופ לפני מדידת הדגימה.
    1. התאם את טווח ערכי העוצמה לתמונה של 12 סיביות על ידי לחיצה על תצורה | הגדרות | שנה ל-12 סיביות באפשרות עומק סיביות כדי ליצור סולם רחב יותר של עוצמה ובכך להבחין יותר בין אותות פלואורסצנטיים נמוכים וגבוהים.
    2. התאם את רזולוציית ההדמיה על ידי לחיצה על XY, והגדל את הפורמט ל-1024 x 1024, מה שגם יכפיל את זמן הסריקה. התאם את מהירות הסריקה ל-400-600 הרץ על ידי לחיצה על מהירות | עוד כדי לשנות את ההגדרות באופן ידני. בנוסף, הפעל את אפשרות הסריקה הדו-כיוונית.
    3. כוונן את מחוון הרגישות כדי להפחית את אות הרקע. מטב את עוצמת הלייזר הנכונה ואת הרווח החכם עם האפשרות Quick LUT (טבלת חיפוש).
      הערה: בתמונה של 12 סיביות, המחוון כולל ערך עוצמה בגווני אפור מ-0 עד 4095. ניתן לעשות זאת גם לאחר מכן עם תוכנת Las X החינמית הלא מקוונת. הצבע הירוק יציג את הרקע השחור, והצבע הכחול יציג פיקסלים רוויים של הדגימה.
  5. כאשר כל הגדרות ההדמיה מותאמות, מדוד את הדגימה על ידי לחיצה על התחל, מה שיפעיל את ההדמיה הרציפה של כל שלושת הערוצים.
    1. מדוד את האות הפלואורסצנטי הגרעיני TO-PRO-3. זיהוי TO-PRO-3 עם לייזר 633 ננומטר ו-HyD 640-750 ננומטר.
      הערה: בהגדרה זו, נעשה שימוש בכוח לייזר של 6% ברווח חכם של 15%. הגדרה זו יכולה להשתנות בהתאם לעוצמת הצביעה של TO-PRO-3. אם הוא בהיר מאוד, הוא יכול להשפיע על פלואורוכרומים בעוצמה נמוכה יותר כאשר הוא נרגש יתר על המידה. במקרה כזה, הפחיתו את ריכוז הצביעה.
    2. מדוד את האותות הפלואורסצנטיים הגרעיניים והציטופלזמיים של β-catenin. זיהוי β-catenin עם לייזר 561 ננומטר ו-HyD 580-605 ננומטר. צבור עד 2 סריקות לתמונה אחת על ידי התאמת ההגדרה בתיבת XY בתוכנה עם ממוצע קו 2 במקרה של אות AF568 נמוך.
      הערה: בהגדרה זו, נעשה שימוש ב-85% כוח לייזר ברווח חכם של 87%.
    3. מדוד את האות הפלואורסצנטי הציטופלזמי mTurquoise2. זהה mTurquoise2 עם לייזר 458 ננומטר ו-HyD 490-600 ננומטר. צבור עד 4 סריקות לתמונה אחת על ידי התאמת ההגדרה בתיבת XY בתוכנה עם ממוצע קו 4 במקרה של אות mTurquoise2 נמוך.
      הערה: בשל לייזרים ישנים במיקרוסקופ הקונפוקלי המשמש לפרוטוקול זה ואות mTurquoise2 הנמוך, נעשה שימוש ב-405 ננומטר ב-90% עוצמת לייזר, יחד עם לייזרים של 458 ננומטר ו-476 ננומטר ב-100% עוצמת לייזר עם HyD 490-550 ננומטר ברווח חכם של 100%. לייזר 440 ננומטר הוא האופטימלי ביותר, אם כי פחות נפוץ במיקרוסקופ קונפוקלי. יש לטפל בעוצמת לייזר גבוהה בזהירות ולבצע אותה רק עם הדמיה עוקבת. ודא שהגדרות החירום קיימות כדי למנוע חשיפת יתר של הגלאי. עוצמת הלייזר במיקרוסקופים קונפוקליים אחרים עשויה להיות נחותה מאלה המוצעים בפרוטוקול זה בשל לייזרים חזקים יותר או חדשים יותר. ניתן לבצע בדיקת הלבנה כדי להבטיח שלא יאבד אות פלורסנט לפני ההדמיה. בהגדרה המוצעת, ההלבנה של mTurquoise2 הייתה מקובלת.
    4. בצע הדמיית שדה בהיר להדמיה מלאה של התאים. זהה תימוציטים באמצעות לייזר 488 ננומטר ו-PMT Scan-DIC. ייצא את קבצי ה-Lif לניתוח תמונה.
      הערה: בהגדרה זו, נעשה שימוש בהספק לייזר של 59% עם רווח של 212 וולט והיסט נתונים של -4.3%. ניתן לקרוא קבצי Lif בתוכנת LAS x הלא מקוונת לתיקון תמונה.

8. ניתוח מיקרוסקופיה קונפוקלית

  1. נתח את התמונות באמצעות תוכנת עיבוד תמונה28 (איור משלים 3). טען את התמונות בתוכנה.
    הערה: פורמטים מרובים מתקבלים, אך מומלץ להשתמש בקובצי TIFF עם LUT או ייבוא ישיר של קובצי Lif לתוכנת עיבוד התמונה.
  2. מדוד את אות ה-β-catenin הפעיל בגרעיני התימוציט.
    1. בחר את הגרעינים של התימוציטים המוכתמים ב-TO-PRO-3 בתמונת הערך האפור האדום לניתוח β-catenin פעיל. עשה זאת באופן ידני, או השתמש בבחירת תאים אוטומטית בתוכנה.
      הערה: בחירת תאים אוטומטית עשויה להזדקק לעיבוד תמונה לצורך סף וניתוח חלקיקים נאותים. בחירת תאים ידנית יכולה להיות מייגעת, אך בדרך כלל אינה דורשת עיבוד תמונה כלשהו ומומלצת בפרוטוקול זה.
    2. הפעל בחירה ידנית עם כל אחד מכלי הבחירה בסרגל העבודה.
      1. בחר את קווי המתאר של הגרעין והוסף אותו למנהל אזור העניין (ROI). הפעל את מנהל ההחזר על ההשקעה על ידי לחיצה על ניתוח | כלים | מנהל החזר ROI, וכאשר נפתח חלון חדש של מנהל החזר ROI, לחץ על האפשרות הראשונה הוסף (t), או השתמש בקיצור המקשים t. חזור על השלב הקודם עד שכל הגרעינים יוגדרו ויתווספו למנהל ה-ROI. השתמש באפשרות הצג הכל במנהל ההחזר על ההשקעה כדי להציג באופן חזותי את התאים שנבחרו.
    3. בחר >3 אזורי רקע שבהם אין תאים והוסף אותם למנהל ההחזר על ההשקעה.
      הערה: גודל וצורה אינם חשובים במקרה זה. אזורים אלה ישמשו כמדידות רעשי רקע לחישוב הסופי.
      1. הגדר את המדידה בתמונה על ידי לחיצה על ניתוח | הגדר מידות. בחלון החדש שנפתח עם אפשרויות מדידה שונות, הפעל שטח, צפיפות משולבת וערך אפור ממוצע | לחץ על אישור.
      2. הפעל את תמונת הערך האפור של β-catenin על ידי לחיצה עליה, והמחיש את הגרעינים ואזורי הרקע שנבחרו על ידי לחיצה על הצג הכל במנהל ההחזר על ההשקעה. שימו לב לכל האזורים שנבחרו הגלויים כעת בתמונת β-catenin.
      3. לחץ על מדידה במנהל החזר ההשקעה או לחץ על ניתוח | למדוד. שימו לב לחלון התוצאות החדש שנפתח, המציג את התוצאות של אות β-catenin בתוך ההחזר על ההשקעה.
      4. העבר את התוצאות לתוכנת חישוב גיליון אלקטרוני על ידי לחיצה על ערוך | בחר הכל; והעתק/הדבק את הרשימה בגיליון האלקטרוני לצורך חישוב נוסף. שמור את מנהל ההחזר על ההשקעה לעיון עתידי מבלי שתצטרך לחזור על בחירת הגרעינים על ידי לחיצה על עוד | שמר....
    4. לבחירת תאים אוטומטית, הפוך כפילויות (מקלדת Ctrl D) של התמונה לעיבוד מכיוון שלא ניתן לבטל הגדרות עיבוד תמונה רבות.
      הערה: תיוג גרעיני אוטומטי דורש עיבוד תמונה, ברוב המקרים, כדי להגדיר את הגרעינים באופן אוטומטי ומדויק. עיבוד תמונה צריך להיעשות רק למטרות בחירת אזור. תמונות מעובדות אינן שימושיות למדידת עוצמת פלואורסצנט מכיוון שערכי הפיקסלים משתנים.
      1. בצע מסנן גאוס על ידי לחיצה על תהליך | מסננים | טשטוש גאוס כדי להחליק את התמונה. בדוק ערכי סיגמא (רדיוס) מרובים, והפעל את האפשרות תצוגה מקדימה כדי להמחיש את האפקט לפני לחיצה על אישור.
      2. הפוך את התמונה על ידי לחיצה על ערוך | הפוך. בדוק את הבהירות והניגודיות על ידי לחיצה על תמונה | התאם | בהירות/ניגודיות. השתמש באפשרות אוטומטי או עדיף לשנות ידנית את הערכים.
        הערה: אל תחיל את השינויים מכיוון שהדבר ישנה את מאפייני התמונה. כל שעליך לעשות הוא לסגור את חלון ה-B&C כאשר התמונה הרצויה מתקבלת.
      3. צור סף על ידי לחיצה על תמונה | התאם | סף, והגדר את הגדרות הסף הטובות ביותר שבהן כל התאים גלויים ברובם. לחץ על החל כדי להחיל את הגדרות הסף.
        הערה: אם לא הוחל סף על התאים, המציגים חורים, לחץ על תהליך | בינארי | מלא חורים כדי למלא את החסר בתוך התאים. אם התאים מתמזגים יחד עם הגדרות הסף, לחץ על תהליך | בינארי | קו פרשת מים כדי להפריד בין תאים אלה. קו דק של פיקסל אחד יפריד בין כל תא שהתוכנית מפרשת כמאוחד.
      4. הגדירו את הגרעין הקטן והגדול ביותר בתמונה על ידי בחירה ידנית של גרעין לבחירה באמצעות כלי הבחירה Freehand , הוסיפו אותו למנהל ההחזר על ההשקעה ומדדו את השטח.
      5. ניתוח החלקיקים (גרעינים) על ידי לחיצה על ניתוח | נתח חלקיקים, והוסף את השטח הקטן ביותר ואת השטח הגדול ביותר בתיבה גודל (^2) עם מקף (-) ביניהם. הפעל את התיבות הצג תוצאות, הוסף למנהל ואל תכלול בקצוות לפני לחיצה על אישור. המשך לשלב 8.2.3 כדי להשלים את הפרוטוקול.
  3. מדוד את האותות הציטופלזמיים mTurquoise2 ו-β-catenin בתימוציטים.
    1. בחר את קווי המתאר של תימוציטים שלמים בתמונת השדה הבהיר לפי אותם שלבים לעיל.
    2. בחר >3 אזורי רקע שבהם אין תאים והוסף אותם למנהל ההחזר על ההשקעה.
      הערה: גודל וצורה אינם חיוניים במקרה זה. אזורים אלה ישמשו כמדידות רעשי רקע לחישוב הסופי.
      1. הפעל את תמונת הערך האפור mTurquoise2 על ידי לחיצה עליה, והצג באופן חזותי את סך החזר ה-ROI של התאים ואזורי הרקע שנבחרו על ידי לחיצה על הצג הכל במנהל ההחזר על ההשקעה. שימו לב לכל האזורים שנבחרו המוצגים בתמונת mTurquoise2.
      2. לחצו על מדידה במנהל ההחזר על ההשקעה, או על ניתוח | למדוד. שימו לב לחלון התוצאות החדש שנפתח עם תוצאות המדידה של אות mTurquoise2.
      3. העבר את התוצאות לתוכנת חישוב גיליון אלקטרוני על ידי לחיצה על ערוך | בחר הכל והעתק/הדבק את הרשימה בגיליון האלקטרוני לצורך חישוב נוסף.
      4. הפעל את תמונת הערך האפור של β-catenin על ידי לחיצה עליה, ודמיין את סך החזר ה-ROI של התאים ואזורי הרקע שנבחרו על ידי לחיצה על הצג הכל במנהל ההחזר על ההשקעה. שימו לב לכל האזורים שנבחרו הגלויים בתמונת β-catenin.
      5. לחצו על מדידה במנהל ההחזר על ההשקעה, או על ניתוח | למדוד. שימו לב לחלון התוצאות החדש שנפתח עם תוצאות המדידה של האות הסלולרי הכולל β-catenin.
      6. העבר את התוצאות לתוכנת חישוב גיליון אלקטרוני על ידי לחיצה על ערוך | בחר הכל והעתק/הדבק את הרשימה בגיליון האלקטרוני לצורך חישוב נוסף. שמור את מנהל ההחזר על ההשקעה לעיון עתידי מבלי שתצטרך לחזור על בחירת התא על ידי לחיצה על עוד | שמר....
  4. חשב את הקרינה הגרעינית הכוללת המתוקנת (CTNF) עבור β-catenin פעיל באמצעות משוואה 1.
    CTNF = צפיפות משולבת - (שטח × ממוצע שטחי רקע ממוצעים) (1)
  5. חשב את הקרינה הכוללת המתוקנת של התאים (CTCF) עבור mTurquoise2 באמצעות משוואה 2.
    CTCF = צפיפות משולבת - (שטח × ממוצע שטחי רקע ממוצעים) (2)
  6. הבדיל בין β-קטנין גרעיני פעיל לבין β-קטנין ציטופלזמי על ידי הפחתת ערכי β-קטנין גרעיניים שהתקבלו בשלב 8.2.3.3. מסך ערכי β-catenin שהתקבלו בשלב 8.3.2.5 כדי להשיג את β-catenin הלא פעיל הציטופלזמי.
    הערה: ודא שהמדידות נעשות באותו תא.
    1. חשב את ממוצע העוצמה הממוצעת של אזורי הרקע. חשב CTNF ו-CTCF באמצעות משוואות 1 ו-2. התייחס ל - IntDen (סכום כל הפיקסלים באזור שנבחר) כצפיפות המשולבת ולא ל- RawIntDen.
    2. במידת הצורך, חשב את סטיית התקן של ערכי IntDen להתוויית גרפים. שקול עד 200 תאים נפרדים לניתוח סטטיסטי באמצעות מבחן Mann-Whitney U.
  7. התווה את התוצאות בגרף נקודת נתונים בודד וסמן את ציר ה- y בערכי CTNF או CTCF כיחידות פלואורסצנטיות יחסיות (RFU).

תוצאות

כדי לחקור את תפקידו של איתות Wnt קנוני, נבדק מודל מדווח Wnt קנוני Axin2-mTurquoise2 בשילוב עם ביטוי חלבון β-catenin. ידוע כי תימוציטים שבירים, מראים איתות Wnt קנוני נמוך במספר שלבים בתהליך התבגרות התימוציטים, ויש להם יחס ציטופלזמי לגרעין נמוך; כל הגורמים הללו מעכבים את הזיהוי של mTurquoise2 או ...

Discussion

מספר מדווחים קנוניים של Wnt זמינים עם רגישות מדווח שונה וחלבוני מדווח בפועל. מודלים מדווחים המשתמשים באתרי קשירה מרובי TCF/LEF שהוכנסו באופן סינתטי זמינים עם חלבוני מדווח פלואורסצנטיים; עם זאת, חזרות כאלה של טרנסגנים עלולות ללכת לאיבוד במהלך רבייה או ניסויים ארוכים in vivo

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק מאוניברסיטת ליידן לתחום הפרופיל רפואה רגנרטיבית לפיתוח מודלים חדשים של עכברים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BD FACScantoII flow cytometerBD Biosciencesnot aplicableSerial number V96300710. The flow cytometer setup in this protocol contains a 405 nm laser line with 505 longpass filter and 530/30 nm bandpass filter, and 470/20 nm bandpass filter; a 488 nm laser with 735 nm longpass filter and 780/60 nm bandpass filter, 670 nm longpass filter and 655 nm longpass filter, 610 nm longpass filter, 550 nm longpass filter and 575/26 nm bandpass filter, 505 nm longpass filter and 530/30 nm bandpass filter, and 488/10 nm bandpass filter; and a 633 nm laser line with 735 nm longpass filter and 780/60 nm bandpass filter, 685 nm longpass filter, and 660/20 nm bandpass filter.
BSA Sigma A9647
Corning 70 μm cell strainer Falcon/Corning 352350
Cytospin 4 Type A78300101Thermo Scientificnot aplicable 
DMSOSigma Aldrich D5879-1L
DNAse ISigma A9647
Falcon 50 mL Conical Centrifuge tubesGreiner bio-one227261
Falcon round-bottom Polystyrene Test tubes with cell strainer snap capFisher Scientific 352235
Fetal Calf Serum (FCS)Greiner Bio-One B.V. not aplicable Depends on origin
Fiji software ImageJnot aplicable Version 1.53
Filter card white (for cytospin)VWRSHAN5991022
FlowJo 10 softwareTreestarnot aplicable Version 10.5.3
Frost slides Klinipath
Gibco IMDM medium Fisher Scientific 12440053
HCX PL APLO 40x 1.4 OIL lensLeica microsystems not aplicable 
Hydrophobic pen: Omm Edge pen Vectornot aplicable 
Leica TCS SP5 DMI6000Leica microsystems not aplicable The microscope setup in this protocol consisted of an HCX PL APO 40x/1.2 oil-immersion objective with 8-bit resolution, 1024 pixels x 1024 pixels, 400 Hz speed, pinhole 68 µm, and zoom factor of 1.5 at room temperature. This system contains a 405 diode laser, argon laser, DPSS 561 laser, HeNe 594 laser and HeNe 633 laser with 4 hybrid detectors (HyDs) and 5 photomultiplier tubes (PMTs). 
Methanol VWR1060091000
NaN3/sodium azideHospital farmacynot aplicable 
Normal mouse serumOwn micenot aplicable 
PBS LonzaBE17-517Q
ProLong Diamond Antifade MountantFisher Scientific P36965
Purified mouse anti-β-catenin (CTNNB1)BD Biosciences610154
TO-PRO-3 IodideThermofisherT3605
Transparent nailpolishat any drugstorenot aplicable 
Tween-20Sigma Aldrich P1379-500ml 
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 labeling kitThermofisherZ25006

References

  1. Kahn, M. Can we safely target the WNT pathway. Nature Reviews. Drug Discovery. 13 (7), 513-532 (2014).
  2. Jung, Y. S., Park, J. I. Wnt signaling in cancer: therapeutic targeting of Wnt signaling beyond beta-catenin and the destruction complex. Experimental & Molecular Medicine. 52 (2), 183-191 (2020).
  3. Gao, K., Zhang, T., Wang, F., Lv, C. Therapeutic Potential of Wnt-3a in neurological recovery after spinal cord injury. European Neurology. 81 (3-4), 197-204 (2019).
  4. Jia, L., Pina-Crespo, J., Li, Y. Restoring Wnt/beta-catenin signaling is a promising therapeutic strategy for Alzheimer's disease. Molecular Brain. 12 (1), 104 (2019).
  5. Bae, S. M., Hong, J. Y. The Wnt signaling pathway and related therapeutic drugs in autism spectrum disorder. Clinical Psychopharmacology and Neuroscience. 16 (2), 129-135 (2018).
  6. Tajer, P., Pike-Overzet, K., Arias, S., Havenga, M., Staal, F. J. T. Ex vivo expansion of hematopoietic stem cells for therapeutic purposes: Lessons from development and the niche. Cells. 8 (2), 169 (2019).
  7. Yanai, K., et al. Crosstalk of hedgehog and Wnt pathways in gastric cancer. Cancer Letters. 263 (1), 145-156 (2008).
  8. Blank, U., et al. An in vivo reporter of BMP signaling in organogenesis reveals targets in the developing kidney. BMC Developmental Biology. 8, 86 (2008).
  9. Duncan, A. W., et al. Integration of Notch and Wnt signaling in hematopoietic stem cell maintenance. Nature Immunology. 6 (3), 314-322 (2005).
  10. Jho, E. H., et al. Wnt/beta-catenin/Tcf signaling induces the transcription of Axin2, a negative regulator of the signaling pathway. Molecular and Cellular Biology. 22 (4), 1172-1183 (2002).
  11. Lustig, B., et al. Negative feedback loop of Wnt signaling through upregulation of conductin/Axin2 in colorectal and liver tumors. Molecular and Cellular Biology. 22 (4), 1184-1193 (2002).
  12. Bernkopf, D. B., Hadjihannas, M. V., Behrens, J. Negative-feedback regulation of the Wnt pathway by conductin/axin2 involves insensitivity to upstream signalling. Journal of Cell Science. 128 (1), 33-39 (2015).
  13. Vassar, R., Rosenberg, M., Ross, S., Tyner, A., Fuchs, E. Tissue-specific and differentiation-specific expression of a human K14 keratin gene in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (5), 1563-1567 (1989).
  14. DasGupta, R., Fuchs, E. Multiple roles for activated LEF/TCF transcription complexes during hair follicle development and differentiation. Development. 126 (20), 4557-4568 (1999).
  15. Maretto, S., et al. Mapping Wnt/beta-catenin signaling during mouse development and in colorectal tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (6), 3299-3304 (2003).
  16. Mohamed, O. A., Clarke, H. J., Dufort, D. beta-catenin signaling marks the prospective site of primitive streak formation in the mouse embryo. Developmental Dynamics. 231 (2), 416-424 (2004).
  17. Moriyama, A., et al. GFP transgenic mice reveal active canonical Wnt signal in neonatal brain and in adult liver and spleen. Genesis. 45 (2), 90-100 (2007).
  18. Currier, N., et al. Dynamic expression of a LEF-EGFP Wnt reporter in mouse development and cancer. Genesis. 48 (3), 183-194 (2010).
  19. Ferrer-Vaquer, A., et al. A sensitive and bright single-cell resolution live imaging reporter of Wnt/beta-catenin signaling in the mouse. BMC Developmental Biology. 10, 121 (2010).
  20. Jho, E. H., et al. Wnt/beta-catenin/Tcf signaling induces the transcription of Axin2, a negative regulator of the signaling pathway. Molecular and Cellular Biology. 22 (4), 1172-1183 (2002).
  21. de Roo, J. J. D., et al. Axin2-mTurquoise2: A novel reporter mouse model for the detection of canonical Wnt signalling. Genesis. 55 (10), (2017).
  22. van de Moosdijk, A. A. A., van de Grift, Y. B. C., de Man, S. M. A., Zeeman, A. L., van Amerongen, R. A novel Axin2 knock-in mouse model for visualization and lineage tracing of WNT/CTNNB1 responsive cells. Genesis. 58 (9), 23387 (2020).
  23. Choi, Y. S., et al. Distinct functions for Wnt/beta-catenin in hair follicle stem cell proliferation and survival and interfollicular epidermal homeostasis. Cell Stem Cell. 13 (6), 720-733 (2013).
  24. Nolan, G. P., Fiering, S., Nicolas, J. F., Herzenberg, L. A. Fluorescence-activated cell analysis and sorting of viable mammalian cells based on beta-D-galactosidase activity after transduction of Escherichia coli lacZ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (8), 2603-2607 (1988).
  25. Goedhart, J., et al. Structure-guided evolution of cyan fluorescent proteins towards a quantum yield of 93. Nature Communications. 3, 751 (2012).
  26. Bernkopf, D. B., Bruckner, M., Hadjihannas, M. V., Behrens, J. An aggregon in conductin/axin2 regulates Wnt/beta-catenin signaling and holds potential for cancer therapy. Nat Commun. 10 (1), 4251 (2019).
  27. Joosen, L., Hink, M. A., Gadella, T. W., Goedhart, J. Effect of fixation procedures on the fluorescence lifetimes of Aequorea victoria derived fluorescent proteins. Journal of Microscopy. 256 (3), 166-176 (2014).
  28. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  29. Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Reviews. 11, 227-256 (2005).
  30. Henriksson, J., et al. Endrov: an integrated platform for image analysis. Nature Methods. 10 (6), 454-456 (2013).
  31. Hedgepeth, C. M., et al. Activation of the Wnt signaling pathway: a molecular mechanism for lithium action. Developmental Biology. 185 (1), 82-91 (1997).
  32. Sato, N., Meijer, L., Skaltsounis, L., Greengard, P., Brivanlou, A. H. Maintenance of pluripotency in human and mouse embryonic stem cells through activation of Wnt signaling by a pharmacological GSK-3-specific inhibitor. Nature Medicine. 10 (1), 55-63 (2004).
  33. Ring, D. B., et al. Selective glycogen synthase kinase 3 inhibitors potentiate insulin activation of glucose transport and utilization in vitro and in vivo. Diabetes. 52 (3), 588-595 (2003).
  34. Liu, C., et al. Control of beta-catenin phosphorylation/degradation by a dual-kinase mechanism. Cell. 108 (6), 837-847 (2002).
  35. Zeng, X., et al. Initiation of Wnt signaling: control of Wnt coreceptor Lrp6 phosphorylation/activation via frizzled, dishevelled and axin functions. Development. 135 (2), 367-375 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

WntAxin2 mTurquoise2WntWnt

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved