JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Известно, что уровни передачи сигналов регулируют судьбу клеток, что указывает на то, что регуляция передачи сигналов Wnt представляет собой интересную терапевтическую мишень. В данной работе мы описываем методы анализа проточной цитометрии и конфокальной микроскопии для надежной канонической модели репортера Wnt мышей, которая измеряет различные уровни Wnt-сигнализации.

Аннотация

Измерение уровней экспрессии Wnt имеет важное значение при попытке идентифицировать или протестировать новые терапевтические мишени Wnt. Предыдущие исследования показали, что каноническая передача сигналов Wnt работает через механизм, управляемый дозировкой, что мотивирует необходимость изучения и измерения передачи сигналов Wnt в различных типах клеток. Несмотря на то, что было предложено несколько репортерных моделей для представления физиологической экспрессии Wnt, либо генетический контекст, либо репортерный белок сильно повлияли на валидность, точность и гибкость этих инструментов. В данной работе описаны методы получения и анализа данных, полученных с помощью модели репортера Wnt мыши Axin2-mTurquoise2, которая содержит мутировавший аллель Axin2em1Fstl . Эта модель облегчает изучение эндогенной канонической передачи сигналов Wnt в отдельных клетках в широком диапазоне активности Wnt.

В этом протоколе описывается, как в полной мере оценить репортерную активность Axin2-mTurquoise2 с помощью анализа клеточной популяции кроветворной системы в сочетании с маркерами клеточной поверхности или внутриклеточным окрашиванием β-катенином . Эти процедуры служат основой для осуществления и размножения в других тканях или клетках, представляющих интерес. Комбинируя флуоресцентно-активируемую сортировку клеток и конфокальную визуализацию, можно визуализировать различные канонические уровни экспрессии Wnt. Рекомендуемые стратегии измерения и анализа предоставляют количественные данные об уровнях флуоресцентной экспрессии для точной оценки канонической передачи сигналов Wnt. Эти методы будут полезны для исследователей, которые хотят использовать модель Axin2-mTurquise2 для канонических паттернов экспрессии Wnt.

Введение

Каноническая передача сигналов Wnt является консервативным сигнальным путем, участвующим в гомеостазе здоровых тканей, а также в развитии заболеваний. Было показано, что точная регуляция уровней передачи сигналов Wnt важна для эмбрионального развития, но также имеет большое значение для тканей взрослого человека. Было обнаружено, что каноническая передача сигналов Wnt играет важную роль в регенерации тканей нескольких органов, таких как кишечник, кожа и кроветворная система. Следовательно, когда передача сигналов Wnt нарушается, возникают тяжелые патологии. Колоректальный рак, рак печени и кожи, неврологические заболевания, а также некоторые гематологические злокачественные новообразования являются показательными патологиями, в которых нерегулируемая передача сигналов Wnt является причинным фактором или фактором. Таким образом, несколько ингибиторов для различных мишеней Wnt в настоящее время тестируются в клинических испытаниях в качестве Wnt-ассоциированных противораковых препаратов2.

Кроме того, наблюдаются интересные успехи в области терапевтического потенциала Wnt для неврологического восстановления, возрастных неврологических расстройств и врожденных расстройств аутистического спектра 3,4,5. Были исследованы сигналы Wnt для ex vivo экспансии стволовых клеток для последующей трансплантации6. Тем не менее, терапевтическое нацеливание на каноническую передачу сигналов Wnt является сложной задачей из-за его важности для многих основных клеточных функций и перекрестного взаимодействия с другими путями 7,8,9, что приводит к необходимости точного измерения эффектов этих терапевтических агентов Wnt в легко интерпретируемой модели. Каноническая передача сигналов Wnt управляется растворимыми Wnt-лигандами короткого действия, которые секретируются соседними клетками или в виде аутокринной экскреции, как это происходит в различных типах Wnt-чувствительных стволовых клеток.

Рецептор Wnt Frizzled и рецептор-ассоциированный белок липопротеинов (LRP) реагируют на эти лиганды, что запускает внутриклеточный сигнальный каскад. Когда передача сигналов Wnt выключена, комплекс деструкции, состоящий из ингибитора оси (аксин), гена-супрессора опухолей, аденоматозного полипоза кишечной палочки (APC), казеинкиназы1 (CK1α) и гликогенсинтазыкиназы (GSK-3β), предотвращает накопление β-катенина (CTNNB1) путем протеасомной деградации. При связывании Wnt лиганд-рецептор разрушающий комплекс инактивируется, что приводит к накоплению и стабилизации β-катенина в цитоплазме. Активный β-катенин может мигрировать в ядро, где он связывается с факторами транскрипции транскрипционного фактора/лимфоидного энхансер-связывающего фактора (TCF/LEF), чтобы инициировать транскрипцию генов-мишеней Wnt. Axin2 считается геном-мишенью, поскольку он является прямой мишенью пути Wnt10. Кроме того, Axin2 служит негативным регулятором, а также репортерным геном для активной канонической передачи сигналов Wnt11,12.

В литературе описано несколько канонических репортеров сигналов Wnt, которые были очень полезны для понимания роли передачи сигналов Wnt в эмбриональном развитии. Большинство из этих репортеров используют синтетически вставленные сайты связывания TCF/LEF, которые не используют эндогенный ген-мишень 13,14,15,16,17,18,19. Кроме того, были использованы стратегии Axin2, которые учитывают естественное местоположение гена 11,20,21,22,23, из которых Axin2-LacZ обычно считается наиболее надежным каноническим репортером Wnt 11. Однако репортерный белок LacZ, хотя и прост в использовании в большинстве тканей, требует субстрата β-галактозидазы, который признан агрессивным для живых клеток24. Особенно для стволовых клеток и тимоцитов, жесткие условия обнаружения LacZ увеличивают гибель клеток (собственные неопубликованные данные) при работе с клеточными суспензиями.

Несмотря на то, что усиление сигнала, вызванное окрашиванием LacZ, удобно обнаруживать слабые сигналы, оно делает количественное определение менее прямым и, следовательно, менее надежным. Таким образом, мышиная репортерная модель была разработана таким образом, чтобы имитировать генетическую стратегию Axin2-LacZ , но с репортерным белком21 mTurquoise2, чтобы обеспечить более прямое считывание и приближение к физиологическим уровням экспрессии. Флуоресцентный белок mTurquoise2 является отличной заменой LacZ благодаря своей высокой яркости (квантовый выход (QY) = 0,93), гибкости в сочетании с другими флуоресцентными белками для обширной характеристики клеточной поверхности и отсутствию необходимости в экзогенном субстрате. Кроме того, его тесное генетическое родство с зеленым флуоресцентным белком (GFP) дает возможность использовать большинство GFP-распознавающих флуоресцентных антител для более сильного обнаружения сигнала, если это необходимо, в клетках, чрезвычайно чувствительных к Wnt25.

