Durchflusszytometrie und konfokale bildgebende Analyse niedriger Wnt-Expression in Axin2-mTurquoise2-Reporter-Thymozyten

Zusammenfassung

Es ist bekannt, dass die Signalträger das Zellschicksal regulieren, was darauf hindeutet, dass die Regulation des Wnt-Signalwegs ein interessantes therapeutisches Ziel darstellt. In dieser Arbeit beschreiben wir Durchflusszytometrie und konfokale Mikroskopie-Analysemethoden für ein robustes murines kanonisches Wnt-Signalreportermodell, das unterschiedliche Wnt-Signalgebungsniveaus misst.

Zusammenfassung

Die Messung der Wnt-Expressionsniveaus ist unerlässlich, wenn es darum geht, neue therapeutische Ziele für Wnt zu identifizieren oder zu testen. Frühere Studien haben gezeigt, dass die kanonische Wnt-Signalgebung über einen dosisgesteuerten Mechanismus funktioniert, was die Notwendigkeit motiviert, die Wnt-Signalgebung in verschiedenen Zelltypen zu untersuchen und zu messen. Obwohl mehrere Reportermodelle vorgeschlagen wurden, um die physiologische Wnt-Expression darzustellen, beeinflusste entweder der genetische Kontext oder das Reporterprotein die Validität, Genauigkeit und Flexibilität dieser Werkzeuge stark. In dieser Arbeit werden Methoden zur Erfassung und Analyse von Daten beschrieben, die mit dem Axin2-mTurquoise2-Maus-Wnt-Reportermodell erhalten wurden, das ein mutiertes Axin2^{em1Fstl-Allel} enthält. Dieses Modell ermöglicht die Untersuchung des endogenen kanonischen Wnt-Signalwegs in einzelnen Zellen über einen weiten Bereich der Wnt-Aktivität.

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Aktivität von Axin2-mTurquoise2-Reportern mithilfe der Zellpopulationsanalyse des hämatopoetischen Systems in Kombination mit Zelloberflächenmarkern oder intrazellulärer β-Catenin-Färbung vollständig erfasst werden kann. Diese Verfahren dienen als Grundlage für die Implementierung und Reproduktion in anderen Geweben oder Zellen von Interesse. Durch die Kombination von fluoreszenzaktivierter Zellsortierung und konfokaler Bildgebung können unterschiedliche kanonische Wnt-Expressionsniveaus sichtbar gemacht werden. Die empfohlenen Mess- und Analysestrategien liefern quantitative Daten über die Fluoreszenzexpressionsniveaus für eine präzise Beurteilung des kanonischen Wnt-Signalwegs. Diese Methoden sind nützlich für Forscher, die das Axin2-mTurquise2-Modell für kanonische Wnt-Expressionsmuster verwenden möchten.

Einleitung

Der kanonische Wnt-Signalweg ist ein konservierter Signalweg, der sowohl an der Homöostase von gesundem Gewebe als auch an Krankheiten beteiligt ist. Es hat sich gezeigt, dass eine präzise Regulation des Wnt-Signalwegs für die Embryonalentwicklung wichtig ist, aber auch in adulten Geweben von großer Bedeutung ist. Es wurde festgestellt, dass der kanonische Wnt-Signalweg eine wichtige Rolle bei der Geweberegeneration verschiedener Organe wie dem Darm, der Haut und dem hämatopoetischen System spielt. Wenn die Wnt-Signalübertragung dereguliert wird, treten daher schwere Pathologien auf. Darm-, Leber- und Hautkrebs, neurologische Erkrankungen sowie bestimmte hämatologische Malignome sind beispielhafte Pathologien, bei denen die deregulierte Wnt-Signalgebung der ursächliche Faktor oder Mitwirkende ist¹. Daher werden derzeit mehrere Inhibitoren für verschiedene Wnt-Ziele als Wnt-assoziierte Krebstherapeutika in klinischen Studien getestet².

Darüber hinaus gibt es interessante Fortschritte beim therapeutischen Potenzial von Wnt für die neurologische Genesung, altersbedingte neurologische Störungen und angeborene Autismus-Spektrum-Störungen ^3,4,5. Wnt-Signale wurden für die ex vivo-Expansion von Stammzellen für eine nachfolgende Transplantation untersucht⁶. Die therapeutische Ausrichtung des kanonischen Wnt-Signalwegs ist jedoch aufgrund seiner Bedeutung für viele grundlegende Zellfunktionen und seiner Wechselwirkung mit anderen Signalwegen ein schwieriges Unterfangen ^7,8,9, was dazu führt, dass die Wirkung dieser Wnt-Therapeutika in einem leicht zu interpretierenden Modell genau gemessen werden muss. Die kanonische Wnt-Signalgebung wird durch lösliche Wnt-Liganden mit kurzer Reichweite gesteuert, die von benachbarten Zellen oder als autokrine Ausscheidung sezerniert werden, wie in verschiedenen Wnt-responsiven Stammzelltypen berichtet wird.

Die Co-Rezeptoren des Wnt-Frizzled-Rezeptors und des Lipoprotein-Rezeptor-verwandten Proteins (LRP) sprechen auf diese Liganden an, was eine intrazelluläre Signalkaskade auslöst. Wenn der Wnt-Signalweg ausgeschaltet ist, verhindert ein Zerstörungskomplex, der aus dem Achseninhibitor (Axin), dem Tumorsuppressor-Genprodukt, adenomatösen Polyposis Coli (APC), Casein Kinase1 (CK1α) und der Glykogensynthase-Kinase (GSK-3β) besteht, die Akkumulation von β-Catenin (CTNNB1) durch proteasomalen Abbau. Bei der Bindung des Wnt-Liganden-Rezeptors wird der Zerstörungskomplex inaktiviert, was zu einer Akkumulation und Stabilisierung von β-Catenin im Zytoplasma führt. Das aktive β-Catenin kann in den Zellkern wandern, wo es an die Transkriptionsfaktoren des Transkriptionsfaktors/Lymphoid Enhancer-bindenden Faktors (TCF/LEF) bindet, um die Transkription von Wnt-Zielgenen zu initiieren. Axin2 wird als Zielgen angesehen, da es ein direktes Ziel des Wnt-Signalwegs¹⁰ ist. Darüber hinaus dient Axin2 als negativer Regulator sowie als Reportergen für den aktiven kanonischen Wnt-Signalweg^11,12.

Mehrere kanonische Wnt-Signalreporter wurden in der Literatur beschrieben und waren von großem Nutzen für das Verständnis der Rolle des Wnt-Signalwegs in der Embryonalentwicklung. Die meisten dieser Reporter verwenden synthetisch eingefügte TCF/LEF-Bindungsstellen, die kein endogenes Zielgen 13,14,15,16,17,18,19 verwenden. Zusätzlich wurden Axin2-Knock-in-Strategien verwendet, die die natürliche Lokalisation des Gens^{11,20,21,22,23} respektieren, von dem Axin2-LacZ allgemein als der robusteste kanonische Wnt-Reporter¹¹ akzeptiert wird. Das Reporterprotein LacZ, obwohl es in den meisten Geweben einfach zu verwenden ist, erfordert jedoch ein β-Galactosidase-Substrat, das für lebende Zellen als aggressiv gilt²⁴. Insbesondere für Stammzellen und Thymozyten erhöhen die rauen LacZ-Nachweisbedingungen den Zelltod (eigene nicht gemeldete Daten) beim Umgang mit Zellsuspensionen.

Obwohl die durch die LacZ-Färbung verursachte Signalverstärkung für die Detektion niedriger Signale geeignet ist, macht sie die Quantifizierung weniger direkt und damit wohl weniger zuverlässig. Daher wurde ein murines Reportermodell entwickelt, das die genetische Strategie von Axin2-LacZ nachahmt, jedoch mit einem mTurquoise2-Reporterprotein²¹, um eine Auslesung zu liefern, die direkter und näher an den physiologischen Expressionsniveaus liegt. Das fluoreszierende Protein mTurquoise2 ist aufgrund seiner hohen Helligkeit (Quantenausbeute (QY)= 0,93), seiner Flexibilität in Kombination mit anderen fluoreszierenden Proteinen für eine umfassende Charakterisierung der Zelloberfläche und des Fehlens eines exogenen Substrats ein hervorragender Ersatz für LacZ. Darüber hinaus bietet seine enge genetische Verwandtschaft mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) die Möglichkeit, die meisten GFP-erkennenden fluoreszierenden Antikörper für eine stärkere Signaldetektion zu verwenden, falls erforderlich, in extrem Wnt-empfindlichen Zellen²⁵.

Das Axin2-mTurquoise2-Modell ist nicht nur ein kanonischer Wnt-Reporter, sondern bietet auch die Möglichkeit, Axin2-heterozygote und homozygote (Axin2-Knock-out )-Phänotypen zu untersuchen. Die gezielte Insertion von mTurquoise2 an der Startstelle von Axin2 führt zu einem gestörten Axin2-Protein²¹. Da Axin2, auch bekannt als Conductin, Teil des Wnt-Zerstörungskomplexes ist und der Zerstörungskomplex die β-Catenin-vermittelte Transkription streng reguliert, könnte sein teilweises oder vollständiges Fehlen für die Untersuchung verschiedener Pathologien von Interesse sein. Bei Darmkrebs beispielsweise sind die Axin2-Spiegel aufgrund der Wnt-Hyperaktivierung relativ hoch¹¹; Seine Rolle bei anderen Pathologien ist jedoch noch weitgehend unbekannt. Obwohl davon ausgegangen wird, dass Axin2 eine begrenzte Rolle beim Abbau von β-Catenin spielt, kann seine Rolle bei der Wnt-Regulation durch die Zugabe eines kleinen Peptids verstärkt werden, das das Wnt-vermittelte Wachstum von Darmkrebs blockiert²⁶.

Insgesamt kann eine sorgfältige Wnt-Regulation über Wnt-therapeutische Ziele Möglichkeiten eröffnen, den Ausbruch oder die Entwicklung schwerer Pathologien zu verändern, und sollte in Modellen mit Reporterkapazität weiter untersucht werden. In diesem Bericht erläutern wir unsere Best-Practice-Analysemethode des Axin2-mTurquoise2-Mausmodells für die Durchflusszytometrie und konfokale Bildgebung. Im Zusammenhang mit Wnt-Dosierungen sind sehr niedrige kanonische Wnt-Signalwerte schwer zu detektieren, wofür fortschrittliche Nachweis- und Analysefähigkeiten von Vorteil sind, um die Vorteile dieses Modells voll auszuschöpfen. Thymozyten werden aufgrund ihrer fragilen Zellviabilität, ihrer geringen kanonischen Wnt-Signalexpression und ihrer kondensierten Zytoplasmafläche als Modellsystem verwendet, um die Nachweisempfindlichkeit des Axin2-mTurquoise2-Modells darzustellen. Zusätzlich wird ein histologisches Total-β-Catenin-Färbeverfahren für Thymozytenzellsuspensionen erläutert, um zytoplasmatische β-Catenin-Spiegel zu messen und den nukleären aktiven kanonischen Wnt-Signalweg in Kombination mit dem Reporter zu verifizieren.

Protokoll

HINWEIS: Alle Eingriffe an Mäusen wurden mit Genehmigung der Ethikkommission für Tierversuche des Leiden University Medical Center (LUMC) durchgeführt. Männlich und weiblich, 6-12 Wochen alt, Wildtyp (wt), die keine Insertion des Axin2-mTurquoise2-Reporterkonstrukts haben, heterozygot (Tg/0) mit einer Insertion des Axin2-murquoise2-Reporterkonstrukts und somit einem gestörten Axin2-Gen , und homozygot (Tg/Tg) mit der Insertion des Axin2-mTurquoise2-Reporterkonstrukts in beide Allele und somit zwei gestörte Axin2-Gene ; Axin2-mTurquoise2-Mäuse (B6; CBA-Axin2^em1Fstl/J Mäuse) wurden in den Experimenten verwendet. Die Tiere wurden vor der Organisolierung durch CO₂ -Euthanasie getötet. Minimieren Sie während des gesamten Verfahrens die Lichteinwirkung der Proben und halten Sie sie immer auf Eis oder 4 °C, sofern nicht anders angegeben. Decken Sie die Proben mit Alufolie ab. Alle Schritte sollten in einem Standardlabor mit einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden.

1. Herstellung der Thymozytenzellsuspension

1. Entnehmen Sie den Thymus von Mäusen vorsichtig und ohne Blutkontamination, indem Sie den Bauch der Mäuse aufschneiden und den Thymus mit einer Zange herausziehen. Vorübergehende Lagerung/Transport in eiskaltem Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) mit 2,5 % fötalem Kälberserum (FCS).
   HINWEIS: Um Blutverschütten und mögliche Thymusschäden zu vermeiden, opfern Sie die Mäuse nicht durch Gebärmutterhalsluxation.
2. Bereiten Sie ein 50-ml-Röhrchen mit einem 70-μm-Zellsieb vor und befeuchten Sie den Filter mit 1 ml kaltem IMDM/2,5 % FCS-Medium.
3. Zerdrücken Sie das Organ mit der hinteren Spitze eines 1-ml-Spritzenkolbens, während Sie es zweimal mit kaltem IMDM/2,5 % FCS-Medium waschen (Abbildung 1A). Falls gewünscht, fügen Sie dem IMDM/2,5 % FCS-Medium eine Endkonzentration von 50 U/ml DNAse I hinzu, um das Verklumpen abgestorbener Zellen zu verhindern. Spülen Sie den Filter 2x mit kaltem IMDM/2,5 % FCS-Medium und resuspendieren Sie ihn vorsichtig im 50-ml-Röhrchen.
   HINWEIS: Überschreiten Sie nicht ein Gesamtendvolumen von 10 ml. Bewahren Sie die Zellen für nachfolgende Schritte und bei Nichthandhabung auf Eis und im Dunkeln auf.
4. Bei 330 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand vorsichtig aus dem Küvettenpellet absaugen. Resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in kaltem, unvollständigem IMDM/2,5 % FCS-Medium und bereiten Sie die Zellzählung vor.
   HINWEIS: Falls erforderlich, frieren Sie die Thymozyten ein und lagern Sie sie in flüssigem Stickstoff in FCS-10% Dimethylsulfoxid für spätere Experimente. Das richtige Einfrieren und Auftauen der Zellen reduziert den übermäßigen Zelltod. Im Durchschnitt kann die Hälfte der Thymozyten nach dem Auftauen apoptotisch sein, was auf die natürliche T-Zell-Selektion im Thymus zurückzuführen ist, was bei der Entscheidung, wie viele Thymozyten pro Kryo-Fläschchen eingefroren werden sollen, berücksichtigt werden sollte. Pro Durchstechflasche sollten nicht weniger als 2,5 ×^{10 6} Thymozyten eingefroren werden.

2. Vorbereitung der Thymozyten-Durchflusszytometrie

1. Bereiten Sie die Thymozyten für die Färbung der Zelloberfläche vor, indem Sie 2,5 × 10⁶ Thymozyten pro Färbeprobe in eiskalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) vorbereiten (Abbildung 1B). Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen nach dem Auftauen, wenn die Thymozyten zuvor eingefroren wurden. Falls erforderlich, fügen Sie eine Endkonzentration von 50 U/ml DNAse I hinzu, um das Verklumpen abgestorbener Zellen zu verhindern.
2. Verwenden Sie die Antikörper-Färbepanels für die Charakterisierung der Zelloberfläche einer kompletten Thymozyten-Untergruppe.
   HINWEIS: Andere Kombinationen von Fluorochromen können ausgewählt werden. Wählen Sie seltene Populationsmarker für helle fluoreszierende Fluorochrome aus und fügen Sie, wenn möglich, einen Marker für lebende Tote hinzu. Weder V450 noch V500 Fluorochrome sollten aufgrund der spektralen Überlappung in Kombination mit dem mTurquoise2 Fluoreszenzreporter verwendet werden. Überprüfen Sie immer die Fluoreszenzspektren von mTurquoise2 in Kombination mit blauen und grünen Fluorochromen (Ergänzende Abbildung 1A).
   1. Mischen Sie die Antikörper in den zuvor definierten Verhältnissen der Lineage-negativen (Lin-) Panels separat in PBS/0,2 % Rinderserumalbumin (BSA)/0,1 % NaN₃ (Natriumazid) Puffer.
      HINWEIS: Alle unerwünschten Zellen (Nicht-Thymozyten, die im Thymus vorhanden sind) werden in einem 2-stufigen Prozess mit einem Streptavidin-Sekundärantikörper (in diesem Beispiel Phycoerythrin (Pe)-Cy7 und Allophycocyanin (APC)-Cy7) gefärbt und können durch die Verwendung eines "Dump Gates" in der Durchflusszytometrie-Analyse ausgeschlossen werden.
   2. Mischen Sie die Antikörper in zuvor definierten Verhältnissen des Double Negative (DN) Färbepanels mit dem Streptavidin-Sekundärantikörper Pe-Cy7 in PBS/0,2 % BSA/0,1 % NaN_3-Puffer . Schließen Sie das Lin-Panel aus dieser Mischung aus (Tabelle 1).
   3. Mischen Sie die Antikörper in den zuvor definierten Verhältnissen des imreifen einfach positiven (ISP), doppelt positiven (DP) und einfach positiven (SP) Färbepanels mit dem Streptavidin-Sekundärantikörper APC-Cy7 in PBS/0,2 % BSA/0,1 % NaN_3-Puffer . Schließen Sie das Lin-Panel aus dieser Mischung aus (Tabelle 1).
   4. Zuerst färben Sie die Thymozyten mit den unerwünschten Nicht-T-Zellpopulationen, indem Sie die Biotin-Primärantikörpermischungen der Lin-Panels für 30 min auf Eis im Dunkeln verwenden.
      HINWEIS: Jede Lin-Platte ist ein anderer Satz von Zellen und sollte daher nicht zusammen in einer Probe gefärbt werden.
   5. Bei 300 × g, 4 °C für 5 min herunterschleudern und den Überstand entfernen. Die Thymozyten mit 150 μl eiskaltem PBS/0,2 % BSA/ 0,1 % NaN₃ Puffer waschen und bei 300 × g, 4 °C für 5 min herunterschleudern.
   6. Mit der DN-Platte und der ISP/DP/SP-Platte der entsprechenden Lin-Platte 30 min im Dunkeln auf Eis beizen. Bei 300 × g, 4 °C für 5 min eindrehen und den Überstand entfernen. Die Thymozyten mit 150 μl eiskaltem PBS/0,2 % BSA/0,1 % NaN₃ Puffer waschen und bei 300 × g, 4 ΰC 5 Min. eindrehen.
3. Bereiten Sie die Zellen für die Durchflusszytometrie-Messung vor, indem Sie sie mit einem 35-μm-Zellsiebröhrchen homogenisieren und die Zellen in PBS/0,2 % BSA/0,1 % NaN_3-Puffer aufnehmen. Schützen Sie die Zellen vor Licht und halten Sie sie bis zur Messung des Durchflusszytometers auf Eis.
   HINWEIS: NaN₃ (Natriumazid) ist hochgiftig und tödlich. Bei der Arbeit mit dieser Substanz ist besondere Vorsicht geboten. Waschen Sie sich nach der Handhabung gründlich die Hände und rufen Sie sofort eine Giftnotrufzentrale oder einen Arzt/Arzt an, wenn NaN₃ verschluckt wird.

3. Durchflusszytometer-Messung

HINWEIS: Unerfahrene Benutzer sollten zuerst eine Durchflusszytometer-Schulung absolvieren, da die Messung des mTurquoise2-Signals in Kombination mit mehreren anderen Fluorochromen Erfahrung und eine sachkundige Planung des Experiments erfordert. In der Materialtabelle finden Sie Informationen zum Durchflusszytometer.

1. Starten Sie das Durchflusszytometer gemäß der Bedienungsanleitung oder einem anderen festgelegten Protokoll. Überprüfen und passen Sie bei Bedarf die Bandpassfiltereinstellungen im Durchflusszytometer an, um eine optimale Fluoreszenzdetektionsstrategie zu erzielen.
   HINWEIS: Ein empfohlener Filter für mTurquoise2 ist 470/20 nm auf der ultravioletten Laserlinie 405 nm, 407 nm oder der weniger verbreiteten 440 nm Laserlinie.
2. Kalibrieren Sie das Durchflusszytometer, indem Sie Kompensationseinstellungen mit handelsüblichen Kompensationskügelchen und stabil transfizierten, mTurquoise2-exprimierenden 293T-Zellen vornehmen.
   HINWEIS: Anstelle von Kompensationsperlen können einfach gefärbte wt-Thymozyten verwendet werden. In diesem Fall war die Kompensation mit Kügelchen ebenso effizient und bequemer als die Verwendung von Zellen.
   1. Beschriften Sie die Kügelchen mit jedem einzelnen Fluorochrom, das im Experiment verwendet wurde, und fügen Sie ungefärbte Kügelchen hinzu. Messen Sie die Kügelchen, um ein Kompensationseinstellungsfeld einzurichten, und messen Sie mTurquoise2-exprimierende 293T-Zellen, da es kein passendes Fluorochrom für mTurquoise2 gibt, das auf den Kügelchen verwendet werden kann. Speichern Sie die Kompensationseinstellungen für die Verwendung im eigentlichen Experiment.
      HINWEIS: Die mTurquoise2-exprimierenden Zellen, die für die Kompensationseinstellung verwendet werden, müssen genauso hell oder heller sein als die mTurquoise2-exprimierenden Thymozyten des eigentlichen Experiments. Stellen Sie sicher, dass auch mTurquoise2-negative 293T-Zellen vorhanden sind.
   2. Für das Experiment sind Fluoreszenz-minus eins (FMO) Tg/Tg-gefärbte Thymozyten zu verwenden, einschließlich einer Gew.-Probe für das mTurquoise2 FMO und einer ungefärbten Probe von Thymozyten jedes Maus-Genotyps als Positivkontrollen für den Analyseteil.
      HINWEIS: Diese Steuerelemente sind wichtig, um die Gates für positive Zellen richtig einzustellen. Der Rest der experimentellen Proben wird mit dem kompletten Färbepanel gefärbt (Tabelle 1).
      1. Erstellen Sie ein Experiment, fügen Sie die Anzahl der Röhrchen in der Durchflusszytometer-Software hinzu und benennen Sie sie und erstellen Sie Streudiagramme, um die gefärbten Zellen für den gesamten Satz von Fluorochromen zu visualisieren.
      2. Wenden Sie die zuvor festgelegten Kompensationseinstellungen auf das Experiment an. Passen Sie die Vorwärtsstreuung (FSC) und die Seitenstreuung (SSC) mit ungefärbten wt-Thymozyten an, bis die vollständige Zellpopulation im Streudiagramm sichtbar ist. Messen Sie zuerst die ungefärbten Tg/Tg mTurquoise2-exprimierenden Thymozyten, um sicherzustellen, dass die positive Population sichtbar ist.
      3. Messen Sie eine Tg/Tg-Probe vollständig gefärbter Thymozyten und prüfen Sie, ob alle Fluorochrom-Kombinationen vorhanden sind. Passen Sie gegebenenfalls die zuvor festgelegten Kompensationswerte für die Fluorochrome an, die eine falsche Kompensation aufweisen. Messen Sie den Rest der experimentellen Proben und passen Sie während der Messung der Proben keine Einstellungen an.
         HINWEIS: Eine nachträgliche Vergütungsanpassung kann auch in der Analysesoftware durchgeführt werden. Obwohl die Anzahl der verfügbaren Zellen ein limitierender Faktor sein könnte, ist es ratsam, diesen Schritt während der Messung durchzuführen. Halten Sie die Einstellungen für alle Samples gleich, um die Intensitätswerte von mTurquoise2 vergleichen zu können.

4. Durchflusszytometrische Analyse

HINWEIS: Die durchflusszytometrische Analyse wurde mit einer speziellen Software durchgeführt, die in der Materialtabelle erwähnt wird. Es sind jedoch auch andere durchflusszytometrische Analyseprogramme verfügbar.

1. Gate lebende Zellen und Thymozyten-Untergruppen gemäß FSC- und SSC-Werten.
2. Überprüfen Sie die Kompensationseinstellungen im Dialogfeld " Kompensationsmatrix " links neben der Probe, um sicherzustellen, dass keine Fluorochrom-Interferenzen vorhanden sind und dass eine ordnungsgemäße Kompensation stattgefunden hat, um ein Überlaufen oder Durchscheinen zu vermeiden.
   1. Wenn die durch die Akquisition definierte Matrix angepasst werden muss, ändern Sie die Werte in der Kompensationsmatrix, indem Sie einfach den Kompensationswert jeder Fluorochromkombination erhöhen oder verringern, so dass die Grundgesamtheit keine nahezu perfekte horizontale oder vertikale Linie zeigt (Ergänzende Abbildung 1B).
3. Um die mTurquoise2-Intensität visuell zu verteilen und ein korrektes positives Gating zu erzielen, ändern Sie die Anzeige der mTurquoise2-X-Achse in linear (Ergänzende Abbildung 2).
   1. Verwenden Sie den mTurquoise2 FMO-Regler als negativen Regler für das mTurquoise2-Positivsignal-Gating. Überarbeiten Sie das korrekte Schwellenwert-Gating pro Zellpopulation (Abbildung 2).
      HINWEIS: Die (wt) mTurquoise2 FMO-Kontrollzellen verfügen nicht über den mTurquoise2-Marker und können daher als Hintergrundschwellenwert für die Axin2-Reporteraktivität verwendet werden.
4. Gatet mTurquoise2-positive Zellen mit dem entsprechenden Detektionskanal, um zu definieren, wie viele Zellen Wnt-positiv sind.
5. Berechnen Sie das geometrische Mittel und den Median, um die Intensität der Fluoreszenz in den interessierenden Zellen zu definieren.
   1. Klicken Sie auf Statistik | Fügen Sie eine Statistik im Panel hinzu, die mTurquoise2-positive Zellen anzeigt.
   2. Definieren Sie die Statistikmethode, die interessierende Grundgesamtheit und den Detektionskanal von mTurquoise2 und klicken Sie auf Hinzufügen. Stellt das geometrische Mittel und die mediane Fluoreszenzintensität in beliebigen Einheiten (AU) dar, um Diagramme darzustellen.
      HINWEIS: Der Median stellt den mittleren Wert der Fluoreszenzintensität dar und gibt somit Auskunft über die Verschiebung der Fluoreszenzintensitätspopulation. Bei Bedarf kann eine Hintergrundkorrektur helfen, den Dynamikbereich der mTurquoise2-Reporteraktivität klarer zu visualisieren. Dies kann durch Subtraktion der wt-Hintergrundfärbefrequenzen von der Gesamtfrequenz der mTurquoise2-positiven Zellen des spezifischen Zelltyps erfolgen, der gated ist.

5. Präparation von Thymozyten-Cytospins für die konfokale Bildgebung

HINWEIS: Thymozyten-Cytospins werden empfohlen, wenn mit Zellsuspensionen von nicht adhärenten Zellen gearbeitet wird. Da die Expression von Axin2-mTurquoise2 in den Thymozyten geringer ist als in den Thymusepithelzellen, wurden für die Bildgebung filtrierte Thymozytenzellsuspensionen verwendet.

1. Beginnen Sie mit einer Zellsuspension aus frisch geernteten oder gefrorenen Thymozyten. Suspendieren Sie ~20.000 Thymozyten in 100 μl kaltem PBS/0,5 % BSA/10 % FCS pro Thymozyten-Genotyp.
   HINWEIS: Tauen Sie die Zellen bei Bedarf vorsichtig auf, um die maximale Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten, wenn Sie mit zuvor eingefrorenen Thymozyten arbeiten. Dies wird zu weniger Autofluoreszenz bei der Bildgebung der Zellen beitragen. Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen, um die Qualität der Probe sicherzustellen. Das Cytospin-Verfahren bedient sich einer mechanischen Kraft, die an den fragilen Thymozyten angepasst ist; Nichtsdestotrotz erfordert es eine sehr brauchbare Startpopulation. Um eine höhere Lebensfähigkeit zu gewährleisten, empfiehlt es sich, mit frisch geernteten statt mit gefrorenen Thymozyten zu beginnen.
2. Befeuchten Sie den Bereich um die Öffnung der Filterkarten mit PBS. Montieren Sie den Cytospin-Probenkammerhalter gemäß der Anleitung (Abbildung 1C).
   1. Legen Sie die Filterkarte auf den Frostschieber (glatte Seite gegen den Glasschieber). Platzieren Sie beide Teile auf dem Probenkammerhalter. Achten Sie darauf, die Filterkarte genau auf das Loch des Probenkammerhalters zu setzen, und setzen Sie den kompletten Probenkammerhalter in den Rotor ein.
3. Die Thymozyten werden vorsichtig resuspendiert und 100 μl der Zellsuspension in die Probenkammern gegeben. Schleudern Sie die Thymozytensuspension für 4 min bei ~350 × g auf die Frostobjektträger. Nehmen Sie die Filterkarte vorsichtig vom Frostschieber, ohne die Zellen zu berühren. Trocknen Sie die Cytospins für einen Zeitraum von 1 h bis über Nacht bei Raumtemperatur an der Luft.
   HINWEIS: Wenn Sie mit anderen Zelltypen arbeiten, testen Sie unterschiedliche Zelldichten, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Cytospins können bei -20 °C in einer verschlossenen Box eingefroren werden, um später mit ihnen experimentiert zu werden. Tauen Sie die Cytospins für die weitere Handhabung 1 h bei Raumtemperatur auf.

6. Cytospin-Immunfärbung mit Gesamt-β-Catenin

1. Fixieren Sie die Cytospins für 15 min bei Raumtemperatur in 100% Methanol. Trocknen Sie die Objektträger 10 Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Stift einen Kreis um die Thymozytenpopulation auf dem Objektträger.
   HINWEIS: Dieser Fixierungsschritt ist speziell für die β-Catenin-Färbung optimiert.
2. Legen Sie die Objektträger 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in PBS/0,05 % Tween-20 und geben Sie sie dann während der Blockierungs- und Inkubationsschritte in eine dunkle, feuchte Box. Fügen Sie 100 μl PBS/10 % normales Mausserum (NMS) pro Objektträger hinzu und lassen Sie es 10 Minuten bei Raumtemperatur in der Feuchtbox. Tippen Sie auf den Objektträger, um die 10 % NMS zu entfernen, fügen Sie 100 μl PBS/10 % normales Ziegenserum (NGS) pro Objektträger hinzu und lassen Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in der Feuchtbox.
   HINWEIS: Die Inkubation mit PBS/10 % NMS blockiert die unspezifische Bindung an primäre Antikörper (Abbildung 1D), während PBS/10 % NGS die unspezifische Bindung an sekundäre Antikörper blockiert.
3. Bereiten Sie zusätzliche Antikörper für die Zellfärbung vor. Mischen Sie 0,5 μg des gesamten β-Catenin-Antikörpers mit den AF568-markierten Fragmenten.
   HINWEIS: In dieser Einstellung wurde ein kommerziell erhältliches Markierungskit für die Vormarkierung des primären Anti-Maus-Gesamt-β-Catenins mit sekundären Ziegen-Anti-Maus-IgG1-Fab-Fragmenten mit Alexa Fluor 568 (AF568)-Fluorochrom-Markierung verwendet, bevor es den Thymozyten hinzugefügt wurde. Führen Sie die Kennzeichnung gemäß dem Protokoll des Herstellers durch, da möglicherweise mehrere Konzentrationen getestet werden müssen. Verwenden Sie den gesamten β-Catenin-AF568-markierten Antikörper innerhalb von 30 Minuten.
4. 50 μl (0,5 μg) des gesamten β-Catenin-AF568-markierten Antikörpers pro Cytospin-Objektträger über Nacht bei 4 °C in eine feuchte Box geben. Fügen Sie eine Negativfärbekontrolle gemäß dem Protokoll des Herstellers oder eine Isotypkontrolle im Falle eines Direktmarkierungsprotokolls hinzu.
5. 20 Minuten lang mit PBS/0,05 % Tween-20 bei Raumtemperatur waschen. Dann 20 Minuten lang mit PBS bei Raumtemperatur in einem Glas unter Rühren waschen. Führen Sie einen zweiten Fixierungsschritt durch, um die Bindung des Antikörpers an das Antigen sicherzustellen: 10 min bei Raumtemperatur mit 100 μl 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS in einer feuchten Box.
   HINWEIS: Bewahren Sie die Folien im Dunkeln auf. Weder die Methanol- noch die PFA-Fixierung beeinflussen die mTurquoise2-Expression signifikant²⁷.
6. Tauchen Sie die Folien in PBS ein. Die nukleare Färbung mit 50 μl TO-PRO-3 (1:1500) wird 10 min lang bei Raumtemperatur in der Feuchtbox durchgeführt. Waschen Sie die Objektträger 20 min lang mit PBS bei Raumtemperatur in einem Glas unter Rühren.
   HINWEIS: Die TO-PRO3-Konzentration kann in Abhängigkeit von der Verwendung anderer Fluorochrome mit nahegelegenen Fluoreszenzspektren titriert werden.
7. Betten Sie die Proben mit einem Antifading-Reagenz gemäß dem Protokoll des Herstellers ein und bedecken Sie sie mit einem Deckglas. 24 h bei Raumtemperatur an der Luft trocknen. Betrachten Sie die Objektträger direkt unter einem Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskop oder lagern Sie sie bei -20 °C für eine spätere Bildgebung.

7. Konfokale mikroskopische Messung

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Informationen zum konfokalen Mikroskop.

1. Schalten Sie das konfokale Mikroskop gemäß dem manuellen oder etablierten Protokoll ein. Verwenden Sie negative und positive stabil transfizierte mTurquoise2 293T Zellliniensteuerungen für die primäre Anpassung der konfokalen Einstellungen. Verwenden Sie anschließend wt Axin2-mTurquoise2 und Tg/Tg (Knock-out) Axin2-mTurquoise2-Thymozyten als negative bzw. positive Kontrollen, um sicherzustellen, dass das mTurquoise2-Signal nicht unterbelichtet wird.
2. Bereiten Sie die Software für das sequentielle Scannen vor, indem Sie die Laser und Filterbreiten programmieren. Beginnen Sie zuerst mit der Laserlinie mit der höchsten Wellenlänge und arbeiten Sie sich zur niedrigsten Wellenlänge vor. Wenn alle sequenziellen Scanschritte installiert sind, laden Sie die Probe auf den Mikroskoptisch, fokussieren Sie die Probe und drücken Sie Live , um die Laserleistung und Smart Gain mit den entsprechenden Tasten in der konfokalen Software oder dem optionalen manuellen Bedienfeld zu optimieren.
   HINWEIS: Der Probenausschnitt des Objektträgers sollte zur Signalquantifizierung nicht abgebildet werden, da es möglicherweise zu Photobleaching kommen könnte. mTurquoise2 hat jedoch eine hohe Photostabilität²⁵.
3. Bei sehr geringer mTurquoise2-Expression erhöhen Sie die Laserleistung und Smart Gain, bis ein Fluoreszenzsignal beobachtet wird, und überprüfen Sie mit der negativen Kontrollprobe, ob ein echtes positives Signal vorhanden ist. Visualisieren Sie die Thymozyten mit einer 40x 1,4 Öllinse, einer 63x 1,4 Öllinse oder einer 100x 1,4 Öllinse.
   HINWEIS: Für diese Studie wurde ein Leica SP5 Mikroskop verwendet.
4. Verwenden Sie diese konfokalen Bildgebungseinstellungen am Mikroskop, bevor Sie die Probe messen.
   1. Passen Sie den Intensitätswertbereich auf ein 12-Bit-Bild an, indem Sie auf Konfiguration | Einstellungen | Ändern Sie in der Option Bittiefe auf 12 Bit, um eine breitere Intensitätsskala und damit eine bessere Unterscheidung zwischen niedrigen und hohen Fluoreszenzsignalen zu erstellen.
   2. Passen Sie die Bildauflösung an, indem Sie auf XY klicken, und erhöhen Sie das Format auf 1024 x 1024, wodurch sich auch die Scanzeit verdoppelt. Stellen Sie die Scangeschwindigkeit auf 400-600 Hz ein, indem Sie auf Geschwindigkeit | Mehr , um die Einstellungen manuell zu ändern. Aktivieren Sie zusätzlich die Option Bidirektionales Scannen.
   3. Passen Sie den Schieberegler für die Empfindlichkeit an, um das Hintergrundsignal zu reduzieren. Optimieren Sie die richtige Laserleistung und Smart Gain mit der Option Quick LUT (Look-Up Table).
      HINWEIS: Im 12-Bit-Bild hat der Schieberegler einen Graustufenintensitätswert von 0 bis 4095. Dies kann auch nachträglich mit der kostenlosen Offline-Software Las X erfolgen. Die grüne Farbe zeigt den schwarzen Hintergrund und die blaue Farbe zeigt gesättigte Pixel des Samples.
5. Wenn alle Bildgebungseinstellungen optimiert sind, messen Sie die Probe, indem Sie auf Start klicken, wodurch die sequentielle Bildgebung aller drei Kanäle gestartet wird.
   1. Messen Sie das nukleare Fluoreszenzsignal TO-PRO-3. Detektieren Sie TO-PRO-3 mit dem 633-nm-Laser und HyD 640-750 nm.
      HINWEIS: In diesem Setup wurde eine Laserleistung von 6 % bei einer intelligenten Verstärkung von 15 % verwendet. Diese Einstellung kann sich je nach Intensität der TO-PRO-3-Färbung ändern. Wenn es sehr hell ist, könnte es bei Überregung Fluorochrome mit geringerer Intensität beeinflussen. Reduzieren Sie in einem solchen Fall die Färbekonzentration.
   2. Messen Sie die β-Catenin-Kern- und zytoplasmatischen Fluoreszenzsignale. Nachweis von β-Catenin mit dem 561-nm-Laser und HyD 580-605 nm. Sammeln Sie bis zu 2 Scans für ein Bild, indem Sie die Einstellung im XY-Feld in der Software mit dem Zeilendurchschnitt 2 bei einem niedrigen AF568-Signal anpassen.
      HINWEIS: In diesem Setup wurden 85 % Laserleistung bei 87 % Smart Gain verwendet.
   3. Messen Sie das zytoplasmatische Fluoreszenzsignal von mTurquoise2. Erkennen Sie mTurquoise2 mit dem 458-nm-Laser und HyD 490-600 nm. Sammeln Sie bis zu 4 Scans für ein Bild, indem Sie die Einstellung in der XY-Box in der Software mit dem Zeilendurchschnitt 4 bei einem niedrigen mTurquoise2-Signal anpassen.
      HINWEIS: Aufgrund alter Laser auf dem konfokalen Mikroskop, die für dieses Protokoll verwendet wurden, und des niedrigen mTurquoise2-Signals wurde 405 nm bei 90 % Laserleistung verwendet, zusammen mit den 458 nm und 476 nm Lasern bei 100 % Laserleistung und HyD 490-550 nm bei 100 % Smart Gain. Ein 440-nm-Laser ist am optimalsten, wenn auch seltener auf einem konfokalen Mikroskop vorhanden. Hohe Laserleistungen sollten mit Vorsicht gehandhabt und nur mit sequentieller Bildgebung durchgeführt werden. Stellen Sie sicher, dass Notfalleinstellungen vorhanden sind, um eine Überbelichtung des Detektors zu vermeiden. Die Laserleistung anderer konfokaler Mikroskope könnte aufgrund leistungsfähigerer oder neuerer Laser geringer sein als die in diesem Protokoll vorgeschlagenen. Ein Bleichtest könnte durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass vor der Bildgebung kein Fluoreszenzsignal verloren geht. Im vorgeschlagenen Aufbau war das Photobleaching von mTurquoise2 akzeptabel.
   4. Führen Sie Hellfeld-Bildgebung für die vollständige Zellvisualisierung durch. Detektieren Sie Thymozyten mit dem 488-nm-Laser und dem PMT Scan-DIC. Exportieren Sie die Lif-Dateien für die Bildanalyse.
      HINWEIS: In diesem Aufbau wurde eine Laserleistung von 59 % bei einer Verstärkung von 212 V und einem Datenoffset von -4,3 % verwendet. LIF-Dateien können in der Offline-Software LAS x zur Bildkorrektur eingelesen werden.

8. Konfokale Mikroskopie-Analyse

1. Analysieren Sie die Bilder mit einer Bildverarbeitungssoftware²⁸ (Ergänzende Abbildung 3). Laden Sie die Bilder in die Software.
   HINWEIS: Es werden mehrere Formate akzeptiert, aber TIFF-Dateien mit LUT oder der direkte Import von LIF-Dateien in die Bildbearbeitungssoftware werden empfohlen.
2. Messen Sie das aktive β-Catenin-Signal in den Thymozytenkernen.
   1. Wählen Sie die Zellkerne der TO-PRO-3-gefärbten Thymozyten in der rot-grauen Wert-Abbildung für die Analyse von aktivem β-Catenin aus. Tun Sie dies manuell oder verwenden Sie die automatische Zellenauswahl in der Software.
      HINWEIS: Für die automatische Zellenauswahl ist möglicherweise eine Bildverarbeitung erforderlich, um einen korrekten Schwellenwert und eine Partikelanalyse zu ermöglichen. Die manuelle Zellauswahl kann mühsam sein, erfordert aber in der Regel keine Bildverarbeitung und wird in diesem Protokoll empfohlen.
   2. Aktivieren Sie die manuelle Auswahl mit einem der Auswahlwerkzeuge in der Arbeitsleiste.
      1. Wählen Sie die Kontur des Nukleus aus, und fügen Sie sie dem ROI-Manager (Region of Interest) hinzu. Aktivieren Sie den ROI-Manager, indem Sie auf Analysieren | Werkzeuge | ROI-Manager, und wenn ein neues ROI-Manager-Fenster geöffnet wird, klicken Sie auf die erste Option Hinzufügen (t) oder verwenden Sie die Tastenkombination t. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt, bis alle Kerne definiert und dem ROI-Manager hinzugefügt wurden. Verwenden Sie die Option Alle anzeigen im ROI-Manager, um die ausgewählten Zellen zu visualisieren.
   3. Wählen Sie >3 Hintergrundbereiche aus, in denen keine Zellen vorhanden sind, und fügen Sie diese dem ROI-Manager hinzu.
      HINWEIS: Größe und Form spielen in diesem Fall keine Rolle. Diese Bereiche dienen als Hintergrundrauschmessungen für die endgültige Berechnung.
      1. Definieren Sie die Messung auf dem Bild, indem Sie auf Analysieren | Legen Sie Messungen fest. Aktivieren Sie in dem neuen Fenster, das sich mit verschiedenen Messoptionen öffnet, die Optionen Fläche, Integrierte Dichte und Mittlerer Grauwert | Klicken Sie auf OK.
      2. Aktivieren Sie das β-Catenin-Grauwert-Bild, indem Sie darauf klicken, und visualisieren Sie die ausgewählten Kerne und Hintergrundbereiche, indem Sie im ROI-Manager auf Alle anzeigen klicken. Beobachten Sie alle markierten Bereiche, die nun im β-Catenin-Bild sichtbar sind.
      3. Klicken Sie im ROI-Manager auf Messen oder klicken Sie auf Analysieren | Messen. Beobachten Sie das neue Ergebnisfenster, das sich öffnet und die Ergebnisse des β-Catenin-Signals innerhalb der ROIs anzeigt.
      4. Übertragen Sie die Ergebnisse in ein Tabellenkalkulationsprogramm, indem Sie auf Bearbeiten | Alles auswählen; und kopieren Sie die Liste und fügen Sie sie zur weiteren Berechnung in die Tabelle ein. Speichern Sie den ROI-Manager zum späteren Nachschlagen, ohne die Kernauswahl wiederholen zu müssen, indem Sie auf Mehr | Retten....
   4. Für die automatische Zellauswahl legen Sie Duplikate (Tastatur, Strg, D) des zu verarbeitenden Bildes fest, da viele Bildverarbeitungseinstellungen nicht rückgängig gemacht werden können.
      HINWEIS: Die automatisierte Kernmarkierung erfordert in den meisten Fällen eine Bildverarbeitung, um die Kerne automatisch und genau zu definieren. Die Bildbearbeitung sollte nur zur Bereichsauswahl erfolgen. Verarbeitete Bilder sind für die Messung der Fluoreszenzintensität nicht geeignet, da die Pixelwerte verändert werden.
      1. Führen Sie einen Gaußschen Filter durch, indem Sie auf Prozess | Filter | Gaußscher Weichzeichner , um das Bild zu glätten. Testen Sie mehrere Sigma-Werte (Radius) und aktivieren Sie die Option Vorschau , um den Effekt zu visualisieren, bevor Sie auf OK klicken.
      2. Invertieren Sie das Bild, indem Sie auf Bearbeiten | Invertieren. Überprüfen Sie die Helligkeit und den Kontrast, indem Sie auf Bild | Anpassen | Helligkeit/Kontrast. Verwenden Sie die Option Auto oder ändern Sie die Werte vorzugsweise manuell.
         HINWEIS: Übernehmen Sie die Änderungen nicht, da sich dadurch die Bildeigenschaften ändern würden. Schließen Sie einfach das B&C-Fenster , wenn das gewünschte Bild erhalten wurde.
      3. Erstellen Sie einen Schwellenwert, indem Sie auf Bild | Anpassen | Schwellenwert und definieren Sie die besten Schwellenwerteinstellungen, bei denen alle Zellen größtenteils sichtbar sind. Klicken Sie auf Übernehmen , um die Schwellenwerteinstellungen zu übernehmen.
         HINWEIS: Wenn auf die Zellen, die Löcher aufweisen, kein Schwellenwert angewendet wurde, klicken Sie auf Prozess | Binär | Löcher füllen , um die Lücken innerhalb der Zellen zu füllen. Wenn Zellen mit den Schwellenwerteinstellungen verschmolzen sind, klicken Sie auf Verarbeiten | Binär | Wasserscheide, um diese Zellen zu trennen. Eine feine 1-Pixel-Linie trennt jede Zelle, die das Programm als verschmolzen interpretiert.
      4. Definieren Sie den kleinsten und den größten Kern im Bild, indem Sie manuell mit dem Freihand-Auswahlwerkzeug einen Kern Ihrer Wahl auswählen, ihn dem ROI-Manager hinzufügen und den Bereich messen.
      5. Analysieren Sie die Teilchen (Kerne), indem Sie auf Analysieren | Partikel analysieren, und fügen Sie die kleinste und die größte Fläche in das Feld Größe (^2) mit einem Bindestrich (-) dazwischen ein. Aktivieren Sie die Kästchen Ergebnisse anzeigen, Zum Manager hinzufügen und Ausschließen an Kanten , bevor Sie auf OK klicken. Fahren Sie mit Schritt 8.2.3 fort, um das Protokoll abzuschließen.
3. Messen Sie die zytoplasmatischen mTurquoise2- und β-Catenin-Signale in den Thymozyten.
   1. Wählen Sie die Kontur ganzer Thymozyten im Hellfeldbild aus, indem Sie die gleichen Schritte wie oben ausführen.
   2. Wählen Sie >3 Hintergrundbereiche aus, in denen keine Zellen vorhanden sind, und fügen Sie diese dem ROI-Manager hinzu.
      HINWEIS: Größe und Form sind in diesem Fall unwesentlich. Diese Bereiche dienen als Hintergrundrauschmessungen für die endgültige Berechnung.
      1. Aktivieren Sie das mTurquoise2-Grauwertbild, indem Sie darauf klicken, und visualisieren Sie die ausgewählten Gesamt-ROIs der Zellen und Hintergrundbereiche, indem Sie im ROI-Manager auf Alle anzeigen klicken. Beobachten Sie alle ausgewählten Bereiche, die im mTurquoise2-Bild sichtbar sind.
      2. Klicken Sie im ROI-Manager auf Messen oder klicken Sie auf Analysieren | Messen. Beachten Sie das neue Ergebnisfenster, das sich mit den Messergebnissen des mTurquoise2-Signals öffnet.
      3. Übertragen Sie die Ergebnisse in ein Tabellenkalkulationsprogramm, indem Sie auf Bearbeiten | Wählen Sie alle aus und kopieren Sie die Liste zur weiteren Berechnung in die Tabelle.
      4. Aktivieren Sie das Bild mit dem β-Catenin-Grauwert, indem Sie darauf klicken, und visualisieren Sie die ausgewählten Gesamt-ROIs der Zellen und Hintergrundbereiche, indem Sie im ROI-Manager auf Alle anzeigen klicken. Beobachten Sie alle ausgewählten Bereiche, die im β-Catenin-Bild sichtbar sind.
      5. Klicken Sie im ROI-Manager auf Messen oder klicken Sie auf Analysieren | Messen. Beachten Sie das neue Ergebnisfenster, das sich mit den Messergebnissen des gesamten zellulären β-Catenin-Signals öffnet.
      6. Übertragen Sie die Ergebnisse in ein Tabellenkalkulationsprogramm, indem Sie auf Bearbeiten | Wählen Sie alle aus und kopieren Sie die Liste zur weiteren Berechnung in die Tabelle. Speichern Sie den ROI-Manager zum späteren Nachschlagen, ohne die Zellenauswahl wiederholen zu müssen, indem Sie auf Mehr | Retten....
4. Berechnen Sie die korrigierte Gesamtkernfluoreszenz (CTNF) für aktives β-Catenin mit Hilfe von Gleichung 1.
   CTNF = Integrierte Dichte - (Fläche × Durchschnitt der mittleren Hintergrundflächen) (1)
5. Berechnen Sie die korrigierte Gesamtzellfluoreszenz (CTCF) für mTurquoise2 mit Hilfe von Gleichung 2.
   CTCF = Integrierte Dichte - (Fläche × Durchschnitt der mittleren Hintergrundflächen) (2)
6. Es wird zwischen aktivem nukleärem β-Catenin und zytoplasmatischem β-Catenin unterschieden, indem die in Schritt 8.2.3.3 ermittelten nukleären β-Catenin-Werte subtrahiert werden. aus den Gesamtzell-β-Catenin-Werten, die in Schritt 8.3.2.5 erhalten wurden, um das zytoplasmatische inaktive β-Catenin zu erhalten.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Messungen innerhalb derselben Zelle durchgeführt werden.
   1. Berechnen Sie den Durchschnitt der mittleren Intensität der Hintergrundbereiche. Berechnen Sie CTNF und CTCF anhand der Gleichungen 1 und 2. Betrachten Sie IntDen (die Summe aller Pixel innerhalb des ausgewählten Bereichs) als integrierte Dichte und nicht als RawIntDen.
   2. Berechnen Sie bei Bedarf die Standardabweichung der IntDen-Werte zum Zeichnen von Diagrammen. Betrachten Sie bis zu 200 separate Zellen für die statistische Analyse mit dem Mann-Whitney-U-Test.
7. Stellen Sie die Ergebnisse in einem einzelnen Datenpunktdiagramm dar, und beschriften Sie die y-Achse mit den CTNF- oder CTCF-Werten als relative Fluoreszenzeinheiten (RFU).

Ergebnisse

Um die Rolle des kanonischen Wnt-Signalwegs zu untersuchen, wurde ein Axin2-mTurquoise2-kanonisches Wnt-Reportermodell in Kombination mit der Expression von β-Catenin-Proteinen getestet. Thymozyten sind dafür bekannt, fragil zu sein, in mehreren Stadien des Thymozytenreifungsprozesses einen niedrigen kanonischen Wnt-Signalweg zu zeigen und ein niedriges Verhältnis von Zytoplasma zu Kern zu haben; all diese Faktoren behindern den Nachweis von zytoplasmatischem mTurquoise2 oder β-Caten...

Diskussion

Es stehen mehrere kanonische Wnt-Reporter mit unterschiedlicher Reportersensitivität und tatsächlichen Reporterproteinen zur Verfügung. Reportermodelle mit synthetisch eingeführten multimerisierten TCF/LEF-Bindungsstellen sind mit fluoreszierenden Reporterproteinen verfügbar; Solche Wiederholungen von Transgenen können jedoch während der Züchtung oder langer In-vivo-Experimente verloren gehen und können empfindlich auf Nicht-Wnt-Signale aus umgebenden genomischen Sequen...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD FACScantoII flow cytometer	BD Biosciences	not aplicable	Serial number V96300710. The flow cytometer setup in this protocol contains a 405 nm laser line with 505 longpass filter and 530/30 nm bandpass filter, and 470/20 nm bandpass filter; a 488 nm laser with 735 nm longpass filter and 780/60 nm bandpass filter, 670 nm longpass filter and 655 nm longpass filter, 610 nm longpass filter, 550 nm longpass filter and 575/26 nm bandpass filter, 505 nm longpass filter and 530/30 nm bandpass filter, and 488/10 nm bandpass filter; and a 633 nm laser line with 735 nm longpass filter and 780/60 nm bandpass filter, 685 nm longpass filter, and 660/20 nm bandpass filter.
BSA	Sigma	A9647
Corning 70 μm cell strainer	Falcon/Corning	352350
Cytospin 4 Type A78300101	Thermo Scientific	not aplicable
DMSO	Sigma Aldrich	D5879-1L
DNAse I	Sigma	A9647
Falcon 50 mL Conical Centrifuge tubes	Greiner bio-one	227261
Falcon round-bottom Polystyrene Test tubes with cell strainer snap cap	Fisher Scientific	352235
Fetal Calf Serum (FCS)	Greiner Bio-One B.V.	not aplicable	Depends on origin
Fiji software	ImageJ	not aplicable	Version 1.53
Filter card white (for cytospin)	VWR	SHAN5991022
FlowJo 10 software	Treestar	not aplicable	Version 10.5.3
Frost slides	Klinipath
Gibco IMDM medium	Fisher Scientific	12440053
HCX PL APLO 40x 1.4 OIL lens	Leica microsystems	not aplicable
Hydrophobic pen: Omm Edge pen	Vector	not aplicable
Leica TCS SP5 DMI6000	Leica microsystems	not aplicable	The microscope setup in this protocol consisted of an HCX PL APO 40x/1.2 oil-immersion objective with 8-bit resolution, 1024 pixels x 1024 pixels, 400 Hz speed, pinhole 68 µm, and zoom factor of 1.5 at room temperature. This system contains a 405 diode laser, argon laser, DPSS 561 laser, HeNe 594 laser and HeNe 633 laser with 4 hybrid detectors (HyDs) and 5 photomultiplier tubes (PMTs).
Methanol	VWR	1060091000
NaN3/sodium azide	Hospital farmacy	not aplicable
Normal mouse serum	Own mice	not aplicable
PBS	Lonza	BE17-517Q
ProLong Diamond Antifade Mountant	Fisher Scientific	P36965
Purified mouse anti-β-catenin (CTNNB1)	BD Biosciences	610154
TO-PRO-3 Iodide	Thermofisher	T3605
Transparent nailpolish	at any drugstore	not aplicable
Tween-20	Sigma Aldrich	P1379-500ml
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 labeling kit	Thermofisher	Z25006