Citometria a flusso e analisi dell'imaging confocale della bassa espressione di Wnt nei timociti reporter Axin2-mTurquoise2

Riepilogo

È noto che i livelli di segnalazione regolano il destino cellulare, indicando che la regolazione della segnalazione Wnt costituisce un interessante bersaglio terapeutico. Qui, descriviamo i metodi di analisi della citometria a flusso e della microscopia confocale per un robusto modello reporter di segnalazione Wnt canonico murino che misura livelli di segnalazione Wnt distinti.

Abstract

La misurazione dei livelli di espressione di Wnt è essenziale quando si cerca di identificare o testare nuovi bersagli terapeutici di Wnt. Studi precedenti hanno dimostrato che la segnalazione canonica di Wnt opera attraverso un meccanismo guidato dal dosaggio, motivando la necessità di studiare e misurare la segnalazione di Wnt in vari tipi di cellule. Sebbene siano stati proposti diversi modelli reporter per rappresentare l'espressione fisiologica di Wnt, sia il contesto genetico che la proteina reporter hanno fortemente influenzato la validità, l'accuratezza e la flessibilità di questi strumenti. Questo articolo descrive i metodi per l'acquisizione e l'analisi dei dati ottenuti con il modello reporter Wnt del topo Axin2-mTurquoise2, che contiene un allele^em1Fstl Axin2 mutato. Questo modello facilita lo studio della segnalazione canonica endogena di Wnt in singole cellule in un'ampia gamma di attività di Wnt.

Questo protocollo descrive come apprezzare appieno l'attività reporter di Axin2-mTurquoise2 utilizzando l'analisi della popolazione cellulare del sistema ematopoietico, combinata con marcatori di superficie cellulare o colorazione intracellulare con β-catenina . Queste procedure servono come base per l'implementazione e la riproduzione in altri tessuti o cellule di interesse. Combinando lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza e l'imaging confocale, è possibile visualizzare livelli di espressione di Wnt canonici distinti. Le strategie di misurazione e analisi raccomandate forniscono dati quantitativi sui livelli di espressione fluorescente per una valutazione precisa della segnalazione Wnt canonica. Questi metodi saranno utili per i ricercatori che desiderano utilizzare il modello Axin2-mTurquise2 per i modelli di espressione Wnt canonici.

Introduzione

La segnalazione Wnt canonica è una via di segnalazione conservata implicata nell'omeostasi dei tessuti sani e nella malattia. È stato dimostrato che la regolazione precisa dei livelli di segnalazione di Wnt è importante nello sviluppo embrionale, ma è anche di grande importanza nei tessuti adulti. È stato scoperto che la segnalazione canonica di Wnt svolge un ruolo importante nella rigenerazione tissutale di diversi organi come l'intestino, la pelle e il sistema ematopoietico. Quindi, quando la segnalazione Wnt è deregolata, insorgono gravi patologie. Il cancro del colon-retto, del fegato e della pelle, le malattie neurologiche e alcune neoplasie ematologiche sono patologie esemplari in cui la segnalazione Wnt deregolata è il fattore causale o il contributore¹. Pertanto, diversi inibitori per diversi bersagli di Wnt sono attualmente in fase di sperimentazione clinica come terapie antitumorali associate a Wnt².

Inoltre, si stanno verificando interessanti progressi nel potenziale terapeutico Wnt per il recupero neurologico, i disturbi neurologici legati all'età e i disturbi congeniti dello spettro autistico ^3,4,5. I segnali Wnt sono stati esplorati per l'espansione ex vivo di cellule staminali per il successivo trapianto⁶. Tuttavia, il targeting terapeutico della segnalazione Wnt canonica è un'impresa difficile a causa della sua importanza in molte funzioni cellulari di base e del cross-talk con altri percorsi ^7,8,9, con conseguente necessità di misurare con precisione gli effetti di questi agenti terapeutici Wnt in un modello di facile interpretazione. La segnalazione canonica di Wnt è guidata da ligandi Wnt solubili a corto raggio, che sono secreti dalle cellule vicine o come escrezione autocrina, come riportato in vari tipi di cellule staminali Wnt-responsive.

I co-recettori del recettore Wnt Frizzled e della proteina correlata al recettore delle lipoproteine (LRP) rispondono a questi ligandi, innescando una cascata di segnalazione intracellulare. Quando la segnalazione Wnt è disattivata, un complesso di distruzione composto da Axis Inhibitor (Axin), prodotto del gene oncosoppressore, poliposi adenomatosa Coli (APC), caseina chinasi1 (CK1α) e glicogeno sintasi chinasi (GSK-3β), previene l'accumulo di β-catenina (CTNNB1) per degradazione proteasomiale. Dopo il legame ligando-recettore Wnt, il complesso di distruzione viene inattivato, portando all'accumulo e alla stabilizzazione della β-catenina nel citoplasma. La β-catenina attiva può migrare verso il nucleo dove si lega ai fattori di trascrizione TCF/LEF (Transcription Factor/Lymphoid Enhancer-binding Factor) per avviare la trascrizione dei geni bersaglio di Wnt. L'axina2 è considerata un gene bersaglio in quanto è un bersaglio diretto della via Wnt¹⁰. Inoltre, Axin2 funge da regolatore negativo e da gene reporter per la segnalazione attiva canonica di Wnt^11,12.

In letteratura sono stati descritti diversi reporter canonici di segnalazione Wnt che sono stati di grande utilità per comprendere il ruolo della segnalazione Wnt nello sviluppo embrionale. La maggior parte di questi reporter fa uso di siti di legame TCF/LEF inseriti sinteticamente, che non utilizzano un gene bersaglio endogeno 13,14,15,16,17,18,19. Inoltre, sono state utilizzate strategie di knock-in di Axin2 che rispettano la posizione naturale del gene 11,20,21,22,23, di cui Axin2-LacZ è generalmente accettato come il più robusto reporter Wnt canonico ¹¹. Tuttavia, la proteina reporter LacZ, sebbene facile da usare nella maggior parte dei tessuti, richiede un substrato di β-galattosidasi, che è riconosciuto come duro per le cellule vive²⁴. Soprattutto per le cellule staminali e i timociti, le dure condizioni di rilevamento di LacZ aumentano la morte cellulare (dati propri non riportati) quando si maneggiano sospensioni cellulari.

Sebbene l'amplificazione del segnale causata dalla colorazione LacZ sia conveniente per rilevare segnali bassi, rende la quantificazione meno diretta e quindi probabilmente meno affidabile. Pertanto, è stato progettato un modello reporter murino per imitare la strategia genetica Axin2-LacZ , ma con una proteina reporter mTurquoise2²¹, per fornire una lettura più diretta e più vicina ai livelli di espressione fisiologica. La proteina fluorescente mTurquoise2 è un eccellente sostituto di LacZ grazie alla sua elevata luminosità (resa quantica (QY) = 0,93), alla flessibilità in combinazione con altre proteine fluorescenti per un'ampia caratterizzazione della superficie cellulare e alla sua mancanza di bisogno di un substrato esogeno. Inoltre, la sua stretta relazione genetica con la proteina fluorescente verde (GFP) offre la possibilità di utilizzare la maggior parte degli anticorpi fluorescenti che riconoscono la GFP per una rilevazione del segnale più forte, se necessario, in cellule estremamente sensibili a Wnt²⁵.

Il modello Axin2-mTurquoise2 non è solo un reporter Wnt canonico, ma offre anche la possibilità di studiare i fenotipi eterozigoti e omozigoti Axin2 (knock-out per Axin2 ). L'inserimento mirato di mTurquoise2 nel sito iniziale di Axin2 provoca l'interruzione della proteina Axin2²¹. Poiché Axin2, noto anche come Conductin, fa parte del complesso di distruzione Wnt, e il complesso di distruzione regola strettamente la trascrizione mediata da β-catenina, la sua parziale o completa assenza potrebbe essere interessante per studiare diverse patologie. Ad esempio, nel cancro del colon-retto, i livelli di Axin2 sono relativamente alti a causa dell'iperattivazione di Wnt¹¹; Tuttavia, il suo ruolo in altre patologie è ancora in gran parte sconosciuto. Anche se si ritiene che Axin2 svolga un ruolo limitato nella degradazione della β-catenina, il suo ruolo nella regolazione di Wnt può essere potenziato dall'aggiunta di un piccolo peptide, che blocca la crescita del cancro del colon-retto mediata da Wnt²⁶.

Nel complesso, un'attenta regolazione di Wnt tramite bersagli terapeutici Wnt può aprire opportunità per modificare l'insorgenza o lo sviluppo di patologie gravi e dovrebbe essere ulteriormente studiata in modelli con capacità di reporter. In questo report, spieghiamo il nostro metodo di analisi basato sulle migliori pratiche del modello murino Axin2-mTurquoise2 per la citometria a flusso e l'imaging confocale. Nel contesto dei livelli di dosaggio di Wnt, i livelli di segnalazione canonici di Wnt molto bassi sono difficili da rilevare, per cui le capacità avanzate di rilevamento e analisi forniscono un vantaggio per derivare appieno i benefici di questo modello. I timociti sono utilizzati come sistema modello a causa della loro fragile vitalità cellulare, della bassa espressione canonica del segnale Wnt e dell'area del citoplasma condensata per rappresentare la sensibilità di rilevamento del modello Axin2-mTurquoise2. Inoltre, viene spiegata una procedura istologica di colorazione totale con β-catenina per sospensioni cellulari di timociti per misurare i livelli citoplasmatici di β-catenina e verificare la segnalazione Wnt canonica attiva nucleare in combinazione con il reporter.

Protocollo

NOTA: Tutte le procedure sui topi sono state eseguite con l'approvazione del Comitato Etico per gli Esperimenti Animali del Leiden University Medical Centre (LUMC). Maschio e femmina, di età compresa tra 6 e 12 settimane, wild-type (wt), che non hanno l'inserzione del costrutto reporter Axin2-mTurquoise2, eterozigoti (Tg/0) con un inserzione del costrutto reporter Axin2-murquoise2 e quindi, un gene Axin2 distrutto, e omozigoti (Tg/Tg) con l'inserzione del costrutto reporter Axin2-mTurquoise2 in entrambi gli alleli e quindi, due geni Axin2 interrotti; I topi Axin2-mTurquoise2 (B6; CBA-Axin2^em1Fstl/J (topi CBA-Axin2 em1Fstl/J). Gli animali sono stati sacrificati mediante eutanasia con CO₂ prima dell'isolamento degli organi. Durante tutta la procedura, ridurre al minimo l'esposizione dei campioni alla luce e mantenerli sempre su ghiaccio o 4 °C, se non diversamente indicato. Coprire i campioni con un foglio di alluminio. Tutti i passaggi devono essere eseguiti in un laboratorio standard con una cappa di biosicurezza.

1. Preparazione della sospensione cellulare di timocita

1. Raccogli il timo dai topi con cura senza contaminazione del sangue tagliando l'addome dei topi ed estraendo il timo con una pinza. Conservare/trasportare temporaneamente nel gelido Dulbecco's Medium (IMDM) di Iscove contenente il 2,5% di siero fetale di vitello (FCS).
   NOTA: Per evitare fuoriuscite di sangue e possibili danni al timo, non sacrificare i topi per lussazione cervicale.
2. Preparare una provetta da 50 mL con un filtro a celle da 70 μm e bagnare il filtro con 1 mL di terreno IMDM/2,5% FCS freddo.
3. Schiacciare l'organo con la punta posteriore di uno stantuffo da siringa da 1 ml mentre si lava due volte con terreno freddo IMDM/2,5% FCS (Figura 1A). Se lo si desidera, aggiungere una concentrazione finale di 50 U/mL di DNAsi I al terreno IMDM/2,5% FCS per prevenire l'aggregazione delle cellule morte. Sciacquare il filtro 2 volte con mezzo freddo IMDM/2,5% FCS e risospendere delicatamente nella provetta da 50 mL.
   NOTA: Non superare un volume finale totale di 10 ml. Tenere le celle sul ghiaccio e al buio per i passaggi successivi e quando non vengono maneggiate.
4. Centrifugare a 330 × g per 5 minuti a 4 °C e aspirare delicatamente il surnatante dal pellet cellulare. Risospendere delicatamente il pellet cellulare in un terreno IMDM/2,5% FCS freddo incompleto e prepararsi per il conteggio delle cellule.
   NOTA: Se necessario, congelare e conservare i timociti in azoto liquido in FCS-10% dimetilsolfossido per esperimenti successivi. Un corretto congelamento e scongelamento delle cellule ridurrà l'eccessiva morte cellulare. In media, la metà dei timociti può essere apoptotica dopo lo scongelamento a causa della selezione naturale delle cellule T nel timo, che dovrebbe essere considerata quando si decide quanti timociti congelare per crio-fiala. Non meno di 2,5 × 10⁶ timociti devono essere congelati per flaconcino.

2. Preparazione della citometria a flusso di timociti

1. Preparare i timociti per la procedura di colorazione della superficie cellulare preparando 2,5 × 10⁶ timociti per campione di colorazione in soluzione salina ghiacciata tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4) (Figura 1B). Contare il numero di cellule vive dopo lo scongelamento, se i timociti sono stati precedentemente congelati. Se necessario, aggiungere una concentrazione finale di 50 U/mL di DNAsi I per prevenire l'aggregazione delle cellule morte.
2. Utilizzare i pannelli di colorazione degli anticorpi per la caratterizzazione della superficie cellulare di un sottogruppo completo di timociti.
   NOTA: È possibile selezionare altre combinazioni di fluorocromi. Seleziona marcatori di popolazione rari per fluorocromi fluorescenti luminosi e, se possibile, aggiungi un marcatore vivo-morto. Né i fluorocromi V450 né V500 devono essere utilizzati in combinazione con il reporter fluorescente mTurquoise2 a causa della sovrapposizione spettrale. Controllare sempre gli spettri di fluorescenza di mTurquoise2 in combinazione con fluorocromi blu e verdi (Figura 1A supplementare).
   1. Miscelare separatamente gli anticorpi in rapporti precedentemente definiti dei pannelli di lignaggio negativo (Lin-) in tampone PBS/albumina sierica bovina (BSA) 0,2%/NaN₃ (azide di sodio) 0,1%.
      NOTA: Tutte le cellule indesiderate (non timociti presenti nel timo) vengono colorate in un processo in 2 fasi con un anticorpo secondario alla streptavidina (in questo esempio, ficoeritrina (Pe)-Cy7 e alloficocianina (APC)-Cy7) e possono essere escluse utilizzando un "dump gate" nell'analisi di citometria a flusso.
   2. Miscelare gli anticorpi in rapporti precedentemente definiti del pannello di colorazione Doppio Negativo (DN) con l'anticorpo secondario streptavidina Pe-Cy7 in tampone PBS/0,2% BSA/0,1% NaN₃ . Escludere il pannello Lin- da questa miscela (Tabella 1).
   3. Miscelare gli anticorpi in rapporti precedentemente definiti del pannello di colorazione Immature Single Positive (ISP), Double Positive (DP) e Single Positive (SP) con l'anticorpo secondario streptavidina APC-Cy7 in tampone PBS/0,2% BSA/0,1% NaN₃ . Escludere il pannello Lin- da questa miscela (Tabella 1).
   4. Innanzitutto, colorare i timociti con le popolazioni di cellule non T indesiderate utilizzando le miscele di anticorpi primari di biotina dei pannelli Lin- per 30 minuti sul ghiaccio al buio.
      NOTA: Ogni pannello Lin- è un diverso insieme di cellule e quindi non deve essere colorato insieme in un campione.
   5. Centrifugare a 300 × g, 4 °C per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Lavare i timociti con 150 μL di tampone PBS ghiacciato/0,2% BSA/0,1% NaN₃ e centrifugare a 300 × g, 4 °C per 5 minuti.
   6. Colorare con il pannello DN e il pannello ISP/DP/SP della corrispondente colorazione Lin- per 30 minuti su ghiaccio al buio. Centrifugare a 300 × g, 4 °C per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Lavare i timociti con 150 μl di tampone PBS/0,2% BSA/0,1% NaN₃ ghiacciato e centrifugare a 300 × g, 4 °C per 5 minuti.
3. Preparare le cellule per la misurazione della citometria a flusso omogeneizzandole con un tubo filtrante da 35 μm e prelevando le cellule in tampone PBS/0,2% BSA/0,1% NaN₃ . Proteggere le cellule dalla luce e mantenerle in ghiaccio fino e durante la misurazione del citometro a flusso.
   NOTA: NaN₃ (sodio azide) è altamente tossico e fatale. Particolare attenzione deve essere prestata quando si lavora con questa sostanza. Lavarsi accuratamente le mani dopo la manipolazione e chiamare immediatamente un centro antiveleni o un medico/medico se NaN₃ viene ingerito.

3. Misurazione del citometro a flusso

NOTA: Gli utenti inesperti dovrebbero prima seguire un corso di formazione con citometro a flusso poiché la misurazione del segnale mTurquoise2 in combinazione con molti altri fluorocromi richiede esperienza e una pianificazione consapevole dell'esperimento. Vedere la Tabella dei materiali per informazioni sul citometro a flusso.

1. Avviare il citometro a flusso secondo il manuale utente o altro protocollo stabilito. Controllare e, se necessario, regolare i set del filtro passa-banda nel citometro a flusso per una strategia di rilevamento della fluorescenza ottimale.
   NOTA: Un filtro consigliato per mTurquoise2 è 470/20 nm sulla linea laser ultravioletta da 405 nm, 407 nm o sulla meno comune linea laser da 440 nm.
2. Calibrare il citometro a flusso stabilendo le impostazioni di compensazione con le perle di compensazione disponibili in commercio e le cellule 293T che esprimono mTurchese2 trasfettate in modo stabile.
   NOTA: I timociti wt colorati singolarmente possono essere utilizzati al posto delle perle di compensazione. In questo caso, la compensazione con le perline era altrettanto efficiente e più conveniente rispetto all'uso delle celle.
   1. Etichettare le perline con ogni singolo fluorocromo utilizzato nell'esperimento e includere perline non colorate. Misurare le perle per impostare un pannello di impostazione della compensazione e misurare le cellule 293T che esprimono mTurquoise2 poiché non esiste un fluorocromo corrispondente per mTurquoise2, che può essere utilizzato sulle perline. Salvare le impostazioni di compensazione per utilizzarle nell'esperimento effettivo.
      NOTA: Le cellule che esprimono mTurquoise2 utilizzate per l'impostazione di compensazione devono essere altrettanto luminose o più luminose dei timociti che esprimono mTurquoise2 dell'esperimento effettivo. Assicurati che siano presenti anche cellule 293T mTurquoise2-negative.
   2. Per l'esperimento, includere la fluorescenza meno uno (FMO) timociti colorati con Tg/Tg, incluso un campione wt per l'FMO mTurquoise2 e un campione non colorato di timociti di ciascun genotipo di topo come controlli positivi per la parte di analisi.
      NOTA: Questi controlli sono importanti per impostare correttamente i gate per le celle positive. Il resto dei campioni sperimentali viene colorato con il pannello colorante completo (Tabella 1).
      1. Crea un esperimento, aggiungi e denomina il numero di provette nel software del citometro a flusso e crea grafici a dispersione per visualizzare le cellule colorate per il set completo di fluorocromi.
      2. Applicare all'esperimento le impostazioni di compensazione stabilite in precedenza. Regolare la dispersione diretta (FSC) e la dispersione laterale (SSC) con timociti wt non colorati fino a quando la popolazione completa di cellule non è visibile nel grafico a dispersione. Misurare prima i timociti Tg/Tg mTurquoise2 non colorati per assicurarsi che la popolazione positiva sia visibile.
      3. Misurare un campione di timocita completamente colorato con Tg/Tg e verificare la presenza di tutte le combinazioni di fluorocromo. Se necessario, regolare i valori di compensazione precedentemente stabiliti per i fluorocromi che mostrano una compensazione errata. Misurare il resto dei campioni sperimentali e non regolare alcuna impostazione durante la misurazione dei campioni.
         NOTA: La successiva regolazione della compensazione può essere eseguita anche nel pacchetto software di analisi. Sebbene il numero di celle disponibili possa essere un fattore limitante, è consigliabile eseguire questo passaggio durante la misurazione. Mantieni le impostazioni uguali tra tutti i campioni per confrontare i valori di intensità mTurquoise2.

4. Analisi citofluorimetrica

NOTA: L'analisi citofluorimetrica è stata eseguita utilizzando software specifici citati nella Tabella dei Materiali; Tuttavia, sono disponibili anche altri programmi di analisi citofluorimetrica.

1. Gate di cellule vive e sottogruppi di timociti secondo i valori FSC e SSC.
2. Controllare le impostazioni di compensazione nella finestra di dialogo della matrice di compensazione a sinistra del campione per assicurarsi che non vi siano interferenze fluorocromatiche e che sia stata eseguita una compensazione adeguata per evitare fuoriuscite o sbavature.
   1. Se la matrice definita dall'acquisizione deve essere regolata, modificare i valori nella matrice di compensazione semplicemente aumentando o diminuendo il valore di compensazione di ogni combinazione di fluorocromo in modo che la popolazione non mostri una linea orizzontale o verticale quasi perfetta (Figura 1B supplementare).
3. Per diffondere visivamente l'intensità mTurquoise2 per un corretto gating positivo, modificare la visualizzazione dell'asse X mTurquoise2 in lineare (Figura 2 supplementare).
   1. Utilizzare il controllo FMO mTurquoise2 come controllo negativo per il gating del segnale positivo mTurquoise2. Rivedere il gating di soglia corretto per popolazione cellulare (Figura 2).
      NOTA: Le celle di controllo (wt) mTurquoise2 FMO non hanno il marcatore mTurquoise2 e quindi possono essere utilizzate come soglia di fondo per l'attività del reporter Axin2.
4. Gate mTurquoise2-positive con il canale di rilevamento appropriato per definire quante celle sono Wnt-positive.
5. Calcola la media geometrica e la mediana per definire la quantità di intensità fluorescente nelle celle di interesse.
   1. Clicca su Statistiche | Aggiungi statistiche all'interno del pannello che mostra le celle mTurquoise2-positive.
   2. Definisci il metodo statistico, la popolazione di interesse e il canale di rilevamento di mTurquoise2 e fai clic su Aggiungi. Rappresenta la media geometrica e l'intensità fluorescente mediana in unità arbitrarie (AU) per tracciare grafici.
      NOTA: La mediana rappresenta il valore medio dell'intensità della fluorescenza e, quindi, fornisce informazioni sullo spostamento della popolazione dell'intensità della fluorescenza. Se necessario, una correzione dello sfondo può aiutare a ottenere una visualizzazione più chiara della gamma dinamica dell'attività del reporter mTurquoise2. Questo può essere fatto sottraendo le frequenze di colorazione di fondo wt dalla frequenza totale delle cellule mTurquoise2-positive del tipo di cellula specifico che è gated.

5. Preparazione di citospin timocitarie per l'imaging confocale

NOTA: I citospin dei timociti sono raccomandati quando si lavora con sospensioni cellulari di cellule non aderenti. Poiché l'espressione di Axin2-mTurquoise2 nei timociti è inferiore rispetto alle cellule epiteliali del timo, per l'imaging sono state utilizzate sospensioni di cellule timocitarie filtrate.

1. Inizia con una sospensione cellulare di timociti appena raccolti o congelati. Sospendere ~20.000 timociti in 100 μL di PBS freddo/0,5% BSA/10% FCS per genotipo di timocita.
   NOTA: Se necessario, scongelare delicatamente le cellule per preservare la massima vitalità cellulare quando si lavora con timociti precedentemente congelati. Ciò contribuirà a ridurre l'autofluorescenza durante l'imaging delle cellule. Verificare la vitalità cellulare per garantire la qualità del campione. La procedura di citospin impiega una forza meccanica che è stata adattata al fragile timocita; Ciononostante, richiede una popolazione iniziale altamente vitale. Per garantire una maggiore vitalità, si consiglia di iniziare con timociti appena raccolti anziché congelati.
2. Prebagnare l'area intorno all'apertura delle schede filtranti con PBS. Assemblare il supporto della camera del campione cytospin secondo il manuale (Figura 1C).
   1. Posizionare la scheda del filtro sul vetrino antigelo (lato liscio contro il vetrino). Posizionare entrambi gli elementi sul supporto della camera del campione. Prestare attenzione a posizionare la scheda del filtro esattamente sul foro del supporto della camera del campione e posizionare il supporto completo della camera del campione nel rotore.
3. Risospendere con cautela i timociti e aggiungere 100 μl di sospensione cellulare nelle camere del campione. Ruotare la sospensione di timociti per 4 minuti a ~350 × g sui vetrini di brina. Rimuovere con cautela la scheda del filtro dal vetrino antigelo senza toccare le celle. Asciugare i citospin all'aria per un periodo che va da 1 ora fino a una notte a temperatura ambiente.
   NOTA: Quando si lavora con altri tipi di cellule, testare diverse densità di celle per ottenere risultati ottimali. I citospin possono essere congelati a -20 °C in una scatola sigillata per una successiva sperimentazione. Scongelare i citospin per un'ulteriore manipolazione per 1 ora a temperatura ambiente.

6. Immunocolorazione con citospin con β-catenina totale

1. Fissare i citospin per 15 minuti a temperatura ambiente in metanolo al 100%. Asciugare i vetrini all'aria per 10 minuti a temperatura ambiente. Disegna un cerchio attorno alla popolazione di timociti sul vetrino con una penna idrofoba.
   NOTA: Questa fase di fissazione è ottimizzata specificamente per la colorazione con β-catenina.
2. Posizionare i vetrini in PBS/0,05% Tween-20 per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi trasferirli in una scatola buia e umida durante le fasi di blocco e incubazione. Aggiungere 100 μl di PBS/10% siero normale di topo (NMS) per vetrino e lasciare nella scatola umida per 10 minuti a temperatura ambiente. Picchiettare il vetrino per rimuovere il 10% di NMS, aggiungere 100 μl di PBS/10% di siero di capra normale (NGS) per vetrino e lasciare nella scatola umida per 30 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: L'incubazione con PBS/10% NMS blocca il legame con gli anticorpi primari non specifici (Figura 1D), mentre PBS/10% NGS blocca il legame con gli anticorpi secondari non specifici.
3. Preparare anticorpi aggiuntivi per la colorazione cellulare. Miscelare 0,5 μg dell'anticorpo totale β-catenina con i frammenti marcati con AF568.
   NOTA: In questa impostazione, è stato utilizzato un kit di etichettatura disponibile in commercio per la pre-marcatura della β-catenina totale primaria anti-topo con frammenti IgG1 Fab secondari di capra-anti-topo con etichetta fluorocromica Alexa Fluor 568 (AF568) prima di aggiungerla ai timociti. Eseguire l'etichettatura secondo il protocollo del produttore poiché potrebbe essere necessario testare diverse concentrazioni. Utilizzare l'anticorpo marcato con β-catenina-AF568 entro 30 minuti.
4. Aggiungere 50 μl (0,5 μg) dell'anticorpo totale marcato con β-catenina-AF568 per vetrino cytospin per una notte a 4 °C in una scatola umida. Includere un controllo di colorazione negativa secondo il protocollo del produttore o un controllo isotipografico in caso di protocollo di marcatura diretta.
5. Lavare per 20 minuti con PBS/0,05% Tween-20 a temperatura ambiente. Quindi, lavare per 20 minuti con PBS a temperatura ambiente in un barattolo mescolando. Eseguire una seconda fase di fissazione per garantire il legame dell'anticorpo all'antigene: 10 minuti a temperatura ambiente con 100 μL di paraformaldeide (PFA) al 4% in PBS in una scatola umida.
   NOTA: Mantieni le diapositive al buio. Né il metanolo né la fissazione del PFA influenzeranno significativamente l'espressione di mTurquoise2²⁷.
6. Immergi le diapositive in PBS. Eseguire la colorazione nucleare con 50 μl di TO-PRO-3 (1:1500) per 10 minuti a temperatura ambiente nella scatola umida. Lavare i vetrini per 20 minuti con PBS a temperatura ambiente in un barattolo mescolando.
   NOTA: La concentrazione di TO-PRO3 può essere titolata in base all'uso di altri fluorocromi con spettri fluorescenti vicini.
7. Incorporare i campioni con un reagente antisbiadimento secondo il protocollo del produttore e coprire con un vetrino coprioggetti. Asciugare all'aria per 24 ore a temperatura ambiente. Visualizzate i vetrini direttamente sotto un microscopio a fluorescenza o confocale o conservateli a -20 °C per un imaging successivo.

7. Misurazione microscopica confocale

NOTA: Vedere la Tabella dei materiali per informazioni sul microscopio confocale.

1. Accendere il microscopio confocale secondo il manuale o il protocollo stabilito. Utilizzare i controlli della linea cellulare mTurquoise2 293T a trasfettazione stabile negativa e positiva per la regolazione primaria delle impostazioni confocali. Successivamente, utilizzare i timociti wt Axin2-mTurquoise2 e Tg/Tg (knock-out) Axin2-mTurquoise2 come controlli negativi e positivi, rispettivamente, per garantire l'assenza di sottoesposizione del segnale mTurquoise2.
2. Preparare il software per la scansione sequenziale programmando i laser e le larghezze dei filtri. Inizia prima con la linea laser a lunghezza d'onda più alta e procedi verso la lunghezza d'onda più bassa. Una volta installate tutte le fasi di scansione sequenziale, caricare il campione sul tavolino del microscopio, mettere a fuoco il campione e premere Live per ottimizzare la potenza del laser e Smart Gain utilizzando i rispettivi pulsanti sul software confocale o sul pannello manuale opzionale.
   NOTA: La sezione del campione del vetrino non deve essere ripresa per la quantificazione del segnale poiché potrebbe verificarsi un potenziale fotosbiancamento. Tuttavia, mTurquoise2 ha un'elevata fotostabilità²⁵.
3. In caso di espressione molto bassa di mTurquoise2, aumentare la potenza del laser e lo Smart Gain fino a quando non si osserva un segnale fluorescente e verificare con il campione di controllo negativo per garantire un vero segnale positivo. Visualizza i timociti con una lente a olio 40x 1,4, una lente a olio 63x 1,4 o una lente a olio 100x 1,4.
   NOTA: Per questo studio è stato utilizzato un microscopio Leica SP5.
4. Utilizzare queste impostazioni di imaging confocale sul microscopio prima di misurare il campione.
   1. Regolare l'intervallo di valori di intensità su un'immagine a 12 bit facendo clic su Configurazione | Impostazioni | passare a 12 bit nell'opzione Profondità di bit per creare una scala di intensità più ampia e quindi una maggiore distinzione tra segnali fluorescenti bassi e alti.
   2. Regola la risoluzione dell'immagine facendo clic su XY e aumenta il formato a 1024 x 1024, che raddoppierà anche il tempo di scansione. Regolare la velocità di scansione a 400-600 Hz facendo clic su Velocità | Altro per modificare manualmente le impostazioni. Inoltre, attivare l'opzione di scansione bidirezionale .
   3. Regola il cursore della sensibilità per ridurre il segnale di fondo. Ottimizza la corretta potenza del laser e lo Smart Gain con l'opzione Quick LUT (Look-Up Table).
      NOTA: Nell'immagine a 12 bit, il dispositivo di scorrimento ha un valore di intensità della scala di grigi compreso tra 0 e 4095. Questo può essere fatto anche in seguito con il software offline gratuito Las X. Il colore verde mostrerà lo sfondo nero e il colore blu mostrerà i pixel saturi del campione.
5. Quando tutte le impostazioni di imaging sono ottimizzate, misurare il campione facendo clic su Avvia, che avvierà l'imaging sequenziale di tutti e tre i canali.
   1. Misurare il segnale fluorescente nucleare TO-PRO-3. Rileva TO-PRO-3 con il laser a 633 nm e HyD 640-750 nm.
      NOTA: In questa configurazione, è stato utilizzato il 6% di potenza laser con un guadagno intelligente del 15%. Questa impostazione può cambiare a seconda dell'intensità della colorazione TO-PRO-3. Se molto luminoso, potrebbe influenzare i fluorocromi a bassa intensità quando sovraeccitato. In tal caso, ridurre la concentrazione di colorazione.
   2. Misurare i segnali nucleari e citoplasmatici fluorescenti della β-catenina. Rileva la β-catenina con il laser a 561 nm e HyD 580-605 nm. Accumula fino a 2 scansioni per un'immagine regolando l'impostazione nella casella XY del software con media di linea 2 in caso di segnale AF568 basso.
      NOTA: In questa configurazione, è stata utilizzata l'85% della potenza del laser con un guadagno intelligente dell'87%.
   3. Misura il segnale fluorescente citoplasmatico mTurquoise2. Rileva mTurquoise2 con il laser a 458 nm e HyD 490-600 nm. Accumula fino a 4 scansioni per un'immagine regolando l'impostazione nella casella XY del software con media di linea 4 nel caso di un segnale mTurquoise2 basso.
      NOTA: A causa dei vecchi laser sul microscopio confocale utilizzato per questo protocollo e del basso segnale mTurquoise2, è stato utilizzato 405 nm al 90% della potenza laser, insieme ai laser a 458 nm e 476 nm al 100% della potenza laser con HyD 490-550 nm al 100% di guadagno intelligente. Un laser a 440 nm è il più ottimale, anche se meno comunemente presente su un microscopio confocale. L'elevata potenza del laser deve essere maneggiata con cura ed eseguita solo con l'imaging sequenziale. Assicurarsi che le impostazioni di emergenza siano in atto per evitare la sovraesposizione del rilevatore. La potenza del laser su altri microscopi confocali potrebbe essere inferiore a quella proposta in questo protocollo a causa di laser più potenti o più recenti. È possibile eseguire un test di sbiancamento per garantire che nessun segnale fluorescente venga perso prima dell'imaging. Nella configurazione proposta, il fotobleaching di mTurquoise2 era accettabile.
   4. Esegui l'imaging in campo chiaro per la visualizzazione totale delle cellule. Rileva i timociti con il laser a 488 nm e PMT Scan-DIC. Esporta i file Lif per l'analisi delle immagini.
      NOTA: In questa configurazione, è stato utilizzato il 59% della potenza del laser con un guadagno di 212 V e un offset dei dati di -4,3%. I file Lif possono essere letti nel software offline LAS x per la correzione dell'immagine.

8. Analisi al microscopio confocale

1. Analizzare le immagini utilizzando un software di elaborazione delle immagini²⁸ (Figura 3 supplementare). Caricare le immagini nel software.
   NOTA: Sono accettati più formati, ma si consiglia l'importazione diretta di file TIFF con LUT o l'importazione diretta di file Lif nel software di elaborazione delle immagini.
2. Misurare il segnale attivo della β-catenina nei nuclei dei timociti.
   1. Selezionare i nuclei dei timociti colorati con TO-PRO-3 nell'immagine del valore rosso grigio per l'analisi della β-catenina attiva. Eseguire questa operazione manualmente o utilizzare la selezione automatica delle celle nel software.
      NOTA: La selezione automatica delle celle potrebbe richiedere l'elaborazione delle immagini per una corretta definizione delle soglie e un'analisi delle particelle. La selezione manuale delle celle può essere laboriosa, ma generalmente non richiede alcuna elaborazione delle immagini ed è consigliata in questo protocollo.
   2. Attiva la selezione manuale con uno qualsiasi degli strumenti di selezione nella barra di lavoro.
      1. Selezionare il contorno del nucleo e aggiungerlo al gestore della regione di interesse (ROI). Attiva il ROI manager cliccando su Analizza | Strumenti | ROI Manager e, quando si apre una nuova finestra ROI Manager, fai clic sulla prima opzione Aggiungi (t) o utilizza la scorciatoia da tastiera t. Ripetere il passaggio precedente fino a quando tutti i nuclei non sono definiti e aggiunti al ROI manager. Utilizzare l'opzione Mostra tutto in Gestione ROI per visualizzare le celle selezionate.
   3. Seleziona >3 aree di sfondo in cui non sono presenti celle e aggiungile al gestore ROI.
      NOTA: In questo caso, le dimensioni e la forma non sono importanti. Queste regioni serviranno come misure del rumore di fondo per il calcolo finale.
      1. Definisci la misura sull'immagine cliccando su Analizza | Imposta le misure. Nella nuova finestra che si apre con diverse opzioni di misurazione, attiva Area, Densità integrata e Valore medio di grigio | fare clic su OK.
      2. Attiva l'immagine del valore grigio β-catenina cliccando su di essa, e visualizza i nuclei selezionati e le aree di sfondo cliccando su Mostra tutto nel gestore ROI. Osservare tutte le aree selezionate che sono ora visibili nell'immagine β-catenina.
      3. Fare clic su Misura in Gestione ROI o fare clic su Analizza | Misurare. Osserva la nuova finestra Risultati che si apre, mostrando i risultati del segnale della β-catenina all'interno dei ROI.
      4. Trasferisci i risultati a un programma di calcolo per fogli di calcolo facendo clic su Modifica | Seleziona tutto; e copia/incolla l'elenco nel foglio di calcolo per ulteriori calcoli. Salva il ROI manager per riferimento futuro senza dover ripetere la selezione dei nuclei facendo clic su Altro | Salvare....
   4. Per la selezione automatica delle celle, crea duplicati (Tastiera Ctrl D) dell'immagine da elaborare poiché molte impostazioni di elaborazione dell'immagine non possono essere annullate.
      NOTA: La marcatura nucleare automatizzata richiede l'elaborazione delle immagini, nella maggior parte dei casi, per definire i nuclei in modo automatico e accurato. L'elaborazione delle immagini deve essere eseguita solo per la selezione dell'area. Le immagini elaborate non sono utili per la misurazione dell'intensità della fluorescenza perché i valori dei pixel vengono alterati.
      1. Eseguire un filtro gaussiano facendo clic su Elabora | Filtri | Sfocatura gaussiana per rendere più fluida l'immagine. Testare più valori Sigma (Raggio) e attivare l'opzione Anteprima per visualizzare l'effetto prima di fare clic su OK.
      2. Inverti l'immagine facendo clic su Modifica | Inverti. Controlla la luminosità e il contrasto facendo clic su Immagine | Regola | Luminosità/Contrasto. Utilizzare l'opzione Auto o, preferibilmente, modificare manualmente i valori.
         NOTA: Non applicare le modifiche in quanto ciò altererebbe le proprietà dell'immagine. È sufficiente chiudere la finestra B&C quando è stata ottenuta l'immagine desiderata.
      3. Crea una Soglia cliccando su Immagine | Regola | Soglia e definisci le migliori impostazioni di Soglia in cui tutte le celle sono per lo più visibili. Fare clic su Applica per applicare le impostazioni di soglia.
         NOTA: Se non è stata applicata una soglia alle celle che mostrano buchi, fare clic su Elabora | Binario | Riempi i buchi per riempire gli spazi vuoti all'interno delle celle. Se le celle sono fuse insieme con le impostazioni di soglia, fare clic su Elabora | Binario | Spartiacque per separare queste cellule. Una sottile linea di 1 pixel separerà qualsiasi cella che il programma interpreta come fusa.
      4. Definisci il nucleo più piccolo e quello più grande nell'immagine selezionando manualmente un nucleo a scelta con lo strumento di selezione a mano libera , aggiungilo al gestore ROI e misura l'area.
      5. Analizza le particelle (nuclei) cliccando su Analizza | Analizza le particelle e inserisci l'area più piccola e l'area più grande nella casella Dimensione (^2) con un trattino (-) in mezzo. Attivare le caselle Visualizza risultati, Aggiungi al gestore ed Escludi sugli spigoli prima di fare clic su OK. Continuare con il passaggio 8.2.3 per completare il protocollo.
3. Misurare i segnali citoplasmatici mTurchese2 e β-catenina nei timociti.
   1. Selezionare il contorno dei timociti interi nell'immagine in campo chiaro seguendo gli stessi passaggi di cui sopra.
   2. Seleziona >3 aree di sfondo in cui non sono presenti celle e aggiungile al gestore ROI.
      NOTA: In questo caso, le dimensioni e la forma non sono essenziali. Queste regioni serviranno come misure del rumore di fondo per il calcolo finale.
      1. Attiva l'immagine del valore grigio mTurquoise2 facendo clic su di essa e visualizza le ROI totali delle celle selezionate e le aree di sfondo facendo clic su Mostra tutto nel gestore ROI. Osserva tutte le aree selezionate che sono visibili nell'immagine mTurquoise2.
      2. Fai clic su Misura in ROI Manager o fai clic su Analizza | Misurare. Osservare la nuova finestra Risultati che si apre con i risultati della misurazione del segnale mTurquoise2.
      3. Trasferisci i risultati a un programma di calcolo per fogli di calcolo facendo clic su Modifica | Seleziona tutto e copia/incolla l'elenco nel foglio di calcolo per ulteriori calcoli.
      4. Attiva l'immagine del valore grigio β-catenina facendo clic su di essa e visualizza le ROI totali delle celle selezionate e le aree di sfondo facendo clic su Mostra tutto nel gestore ROI. Osservare tutte le aree selezionate che sono visibili nell'immagine β-catenina.
      5. Fai clic su Misura in ROI Manager o fai clic su Analizza | Misurare. Si noti la nuova finestra Risultati che si apre con i risultati della misurazione del segnale cellulare totale della β-catenina.
      6. Trasferisci i risultati a un programma di calcolo per fogli di calcolo facendo clic su Modifica | Seleziona tutto e copia/incolla l'elenco nel foglio di calcolo per ulteriori calcoli. Salva il ROI manager per riferimento futuro senza dover ripetere la selezione della cella facendo clic su Altro | Salvare....
4. Calcolare la fluorescenza nucleare totale corretta (CTNF) per la β-catenina attiva utilizzando l'equazione 1.
   CTNF = Densità integrata - (Area × media delle aree medie di fondo) (1)
5. Calcolare la fluorescenza cellulare totale corretta (CTCF) per mTurquoise2 utilizzando l'equazione 2.
   CTCF = Densità integrata - (Area × media delle aree medie di fondo) (2)
6. Distinguere tra β-catenina nucleare attiva e β-catenina citoplasmatica sottraendo i valori di β-catenina nucleare ottenuti al punto 8.2.3.3. dai valori di β-catenina cellulare totale ottenuti al punto 8.3.2.5 per ottenere la β-catenina citoplasmatica inattiva.
   NOTA: Assicurarsi che le misurazioni vengano eseguite all'interno della stessa cella.
   1. Calcola la media dell'intensità media delle aree di sfondo. Calcola CTNF e CTCF utilizzando le equazioni 1 e 2. Considerare IntDen (la somma di tutti i pixel all'interno dell'area selezionata) come densità integrata e non come RawIntDen.
   2. Se necessario, calcolare la deviazione standard dei valori IntDen per la rappresentazione grafica dei grafici. Considera fino a 200 celle separate per l'analisi statistica utilizzando il test U di Mann-Whitney.
7. Traccia i risultati in un grafico a singolo punto dati ed etichetta l'asse y con i valori CTNF o CTCF come unità fluorescenti relative (RFU).

Risultati

Per studiare il ruolo della segnalazione Wnt canonica, è stato testato un modello reporter Wnt canonico Axin2-mTurquoise2 in combinazione con l'espressione della proteina β-catenina. I timociti sono noti per essere fragili, mostrano una bassa segnalazione Wnt canonica in diverse fasi del processo di maturazione dei timociti e hanno un basso rapporto citoplasmatico/nucleare; tutti questi fattori ostacolano la rilevazione del mTurchese citoplasmatico2 o della β-catenina. Seguendo il pro...

Discussione

Sono disponibili diversi reporter Wnt canonici con diversa sensibilità del reporter e proteine reporter effettive. Sono disponibili modelli reporter che utilizzano siti di legame TCF/LEF multimerizzati introdotti sinteticamente con proteine reporter fluorescenti; tuttavia, tali ripetizioni di transgeni possono essere perse durante l'allevamento o lunghi esperimenti in vivo e possono essere sensibili ai segnali non-Wnt provenienti dalle sequenze genomiche circostanti che influen...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD FACScantoII flow cytometer	BD Biosciences	not aplicable	Serial number V96300710. The flow cytometer setup in this protocol contains a 405 nm laser line with 505 longpass filter and 530/30 nm bandpass filter, and 470/20 nm bandpass filter; a 488 nm laser with 735 nm longpass filter and 780/60 nm bandpass filter, 670 nm longpass filter and 655 nm longpass filter, 610 nm longpass filter, 550 nm longpass filter and 575/26 nm bandpass filter, 505 nm longpass filter and 530/30 nm bandpass filter, and 488/10 nm bandpass filter; and a 633 nm laser line with 735 nm longpass filter and 780/60 nm bandpass filter, 685 nm longpass filter, and 660/20 nm bandpass filter.
BSA	Sigma	A9647
Corning 70 μm cell strainer	Falcon/Corning	352350
Cytospin 4 Type A78300101	Thermo Scientific	not aplicable
DMSO	Sigma Aldrich	D5879-1L
DNAse I	Sigma	A9647
Falcon 50 mL Conical Centrifuge tubes	Greiner bio-one	227261
Falcon round-bottom Polystyrene Test tubes with cell strainer snap cap	Fisher Scientific	352235
Fetal Calf Serum (FCS)	Greiner Bio-One B.V.	not aplicable	Depends on origin
Fiji software	ImageJ	not aplicable	Version 1.53
Filter card white (for cytospin)	VWR	SHAN5991022
FlowJo 10 software	Treestar	not aplicable	Version 10.5.3
Frost slides	Klinipath
Gibco IMDM medium	Fisher Scientific	12440053
HCX PL APLO 40x 1.4 OIL lens	Leica microsystems	not aplicable
Hydrophobic pen: Omm Edge pen	Vector	not aplicable
Leica TCS SP5 DMI6000	Leica microsystems	not aplicable	The microscope setup in this protocol consisted of an HCX PL APO 40x/1.2 oil-immersion objective with 8-bit resolution, 1024 pixels x 1024 pixels, 400 Hz speed, pinhole 68 µm, and zoom factor of 1.5 at room temperature. This system contains a 405 diode laser, argon laser, DPSS 561 laser, HeNe 594 laser and HeNe 633 laser with 4 hybrid detectors (HyDs) and 5 photomultiplier tubes (PMTs).
Methanol	VWR	1060091000
NaN3/sodium azide	Hospital farmacy	not aplicable
Normal mouse serum	Own mice	not aplicable
PBS	Lonza	BE17-517Q
ProLong Diamond Antifade Mountant	Fisher Scientific	P36965
Purified mouse anti-β-catenin (CTNNB1)	BD Biosciences	610154
TO-PRO-3 Iodide	Thermofisher	T3605
Transparent nailpolish	at any drugstore	not aplicable
Tween-20	Sigma Aldrich	P1379-500ml
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 labeling kit	Thermofisher	Z25006