Модель Axin2-mTurquoise2 является не только каноническим репортером Wnt, но и дает возможность изучать фенотипы гетерозиготы и гомозиготы Axin2 (нокаут Axin2 ). Целенаправленное введение mTurquoise2 в начальный сайт Axin2 приводит к разрушению белка Axin221. Поскольку Axin2, также известный как Conductin, является частью комплекса Wnt-деструкции, а комплекс деструкции жестко регулирует транскрипцию, опосредованную β-катенином, его частичное или полное отсутствие может представлять интерес для изучения различных патологий. Например, при колоректальном раке уровни Axin2 относительно высоки из-за гиперактивации Wnt11; Однако его роль в других патологиях до сих пор в значительной степени неизвестна. Несмотря на то, что считается, что Axin2 играет ограниченную роль в деградации β-катенина, его роль в регуляции Wnt может быть усилена добавлением небольшого пептида, который блокирует Wnt-опосредованныйрост колоректального рака.

В целом, тщательная регуляция Wnt с помощью терапевтических мишеней Wnt может открыть возможности для изменения начала или развития тяжелых патологий и должна быть дополнительно исследована на моделях с репортерной способностью. В этом отчете мы объясняем наш передовой метод анализа мышиной модели Axin2-mTurquoise2 для проточной цитометрии и конфокальной визуализации. В контексте уровней дозировки Wnt очень низкие канонические уровни передачи сигналов Wnt трудно обнаружить, для чего расширенные возможности обнаружения и анализа дают преимущество для полного использования преимуществ этой модели. Тимоциты используются в качестве модельной системы из-за их хрупкой жизнеспособности клеток, низкой канонической сигнальной экспрессии Wnt и конденсированной площади цитоплазмы для представления чувствительности обнаружения модели Axin2-mTurquoise2. Кроме того, объясняется процедура гистологического окрашивания общим β-катенином суспензий клеток тимоцитов для измерения уровней цитоплазматического β-катенина и проверки ядерно-активной канонической передачи сигналов Wnt в сочетании с репортером.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на мышах были проведены с одобрения Этического комитета по экспериментам на животных Медицинского центра Лейденского университета (LUMC). Самец и самка, в возрасте 6-12 недель, дикого типа (wt), у которых нет инсерции репортерной конструкции Axin2-mTurquoise2, гетерозиготные (Tg/0) с одной вставкой репортерной конструкции Axin2-murquoise2 и, таким образом, с одним нарушенным геном Axin2 , и гомозиготные (Tg/Tg) со вставкой репортерной конструкции Axin2-mTurquoise2 в оба аллеля и, таким образом, два нарушенных гена Axin2 ; Axin2-mTurquoise2 мыши (B6; мышей CBA-Axin2em1Fstl/J). Животные были принесены в жертву путем эвтаназии CO2 перед выделением органов. На протяжении всей процедуры сведите к минимуму воздействие света на образцы и постоянно держите их на льду или при температуре 4 °C, если не указано иное. Накройте образцы алюминиевой фольгой. Все действия должны выполняться в стандартной лаборатории с шкафом биобезопасности.

1. Приготовление суспензии клеток тимоцитов

  1. Извлекайте вилочковую железу у мышей осторожно без заражения крови, разрезая брюшную полость мышей и извлекая вилочковую железу с помощью щипцов. Храните/транспортируйте временно в ледяной холодной модифицированной среде Dulbecco's Medium (IMDM) от Iscove, содержащей 2,5% эмбриональной сыворотки теленка (FCS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание пролития крови и возможного повреждения тимуса, не приносите мышей в жертву из-за вывиха шейки матки.
  2. Приготовьте пробирку объемом 50 мл с клеточным фильтром 70 мкм и смочите фильтр 1 мл холодной среды IMDM/2,5% FCS.
  3. Разомните орган задним кончиком поршня шприца объемом 1 мл во время двукратного промывания холодной средой IMDM/2,5% FCS (Рисунок 1A). При желании добавьте конечную концентрацию 50 Ед/мл ДНКазы I в среду IMDM/2,5% FCS, чтобы предотвратить слипание мертвых клеток. Промойте фильтр 2 раза холодной средой IMDM/2,5% FCS и аккуратно суспендируйте в пробирке объемом 50 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте общий конечный объем 10 мл. Держите клетки на льду и в темноте для последующих шагов и когда их нельзя трогать.
  4. Центрифугируйте при 330 × г в течение 5 мин при 4 °C и осторожно отсасывайте надосадочную жидкость из клеточной гранулы. Осторожно суспендируйте клеточную гранулу в холодной неполной среде IMDM/2,5% FCS и подготовьте к подсчету клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости заморозьте и храните тимоциты в жидком азоте в FCS-10% диметилсульфоксиде для последующих экспериментов. Правильное замораживание и размораживание клеток уменьшит чрезмерную гибель клеток. В среднем, половина тимоцитов может подвергаться апоптозе после размораживания из-за естественного отбора Т-клеток в тимусе, что следует учитывать при принятии решения о том, сколько тимоцитов замораживать в одном криофлаконе. В одном флаконе следует замораживать не менее 2,5 ×10-6 тимоцитов.

2. Препарат проточной цитометрии тимоцитов

  1. Подготовьте тимоциты к процедуре окрашивания клеточной поверхности, получив 2,5 × 106 тимоцитов на каждый образец окрашивания в ледяном фосфатно-солевом буфере (PBS, pH 7,4) (рис. 1B). Подсчитайте количество живых клеток после размораживания, если тимоциты были ранее заморожены. При необходимости добавьте концентрацию ДНКазы I в размере 50 Ед/мл, чтобы предотвратить слипание мертвых клеток.
  2. Используйте панели для окрашивания антител для характеристики клеточной поверхности полного субпопуляции тимоцитов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно выбрать и другие комбинации флуорохромов. Выберите редкие популяционные маркеры для ярких флуоресцентных флуорохромов и, если возможно, добавьте маркер живого-мертвого. Ни флуорохромы V450, ни V500 не следует использовать в сочетании с флуоресцентным репортером mTurquoise2 из-за спектрального перекрытия. Всегда проверяйте спектры флуоресценции mTurquoise2 в сочетании с синими и зелеными флуорохромами (дополнительный рисунок 1A).
    1. Смешайте антитела в ранее определенных соотношениях линейно-отрицательных (Lin-) панелей отдельно в буфере PBS/0,2% бычьего сывороточного альбумина (BSA)/0,1% NaN3 (азид натрия).
      Примечание: Все нежелательные клетки (нетимоциты, присутствующие в тимусе) окрашиваются в двухэтапном процессе вторичным антителом стрептавидина (в данном примере фикоэритрином (Pe)-Cy7 и аллофикоцианином (APC)-Cy7) и могут быть исключены с помощью «дамп-гейта» при анализе проточной цитометрии.
    2. Смешайте антитела в заранее определенных соотношениях окрашивающей панели с двойным негативом (DN) с вторичным антителом к стрептавидину Pe-Cy7 в буфере PBS/0,2% BSA/0,1% NaN3 . Исключите из этой смеси панель Lin- (табл. 1).
    3. Смешайте антитела в ранее определенных соотношениях окрашивающей панели Immature Single Positive (ISP), Double Positive (DP) и Single Positive (SP) с вторичным антителом к стрептавидину APC-Cy7 в буфере PBS/0,2% BSA/0,1% NaN3 . Исключите из этой смеси панель Lin- (табл. 1).
    4. Во-первых, окрашивают тимоциты нежелательными не-Т-клеточными популяциями с использованием смесей первичных антител биотина из панелей Lin-, в течение 30 минут на льду в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая Lin-панель представляет собой отдельный набор ячеек и поэтому не должна окрашиваться вместе в одном образце.
    5. Уменьшите температуру до 300 × g, 4 °C в течение 5 минут и удалите надосадочную жидкость. Промойте тимоциты 150 μL ледяного PBS/0,2% BSA/0,1% NaN3 буфера и уменьшите при 300 × г, 4 °C в течение 5 минут.
    6. Окрашивание DN-панелью и ISP/DP/SP панелью соответствующего лин-окрашивания на 30 мин на льду в темноте. Уменьшите температуру до 300 × g, 4 °C в течение 5 минут и удалите надосадочную жидкость. Промойте тимоциты 150 μL ледяного PBS/0,2% BSA/0,1% NaN3 буфера и уменьшите при 300 × г, 4 °C в течение 5 минут.
  3. Подготовьте клетки к измерению проточной цитометрии путем гомогенизации с помощью пробирки клеточного фильтра длиной 35 мкм и введения в буфер PBS/0,2% BSA/0,1% NaN3 . Защищайте клетки от света и держите на льду до и во время измерения проточного цитометра.
    Примечание: NaN3 (азид натрия) очень токсичен и смертелен. Особую осторожность следует проявлять при работе с этим веществом. Тщательно вымойте руки после обработки и немедленно позвоните в токсикологический центр или к врачу в случае проглатывания NaN3 .

3. Измерение проточным цитометром

ПРИМЕЧАНИЕ: Неопытным пользователям следует сначала пройти обучение по проточному цитометру, так как измерение сигнала mTurquoise2 в сочетании с несколькими другими флуорохромами требует опыта и компетентного планирования эксперимента. Информацию о проточном цитометре см. в Таблице материалов .

  1. Запустите проточный цитометр в соответствии с инструкцией пользователя или другим установленным протоколом. Проверьте и, при необходимости, отрегулируйте набор полосового фильтра в проточном цитометре для оптимальной стратегии обнаружения флуоресценции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемый фильтр для mTurquoise2 составляет 470/20 нм на ультрафиолетовой 405 нм, 407 нм или менее распространенной лазерной линии 440 нм.
  2. Откалибруйте проточный цитометр, установив настройки компенсации с помощью компенсационных шариков и стабильно трансфицированных клеток 293T, экспрессирующих mTurquoise2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо компенсационных бусин можно использовать тимоциты с однократным окрашиванием. В этом случае компенсация бусинами была столь же эффективной и более удобной, чем с помощью ячеек.
    1. Пометьте бусины каждым отдельным флуорохромом, использованным в эксперименте, и включите в них неокрашенные бусины. Измерьте шарики, чтобы настроить панель настройки компенсации, и измерьте клетки 293T, экспрессирующие mTurquoise2, поскольку нет подходящего флуорохрома для mTurquoise2, который можно было бы использовать на шариках. Сохраните настройки компенсации для использования в реальном эксперименте.
      Примечание: Клетки, экспрессирующие mTurquoise2, используемые для настройки компенсации, должны быть такими же яркими или ярче, чем тимоциты, экспрессирующие mTurquoise2 в реальном эксперименте. Убедитесь, что в нем также присутствуют mTurquoise2-отрицательные 293T-клетки.
    2. Для эксперимента включите окрашенные флуоресценцией минус один (FMO) тимоциты Tg/Tg, включая wt-образец для mTurquoise2 FMO и неокрашенный образец тимоцитов каждого генотипа мыши в качестве положительного контроля для анализируемой части.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти элементы управления важны для правильной настройки стробов для положительных клеток. Остальные экспериментальные образцы окрашиваются с помощью комплектной окрашивающей панели (табл. 1).
      1. Создайте эксперимент, добавьте и назовите количество пробирок в программном обеспечении проточного цитометра, а также создайте диаграммы рассеяния для визуализации окрашенных клеток для полного набора флуорохромов.
      2. Примените к эксперименту ранее установленные настройки компенсации. Отрегулируйте прямое рассеяние (FSC) и боковое рассеяние (SSC) с неокрашенными wt тимоцитами до тех пор, пока на диаграмме рассеяния не будет видна полная популяция клеток. Сначала измерьте неокрашенные тимоциты, экспрессирующие Tg/Tg mTurquoise2, чтобы убедиться, что положительная популяция видна.
      3. Измерьте полностью окрашенный образец тимоцитов Tg/Tg и проверьте наличие всех комбинаций флуорохромов. При необходимости отрегулируйте ранее установленные значения компенсации для флуорохромов, которые показывают неправильную компенсацию. Измерьте остальные экспериментальные образцы и не регулируйте никаких настроек во время измерения образцов.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Последующая корректировка компенсации также может быть выполнена в программном пакете для анализа. Хотя количество доступных ячеек может быть ограничивающим фактором, рекомендуется выполнить этот шаг во время измерения. Для сравнения значений интенсивности mTurquoise2 установите одинаковые настройки между всеми образцами.

4. Проточный цитометрический анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Проточный цитометрический анализ проводился с использованием специального программного обеспечения, указанного в Таблице материалов; Тем не менее, доступны и другие программы проточного цитометрического анализа.

  1. Гейт живых клеток и субпопуляций тимоцитов в соответствии со значениями FSC и SSC.
  2. Проверьте настройки компенсации в диалоговом окне матрицы компенсации , расположенном слева от образца, чтобы убедиться в отсутствии интерференции флуорохрома и в том, что была произведена надлежащая компенсация во избежание перетекания или просвечивания.
    1. Если матрица, определенная для сбора данных, должна быть скорректирована, измените значения в матрице компенсации, просто увеличив или уменьшив значение компенсации каждой комбинации флуорохрома таким образом, чтобы популяция не показывала почти идеальную горизонтальную или вертикальную линию (дополнительный рисунок 1B).
  3. Чтобы визуально распределить интенсивность mTurquoise2 для правильного положительного стробирования, измените отображение по оси X mTurquoise2 на линейное (дополнительный рисунок 2).
    1. Используйте регулятор mTurquoise2 FMO в качестве отрицательного регулятора для стробирования положительного сигнала mTurquoise2. Проверьте правильное пороговое стробирование для популяции клеток (рисунок 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Контрольные ячейки (wt) mTurquoise2 FMO не имеют маркера mTurquoise2 и, следовательно, могут использоваться в качестве фонового порога для активности репортера Axin2.
  4. Gate mTurquoise2-положительные клетки с соответствующим каналом детектирования для определения количества Wnt-положительных клеток.
  5. Вычислите среднее геометрическое и медиану, чтобы определить величину интенсивности флуоресценции в интересующих клетках.
    1. Нажмите на Статистика | Добавьте статистику внутри панели, показывающую mTurquoise2-положительные клетки.
    2. Определите статистический метод, интересующую популяцию и канал обнаружения mTurquoise2 и нажмите кнопку Добавить. Представьте среднее геометрическое и медианную интенсивность флуоресценции в условных единицах (AU) для построения графиков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Медиана представляет собой среднее значение интенсивности флуоресценции и, следовательно, предоставляет информацию о сдвиге интенсивности флуоресцентной популяции. При необходимости коррекция фона может помочь получить более четкую визуализацию динамического диапазона активности репортера mTurquoise2. Это можно сделать путем вычитания частот фонового окрашивания wt из общей частоты mTurquoise2-положительных клеток конкретного типа клеток, которые забиты.

5. Подготовка цитоспинов тимоцитов к конфокальной визуализации

ПРИМЕЧАНИЕ: Цитоспины тимоцитов рекомендуются при работе с клеточными суспензиями неадгезивных клеток. Поскольку экспрессия Axin2-mTurquoise2 в тимоцитах ниже, чем в эпителиальных клетках тимуса, для визуализации использовали отфильтрованные суспензии клеток тимоцитов.

  1. Начните с клеточной суспензии из свежесобранных или замороженных тимоцитов. Суспендируйте ~20 000 тимоцитов в 100 мкл холодного PBS/0,5% BSA/10% FCS на генотип тимоцитов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости аккуратно размораживайте клетки, чтобы сохранить максимальную жизнеспособность клеток при работе с ранее замороженными тимоцитами. Это поможет снизить аутофлуоресценцию при визуализации клеток. Проверьте жизнеспособность клеток, чтобы убедиться в качестве образца. При процедуре цитоспина используется механическая сила, адаптированная к хрупкому тимоциту; Тем не менее, для этого требуется очень жизнеспособная начальная популяция. Чтобы обеспечить более высокую жизнеспособность, рекомендуется начинать со свежесобранных, а не замороженных тимоцитов.
  2. Предварительно смочите область вокруг отверстия фильтрующих карт с помощью PBS. Соберите держатель камеры для образцов цитоспина в соответствии с инструкцией (рисунок 1C).
    1. Поместите карту фильтра на предметное стекло (гладкой стороной против предметного стекла). Поместите оба предмета на держатель камеры для образцов. Позаботьтесь о том, чтобы поместить фильтровальную карту точно в отверстие держателя камеры для образцов, а весь держатель камеры для образцов поместите в ротор.
  3. Тщательно ресуспендируйте тимоциты и добавьте 100 мкл клеточной суспензии в камеры для образцов. Вращайте суспензию тимоцитов в течение 4 мин при ~350 × г на предметных стеклах. Осторожно снимите фильтрующую карту с предметного стекла, не касаясь ячеек. Высушите цитоспины на воздухе в течение от 1 часа до ночи при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с другими типами клеток проверяйте различную плотность клеток для достижения оптимальных результатов. Цитоспины можно замораживать при температуре -20 °C в герметичной коробке для последующих экспериментов. Разморозьте цитоспины для дальнейшей обработки в течение 1 ч при комнатной температуре.

6. Иммуноокрашивание цитоспином с общим β-катенином

  1. Зафиксируйте цитоспины на 15 мин при комнатной температуре в 100% метаноле. Высушите слайды на воздухе в течение 10 минут при комнатной температуре. Нарисуйте круг вокруг популяции тимоцитов на предметном стекле с помощью гидрофобной ручки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап фиксации оптимизирован специально для окрашивания β-катенином.
  2. Поместите предметные стекла в PBS/0,05% Tween-20 на 10 минут при комнатной температуре, а затем перенесите их в темную влажную коробку на этапах блокировки и инкубации. Добавьте 100 μл PBS/10% нормальной сыворотки мыши (NMS) на предметное стекло и оставьте во влажной коробке на 10 минут при комнатной температуре. Коснитесь предметного стекла, чтобы удалить 10% NMS, добавьте 100 μL PBS/10% обычной козьей сыворотки (NGS) на предметное стекло и оставьте во влажной коробке на 30 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация с PBS/10% NMS блокирует связывание неспецифических первичных антител (Рисунок 1D), в то время как PBS/10% NGS блокирует связывание неспецифических вторичных антител.
  3. Подготовьте дополнительные антитела для клеточного окрашивания. Смешайте 0,5 мкг общего антитела к β-катенину с фрагментами, меченными AF568.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этих условиях коммерчески доступный набор для мечения первичного антимышиного общего β-катенина вторичными фрагментами IgG1 Fab козьего антимышиного типа с флуорохромной меткой Alexa Fluor 568 (AF568) перед добавлением его в тимоциты. Выполняйте маркировку в соответствии с протоколом производителя, так как может потребоваться проверка нескольких концентраций. Используйте общее антитело, меченное β-катенин-AF568, в течение 30 минут.
  4. Добавьте 50 мкл (0,5 мкг) от общего количества антител, меченных β-катенин-AF568, на предметное стекло цитоспина в течение ночи при 4 °C во влажной коробке. Включите контроль отрицательного окрашивания в соответствии с протоколом производителя или контроль изотипа в случае протокола прямой маркировки.
  5. Стирать в течение 20 минут с PBS/0,05% Tween-20 при комнатной температуре. Затем промыть в течение 20 мин с PBS при комнатной температуре в банке с помешиванием. Выполните второй этап фиксации для обеспечения связывания антитела с антигеном: 10 мин при комнатной температуре со 100 мкл 4% параформальдегида (PFA) в PBS во влажной коробке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Храните слайды в темноте. Ни метанол, ни фиксация PFA не оказывают существенного влиянияна экспрессию mTurquoise227.
  6. Окуните слайды в PBS. Провести ядерное окрашивание 50 μл TO-PRO-3 (1:1500) в течение 10 минут при комнатной температуре во влажном боксе. Вымыть предметные стекла в течение 20 мин PBS при комнатной температуре в банке при помешивании.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрацию TO-PRO3 можно титровать в зависимости от использования других флуорохромов с близкими флуоресцентными спектрами.
  7. Заделайте образцы с реагентом против выцветания в соответствии с протоколом производителя и накройте покровным стеклом. Сушить на воздухе в течение 24 часов при комнатной температуре. Просматривайте слайды непосредственно под флуоресцентным или конфокальным микроскопом или храните при температуре -20 °C для последующей визуализации.

7. Конфокальные микроскопические измерения

ПРИМЕЧАНИЕ: Информацию о конфокальном микроскопе см. в Таблице материалов .

  1. Включите конфокальный микроскоп в соответствии с инструкцией или установленным протоколом. Используйте отрицательные и положительные элементы управления клеточной линией mTurquoise2 293T для первичной регулировки конфокальных настроек. Затем используют тимоциты Axin2-mTurquoise2 и Tg/Tg (нокаут) Axin2-mTurquoise2 в качестве отрицательного и положительного контроля, соответственно, чтобы гарантировать недопущение недостаточной экспозиции сигнала mTurquoise2.
  2. Подготовьте программное обеспечение для последовательного сканирования, запрограммировав лазеры и ширину фильтров. Начните с лазерной линии с самой высокой длиной волны и двигайтесь к самой низкой длине волны. После установки всех этапов последовательного сканирования загрузите образец на предметный столик микроскопа, сфокусируйте образец и нажмите кнопку Live для оптимизации мощности лазера и интеллектуального усиления с помощью соответствующих кнопок на конфокальном программном обеспечении или дополнительной ручной панели.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образец предметного стекла не следует визуализировать для количественного определения сигнала, так как потенциально может произойти потенциальное фотообесцвечивание. Тем не менее, mTurquoise2 обладает высокойфотостабильностью 25.
  3. В случае очень низкой экспрессии mTurquoise2 увеличьте мощность лазера и Smart Gain до тех пор, пока не будет наблюдаться флуоресцентный сигнал, и проверьте с помощью отрицательного контрольного образца, чтобы убедиться в истинном положительном сигнале. Визуализируйте тимоциты с помощью масляной линзы 40x 1,4, масляной линзы 63x 1,4 или масляной линзы 100x 1,4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого исследования использовался микроскоп Leica SP5.
  4. Используйте эти настройки конфокальной визуализации на микроскопе перед измерением образца.
    1. Настройте диапазон значений интенсивности на 12-битное изображение, нажав на Конфигурация | Настройки | измените значение на 12-битное в опции Битовая глубина , чтобы создать более широкую шкалу интенсивности и, таким образом, большее различие между низкими и высокими флуоресцентными сигналами.
    2. Отрегулируйте разрешение изображения, нажав на XY, и увеличьте Формат до 1024 x 1024, что также удвоит время сканирования. Отрегулируйте скорость сканирования на 400-600 Гц, нажав на Скорость | Более того , можно вручную изменить настройки. Кроме того, активируйте опцию Двунаправленное сканирование.
    3. Отрегулируйте ползунок чувствительности, чтобы уменьшить фоновый сигнал. Оптимизируйте правильную мощность лазера и интеллектуальное усиление с помощью опции Quick LUT (Look-Up Table).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В 12-битном изображении ползунок имеет значение интенсивности шкалы серого от 0 до 4095. Это также можно сделать позже с помощью бесплатного оффлайн программного обеспечения Las X. Зеленым цветом будет показан черный фон, а синим цветом будут показаны насыщенные пиксели образца.
  5. Когда все настройки изображения будут оптимизированы, измерьте образец, нажав кнопку «Пуск», что запустит последовательное изображение всех трех каналов.
    1. Измерьте ядерный флуоресцентный сигнал TO-PRO-3. Детектирование TO-PRO-3 с помощью лазера 633 нм и HyD 640-750 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этой конфигурации использовалось 6% мощности лазера при 15% интеллектуального усиления. Эта настройка может меняться в зависимости от интенсивности окрашивания TO-PRO-3. Если он очень яркий, он может влиять на флуорохромы более низкой интенсивности при перевозбуждении. В таком случае уменьшите концентрацию окрашивания.
    2. Измерьте ядерные и цитоплазматические флуоресцентные сигналы β-катенина. Детектирование β-катенина с помощью лазера 561 нм и HyD 580-605 нм. Накапливайте до 2 сканов для одного изображения, регулируя настройку в блоке XY в программном обеспечении со средним значением строки 2 в случае низкого сигнала AF568.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этой конфигурации использовалось 85% мощности лазера при 87% интеллектуального усиления.
    3. Измерьте цитоплазматический флуоресцентный сигнал mTurquoise2. Детектирование mTurquoise2 с помощью лазера с длиной волны 458 нм и HyD с длиной волны 490-600 нм. Накапливайте до 4 сканов для одного изображения, регулируя настройку в поле XY в программном обеспечении со средним значением строки 4 в случае низкого сигнала mTurquoise2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за старых лазеров на конфокальном микроскопе, используемого для этого протокола, и низкого сигнала mTurquoise2, 405 нм использовалась при 90% мощности лазера, наряду с лазерами 458 нм и 476 нм при 100% мощности лазера с HyD 490-550 нм при 100% интеллектуальном усилении. Наиболее оптимальным является лазер с длиной волны 440 нм, хотя и реже присутствующий на конфокальном микроскопе. С высокой мощностью лазера следует обращаться осторожно и выполнять только с помощью последовательной визуализации. Убедитесь, что установлены аварийные настройки, чтобы избежать передержки датчика. Мощность лазера на других конфокальных микроскопах может быть ниже предложенных в этом протоколе из-за более мощных или новых лазеров. Перед получением изображения можно провести тест на обесцвечивание, чтобы убедиться в отсутствии потери флуоресцентного сигнала. В предложенной конфигурации фотообесцвечивание mTurquoise2 было приемлемым.
    4. Выполняйте визуализацию в светлом поле для полной визуализации клеток. Детектируйте тимоциты с помощью лазера с длиной волны 488 нм и PMT Scan-DIC. Экспортируйте файлы Lif для анализа изображений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этой конфигурации использовалось 59% мощности лазера с коэффициентом усиления 212 В и смещением данных -4,3%. Файлы Lif могут быть прочитаны в автономном программном обеспечении LAS x для коррекции изображений.

8. Конфокальный микроскопический анализ

  1. Анализируйте изображения с помощью программного обеспечения для обработки изображений28 (Дополнительный рисунок 3). Загрузите изображения в программу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Допускаются различные форматы, но рекомендуется использовать файлы TIFF с таблицей LUT или прямой импорт файлов Lif в программное обеспечение для обработки изображений.
  2. Измерьте активный сигнал β-катенина в ядрах тимоцитов.
    1. Выберите ядра окрашенных TO-PRO-3 тимоцитов на красно-сером изображении для анализа активного β-катенина. Сделайте это вручную, или воспользуйтесь автоматическим выбором ячеек в программном обеспечении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для автоматического выбора клеток может потребоваться обработка изображений для правильного определения пороговых значений и анализа частиц. Ручной выбор ячеек может быть трудоемким, но, как правило, не требует какой-либо обработки изображений и рекомендуется в этом протоколе.
    2. Активируйте ручной выбор с помощью любого из инструментов выбора на рабочей панели.
      1. Выберите контур ядра и добавьте его в диспетчер областей интереса (ROI). Активируйте менеджер ROI, нажав на кнопку «Анализ» | Инструменты | Менеджер ROI, и когда откроется новое окно менеджера ROI, нажмите на первую опцию Добавить (t) или используйте сочетание клавиш t. Повторяйте предыдущий шаг до тех пор, пока все ядра не будут определены и добавлены в менеджер ROI. Используйте опцию Показать все в менеджере ROI для визуализации выбранных ячеек.
    3. Выберите >3 области фона, в которых нет ячеек, и добавьте их в менеджер ROI.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размер и форма в данном случае не имеют значения. Эти области будут служить для измерения фонового шума для окончательного расчета.
      1. Определите измерение на изображении, нажав на кнопку «Анализ» | Установите мерки. В открывшемся новом окне с различными параметрами измерения активируйте Площадь, Интегрированную плотность и Среднее значение серого | нажмите «ОК».
      2. Активируйте изображение с серым значением β-катенина, щелкнув по нему, и визуализируйте выбранные ядра и области фона, нажав на кнопку «Показать все » в менеджере ROI. Наблюдайте за всеми выделенными областями, которые теперь видны на изображении с β-катенином.
      3. Нажмите на «Измерить » в менеджере ROI или нажмите на «Анализ» | Измерьте. Обратите внимание на новое окно «Результаты », в котором отображаются результаты сигнала β-катенина в пределах ROI.
      4. Перенесите результаты в программу для расчетов электронных таблиц, нажав на кнопку «Правка» | Выберите все; и скопируйте/вставьте список в таблицу для дальнейшего расчета. Сохраните менеджер ROI для дальнейшего использования без необходимости повторять выбор ядер, нажав на Еще | Спасать....
    4. Для автоматического выбора ячеек сделайте дубликаты (Ctrl D) обрабатываемого изображения, так как многие настройки обработки изображения нельзя отменить.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Автоматизированная маркировка ядер в большинстве случаев требует обработки изображений для автоматического и точного определения ядер. Обработка изображения должна выполняться только в целях выделения области. Обработанные изображения бесполезны для измерения интенсивности флуоресцентной лампы, поскольку значения пикселей изменяются.
      1. Выполните фильтр по Гауссу, нажав на Процесс | Фильтры | Размытие по Гауссу для сглаживания изображения. Протестируйте несколько значений сигма (радиус) и активируйте опцию предварительного просмотра, чтобы визуализировать эффект, прежде чем нажать OK.
      2. Инвертируйте изображение, нажав на Редактировать | Инвертировать. Проверьте яркость и контрастность, нажав на Изображение | Настройка | Яркость/контрастность. Используйте опцию Авто или, что предпочтительнее, вручную измените значения.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Не применяйте изменения, так как это приведет к изменению свойств изображения. Просто закройте окно B&C , когда желаемое изображение будет получено.
      3. Создайте порог, нажав на Изображение | Настройка | Порог и определите наилучшие настройки порога, при которых все ячейки будут наиболее заметны. Нажмите « Применить », чтобы применить настройки порога.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если пороговое значение не было применено к ячейкам, в которых видны отверстия, нажмите на кнопку Обработать | Двоичный | Заполните отверстия , чтобы заполнить пробелы внутри ячеек. Если ячейки объединены вместе с настройками порога, нажмите на Процесс | Двоичный | Водораздел для разделения этих клеток. Тонкая линия в 1 пиксель разделит любую ячейку, которую программа интерпретирует как слитую.
      4. Определите наименьшее и самое большое ядро на изображении, вручную выбрав выбранное ядро с помощью инструмента Произвольное выделение , добавьте его в менеджер ROI и измерьте Площадь.
      5. Проанализируйте частицы (ядра), нажав на кнопку «Анализировать» | Проанализируйте частицы и вставьте самую маленькую и самую большую площади в поле Размер (^2) с дефисом (-) между ними. Активируйте поля Отображать результаты, Добавить в менеджер и Исключить по краям , прежде чем нажать OK . Перейдите к шагу 8.2.3, чтобы завершить протокол.
  3. Измерьте цитоплазматические сигналы mTurquoise2 и β-катенина в тимоцитах.
    1. Выберите контур цельных тимоцитов на светлопольном изображении, выполнив те же действия, что и выше.
    2. Выберите >3 области фона, в которых нет ячеек, и добавьте их в менеджер ROI.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размер и форма в этом случае не имеют значения. Эти области будут служить для измерения фонового шума для окончательного расчета.
      1. Активируйте изображение с серым значением mTurquoise2, щелкнув по нему, и визуализируйте выбранные общие ROI ячеек и области фона, нажав на «Показать все » в менеджере ROI. Наблюдайте за всеми выделенными областями, которые видны на изображении mTurquoise2.
      2. Нажмите на «Измерить » в менеджере ROI или нажмите на «Анализ» | Измерьте. Обратите внимание на новое окно результатов , которое открывается с результатами измерений сигнала mTurquoise2.
      3. Перенесите результаты в программу для расчетов электронных таблиц, нажав на кнопку «Правка» | Выберите все и скопируйте/вставьте список в таблицу для дальнейшего расчета.
      4. Активируйте изображение серого цвета β-катенина, щелкнув по нему, и визуализируйте выбранные общие ROI ячеек и области фона, нажав на кнопку «Показать все » в менеджере ROI. Наблюдайте за всеми выделенными областями, которые видны на изображении с β-катенином.
      5. Нажмите на «Измерить » в менеджере ROI или нажмите на «Анализ» | Измерьте. Обратите внимание на новое окно «Результаты », которое открывается с результатами измерения общего сигнала клеточного β-катенина.
      6. Перенесите результаты в программу для расчетов электронных таблиц, нажав на кнопку «Правка» | Выберите все и скопируйте/вставьте список в таблицу для дальнейшего расчета. Сохраните менеджер ROI для дальнейшего использования без необходимости повторять выбор ячеек, нажав на Еще | Спасать....
  4. Рассчитайте скорректированную общую ядерную флуоресценцию (CTNF) для активного β-катенина, используя уравнение 1.
    CTNF = Интегрированная плотность - (Площадь × среднее от средних фоновых площадей) (1)
  5. Рассчитайте скорректированную общую флуоресценцию клеток (CTCF) для mTurquoise2, используя уравнение 2.
    CTCF = Интегрированная плотность - (Площадь × среднее от средних фоновых площадей) (2)
  6. Дифференцируйте активный ядерный β-катенин и цитоплазматический β-катенин путем вычитания значений ядерного β-катенина, полученных на шаге 8.2.3.3. Из общих значений клеточного β-катенина, полученных на шаге 8.3.2.5, получить цитоплазматический неактивный β-катенин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что измерения выполняются в пределах одной ячейки.
    1. Вычислите среднее значение Средней интенсивности фоновых областей. Рассчитаем CTNF и CTCF с помощью уравнений 1 и 2. Рассматривайте IntDen (сумму всех пикселей в выбранной области) в качестве интегрированной плотности, а не RawIntDen.
    2. При необходимости рассчитайте стандартное отклонение значений IntDen для построения графиков. Рассмотрим до 200 отдельных ячеек для статистического анализа с помощью U-критерия Манна-Уитни.
  7. Отобразите результаты на графике отдельных точек данных и обозначьте ось y значениями CTNF или CTCF как относительные флуоресцентные единицы (RFU).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Для исследования роли канонической передачи сигналов Wnt была протестирована каноническая репортерная модель Wnt Axin2-mTurquoise2 в сочетании с экспрессией белка β-катенина. Тимоциты, как известно, хрупки, демонстрируют низкую каноническую передачу сигналов Wnt на нескольких ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Доступно несколько канонических репортеров Wnt с различной чувствительностью репортеров и фактическими репортерными белками. Репортерные модели с использованием синтетически введенных мультимеризованных сайтов связывания TCF/LEF доступны с флуоресцентными репортер?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана грантом Лейденского университета для профилирования области регенеративной медицины для разработки новых моделей мышей.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
BD FACScantoII flow cytometerBD Biosciencesnot aplicableSerial number V96300710. The flow cytometer setup in this protocol contains a 405 nm laser line with 505 longpass filter and 530/30 nm bandpass filter, and 470/20 nm bandpass filter; a 488 nm laser with 735 nm longpass filter and 780/60 nm bandpass filter, 670 nm longpass filter and 655 nm longpass filter, 610 nm longpass filter, 550 nm longpass filter and 575/26 nm bandpass filter, 505 nm longpass filter and 530/30 nm bandpass filter, and 488/10 nm bandpass filter; and a 633 nm laser line with 735 nm longpass filter and 780/60 nm bandpass filter, 685 nm longpass filter, and 660/20 nm bandpass filter.
BSA Sigma A9647
Corning 70 μm cell strainer Falcon/Corning 352350
Cytospin 4 Type A78300101Thermo Scientificnot aplicable 
DMSOSigma Aldrich D5879-1L
DNAse ISigma A9647
Falcon 50 mL Conical Centrifuge tubesGreiner bio-one227261
Falcon round-bottom Polystyrene Test tubes with cell strainer snap capFisher Scientific 352235
Fetal Calf Serum (FCS)Greiner Bio-One B.V. not aplicable Depends on origin
Fiji software ImageJnot aplicable Version 1.53
Filter card white (for cytospin)VWRSHAN5991022
FlowJo 10 softwareTreestarnot aplicable Version 10.5.3
Frost slides Klinipath
Gibco IMDM medium Fisher Scientific 12440053
HCX PL APLO 40x 1.4 OIL lensLeica microsystems not aplicable 
Hydrophobic pen: Omm Edge pen Vectornot aplicable 
Leica TCS SP5 DMI6000Leica microsystems not aplicable The microscope setup in this protocol consisted of an HCX PL APO 40x/1.2 oil-immersion objective with 8-bit resolution, 1024 pixels x 1024 pixels, 400 Hz speed, pinhole 68 µm, and zoom factor of 1.5 at room temperature. This system contains a 405 diode laser, argon laser, DPSS 561 laser, HeNe 594 laser and HeNe 633 laser with 4 hybrid detectors (HyDs) and 5 photomultiplier tubes (PMTs). 
Methanol VWR1060091000
NaN3/sodium azideHospital farmacynot aplicable 
Normal mouse serumOwn micenot aplicable 
PBS LonzaBE17-517Q
ProLong Diamond Antifade MountantFisher Scientific P36965
Purified mouse anti-β-catenin (CTNNB1)BD Biosciences610154
TO-PRO-3 IodideThermofisherT3605
Transparent nailpolishat any drugstorenot aplicable 
Tween-20Sigma Aldrich P1379-500ml 
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 labeling kitThermofisherZ25006

Ссылки

  1. Kahn, M. Can we safely target the WNT pathway. Nature Reviews. Drug Discovery. 13 (7), 513-532 (2014).
  2. Jung, Y. S., Park, J. I. Wnt signaling in cancer: therapeutic targeting of Wnt signaling beyond beta-catenin and the destruction complex. Experimental & Molecular Medicine. 52 (2), 183-191 (2020).
  3. Gao, K., Zhang, T., Wang, F., Lv, C. Therapeutic Potential of Wnt-3a in neurological recovery after spinal cord injury. European Neurology. 81 (3-4), 197-204 (2019).
  4. Jia, L., Pina-Crespo, J., Li, Y. Restoring Wnt/beta-catenin signaling is a promising therapeutic strategy for Alzheimer's disease. Molecular Brain. 12 (1), 104(2019).
  5. Bae, S. M., Hong, J. Y. The Wnt signaling pathway and related therapeutic drugs in autism spectrum disorder. Clinical Psychopharmacology and Neuroscience. 16 (2), 129-135 (2018).
  6. Tajer, P., Pike-Overzet, K., Arias, S., Havenga, M., Staal, F. J. T. Ex vivo expansion of hematopoietic stem cells for therapeutic purposes: Lessons from development and the niche. Cells. 8 (2), 169(2019).
  7. Yanai, K., et al. Crosstalk of hedgehog and Wnt pathways in gastric cancer. Cancer Letters. 263 (1), 145-156 (2008).
  8. Blank, U., et al. An in vivo reporter of BMP signaling in organogenesis reveals targets in the developing kidney. BMC Developmental Biology. 8, 86(2008).
  9. Duncan, A. W., et al. Integration of Notch and Wnt signaling in hematopoietic stem cell maintenance. Nature Immunology. 6 (3), 314-322 (2005).
  10. Jho, E. H., et al. Wnt/beta-catenin/Tcf signaling induces the transcription of Axin2, a negative regulator of the signaling pathway. Molecular and Cellular Biology. 22 (4), 1172-1183 (2002).
  11. Lustig, B., et al. Negative feedback loop of Wnt signaling through upregulation of conductin/Axin2 in colorectal and liver tumors. Molecular and Cellular Biology. 22 (4), 1184-1193 (2002).
  12. Bernkopf, D. B., Hadjihannas, M. V., Behrens, J. Negative-feedback regulation of the Wnt pathway by conductin/axin2 involves insensitivity to upstream signalling. Journal of Cell Science. 128 (1), 33-39 (2015).
  13. Vassar, R., Rosenberg, M., Ross, S., Tyner, A., Fuchs, E. Tissue-specific and differentiation-specific expression of a human K14 keratin gene in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (5), 1563-1567 (1989).
  14. DasGupta, R., Fuchs, E. Multiple roles for activated LEF/TCF transcription complexes during hair follicle development and differentiation. Development. 126 (20), 4557-4568 (1999).
  15. Maretto, S., et al. Mapping Wnt/beta-catenin signaling during mouse development and in colorectal tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (6), 3299-3304 (2003).
  16. Mohamed, O. A., Clarke, H. J., Dufort, D. beta-catenin signaling marks the prospective site of primitive streak formation in the mouse embryo. Developmental Dynamics. 231 (2), 416-424 (2004).
  17. Moriyama, A., et al. GFP transgenic mice reveal active canonical Wnt signal in neonatal brain and in adult liver and spleen. Genesis. 45 (2), 90-100 (2007).
  18. Currier, N., et al. Dynamic expression of a LEF-EGFP Wnt reporter in mouse development and cancer. Genesis. 48 (3), 183-194 (2010).
  19. Ferrer-Vaquer, A., et al. A sensitive and bright single-cell resolution live imaging reporter of Wnt/beta-catenin signaling in the mouse. BMC Developmental Biology. 10, 121(2010).
  20. Jho, E. H., et al. Wnt/beta-catenin/Tcf signaling induces the transcription of Axin2, a negative regulator of the signaling pathway. Molecular and Cellular Biology. 22 (4), 1172-1183 (2002).
  21. de Roo, J. J. D., et al. Axin2-mTurquoise2: A novel reporter mouse model for the detection of canonical Wnt signalling. Genesis. 55 (10), (2017).
  22. van de Moosdijk, A. A. A., van de Grift, Y. B. C., de Man, S. M. A., Zeeman, A. L., van Amerongen, R. A novel Axin2 knock-in mouse model for visualization and lineage tracing of WNT/CTNNB1 responsive cells. Genesis. 58 (9), 23387(2020).
  23. Choi, Y. S., et al. Distinct functions for Wnt/beta-catenin in hair follicle stem cell proliferation and survival and interfollicular epidermal homeostasis. Cell Stem Cell. 13 (6), 720-733 (2013).
  24. Nolan, G. P., Fiering, S., Nicolas, J. F., Herzenberg, L. A. Fluorescence-activated cell analysis and sorting of viable mammalian cells based on beta-D-galactosidase activity after transduction of Escherichia coli lacZ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (8), 2603-2607 (1988).
  25. Goedhart, J., et al. Structure-guided evolution of cyan fluorescent proteins towards a quantum yield of 93. Nature Communications. 3, 751(2012).
  26. Bernkopf, D. B., Bruckner, M., Hadjihannas, M. V., Behrens, J. An aggregon in conductin/axin2 regulates Wnt/beta-catenin signaling and holds potential for cancer therapy. Nat Commun. 10 (1), 4251(2019).
  27. Joosen, L., Hink, M. A., Gadella, T. W., Goedhart, J. Effect of fixation procedures on the fluorescence lifetimes of Aequorea victoria derived fluorescent proteins. Journal of Microscopy. 256 (3), 166-176 (2014).
  28. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  29. Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Reviews. 11, 227-256 (2005).
  30. Henriksson, J., et al. Endrov: an integrated platform for image analysis. Nature Methods. 10 (6), 454-456 (2013).
  31. Hedgepeth, C. M., et al. Activation of the Wnt signaling pathway: a molecular mechanism for lithium action. Developmental Biology. 185 (1), 82-91 (1997).
  32. Sato, N., Meijer, L., Skaltsounis, L., Greengard, P., Brivanlou, A. H. Maintenance of pluripotency in human and mouse embryonic stem cells through activation of Wnt signaling by a pharmacological GSK-3-specific inhibitor. Nature Medicine. 10 (1), 55-63 (2004).
  33. Ring, D. B., et al. Selective glycogen synthase kinase 3 inhibitors potentiate insulin activation of glucose transport and utilization in vitro and in vivo. Diabetes. 52 (3), 588-595 (2003).
  34. Liu, C., et al. Control of beta-catenin phosphorylation/degradation by a dual-kinase mechanism. Cell. 108 (6), 837-847 (2002).
  35. Zeng, X., et al. Initiation of Wnt signaling: control of Wnt coreceptor Lrp6 phosphorylation/activation via frizzled, dishevelled and axin functions. Development. 135 (2), 367-375 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Wnt2 mTurquoise2WntWnt

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены