Axin2-mTurquoise2レポーター胸腺細胞における低Wnt発現のフローサイトメトリーおよび共焦点イメージング解析

要約

シグナル伝達レベルは細胞の運命を調節することが知られており、Wntシグナル伝達の制御が興味深い治療標的を構成していることを示しています。ここでは、異なるWntシグナル伝達レベルを測定する頑健なマウス標準Wntシグナル伝達レポーターモデルのためのフローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡法について説明します。

要約

Wntの発現レベルの測定は、新しいWnt治療標的の同定や試験を行う際に不可欠です。これまでの研究では、標準的なWntシグナル伝達が投与量駆動型のメカニズムを介して動作することが示されており、さまざまな細胞タイプにおけるWntシグナル伝達を研究し測定する必要性が高まっています。生理学的なWnt発現を表すためにいくつかのレポーターモデルが提案されていますが、遺伝的状況またはレポータータンパク質のいずれかが、これらのツールの有効性、精度、および柔軟性に大きく影響しました。この論文では、変異したAxin2^em1Fstl 対立遺伝子を含むAxin2-mTurquoise2マウスWntレポーターモデルで得られたデータを取得および分析する方法について説明します。このモデルは、広範囲のWnt活性にわたる個々の細胞における内因性標準Wntシグナル伝達の研究を容易にします。

このプロトコールでは、造血系の細胞集団解析と細胞表面マーカーまたは β-カテニン 細胞内染色を組み合わせて、Axin2-mTurquoise2レポーター活性を十分に評価する方法を説明しています。これらの手順は、目的の他の組織または細胞での実施および複製の基礎として機能します。蛍光活性化セルソーティングと共焦点イメージングを組み合わせることで、明確な標準的なWnt発現レベルを可視化することができます。推奨される測定および分析戦略は、標準的なWntシグナル伝達の正確な評価のための蛍光発現レベルに関する定量的データを提供します。これらの方法は、Axin2-mTurquise2モデルを標準的なWnt発現パターンに使用したい研究者にとって有用です。

概要

標準的なWntシグナル伝達は、健康な組織の恒常性だけでなく疾患にも関与する保存されたシグナル伝達経路です。Wntシグナル伝達レベルの正確な制御は、胚発生において重要であることが示されていますが、成体組織においても非常に重要です。標準的なWntシグナル伝達は、腸、皮膚、造血系などのいくつかの臓器の組織再生に重要な役割を果たすことがわかっています。したがって、Wntシグナル伝達が制御解除されると、重篤な病状が発生します。結腸直腸癌、肝臓癌、皮膚癌、神経疾患、ならびに特定の血液悪性腫瘍は、制御解除されたWntシグナル伝達が原因因子または寄与因子である典型的な病状である^1。そのため、現在、Wnt関連がん治療薬^として、さまざまなWnt標的に対するいくつかの阻害剤が臨床試験で試験されています2。

さらに、神経学的回復、加齢性神経障害、および先天性自閉症スペクトラム障害^3,4,5に対するWnt治療の可能性において興味深い進歩が見られます。Wntシグナルは、その後の移植のための幹細胞のex vivo増殖について研究されています⁶。しかし、標準的なWntシグナル伝達の治療的標的化は、多くの基本的な細胞機能における重要性や、他の経路^とのクロストーク^7,8,9のために困難な試みであり、その結果、これらのWnt治療薬の効果を解釈しやすいモデルで正確に測定する必要が生じます。標準的なWntシグナル伝達は、隣接する細胞から分泌されるか、さまざまなWnt応答性幹細胞タイプで報告されているように自己分泌排泄として分泌される短距離の可溶性Wntリガンドによって駆動されます。

Wnt Frizzled受容体およびリポタンパク質受容体関連タンパク質(LRP)共受容体は、これらのリガンドに応答し、細胞内シグナル伝達カスケードを引き起こします。Wntシグナル伝達がオフの場合、Axis阻害剤(Axin)、腫瘍抑制遺伝子産物、大腸腺腫性ポリポーシス(APC)、カゼインキナーゼ1(CK1α)、およびグリコーゲンシンターゼキナーゼ(GSK-3β)で構成される破壊複合体が、プロテアソーム分解によるβ-カテニン(CTNNB1)の蓄積を防ぎます。Wntリガンド-受容体が結合すると、破壊複合体が不活性化され、細胞質中のβ-カテニンの蓄積と安定化につながります。活性β-カテニンは核内に移動し、転写因子/リンパ系エンハンサー結合因子(TCF/LEF)転写因子に結合して、Wnt標的遺伝子の転写を開始することができます。Axin2は、Wnt経路¹⁰の直接の標的であるため、標的遺伝子と見なされます。さらに、Axin2は、活性な標準的なWntシグナル伝達^11,12のレポーター遺伝子であると同時に、ネガティブレギュレーターとしても機能します。

いくつかの標準的なWntシグナル伝達報告者は文献に記載されており、胚発生におけるWntシグナル伝達の役割を理解するのに非常に役立っています。これらのレポーターのほとんどは、内因性標的遺伝子13,14,15,16,17,18,19を使用しない、合成的に挿入されたTCF/LEF結合部位を利用しています。さらに、遺伝子11,20,21,22,23の自然な位置を尊重するAxin2ノックイン戦略が使用されており、そのうちAxin2-LacZは一般に最も堅牢な標準的なWntレポーターとして受け入れられています¹¹。しかし、レポータータンパク質LacZは、ほとんどの組織で使いやすいにもかかわらず、生細胞²⁴にとって厳しいと認識されているβ-ガラクトシダーゼ基質を必要とする。特に幹細胞や胸腺細胞の場合、厳しいLacZ検出条件により、細胞懸濁液を取り扱う際の細胞死(独自の未報告データ)が増加します。

LacZ染色によるシグナル増幅は、低シグナルの検出には便利ですが、定量化の直接性が損なわれるため、信頼性が低下する可能性があります。したがって、マウスレポーターモデルは、 Axin2-LacZ 遺伝的戦略を模倣するように設計されましたが、mTurquoise2レポータータンパク質²¹を使用して、より直接的で生理学的発現レベルに近い読み取りを提供します。mTurquoise2蛍光タンパク質は、その高輝度(量子収率(QY)= 0.93)、他の蛍光タンパク質との組み合わせによる広範な細胞表面特性評価のための柔軟性、および外因性基質を必要としないため、LacZの優れた代替品です。さらに、緑色蛍光タンパク質(GFP)との密接な遺伝的関係は、必要であれば、非常にWnt感受性の高い細胞において、より強力なシグナル検出のために、ほとんどのGFP認識蛍光抗体を使用する可能性を提供する²⁵。

Axin2-mTurquoise2モデルは、標準的なWntレポーターであるだけでなく、Axin2ヘテロ接合体とホモ接合体(Axin2 ノックアウト)表現型を研究する可能性も提供します。 Axin2 の開始部位にmTurquoise2を標的として挿入すると、Axin2タンパク質が破壊される²¹。Axin2(コンダクチンとしても知られる)はWnt破壊複合体の一部であり、破壊複合体はβ-カテニンを介した転写を厳密に制御しているため、その部分的または完全な欠如は、多様な病状を研究する上で興味深いものとなる可能性があります。たとえば、結腸直腸癌では、Wnt過剰活性化¹¹により、Axin2レベルが比較的高くなっています。しかし、他の病状におけるその役割はまだほとんど知られていません。Axin2はβ-カテニンの分解において限定的な役割を果たすと考えられているが、Wntを介した結腸直腸癌の増殖を阻害する小さなペプチドを添加することで、Wnt調節におけるその役割を強化することができる²⁶。

全体として、Wnt治療標的を介した慎重なWnt制御は、重篤な病状の発症または発症を変える機会を開く可能性があり、レポーター能力を持つモデルでさらに調査する必要があります。本レポートでは、フローサイトメトリーおよび共焦点イメージングのためのAxin2-mTurquoise2マウスモデルのベストプラクティス解析法について説明します。Wntの投与量レベルに関しては、非常に低い標準的なWntシグナル伝達レベルを検出することは困難であり、高度な検出および分析能力がこのモデルの利点を完全に引き出すための利点を提供します。胸腺細胞は、その脆弱な細胞生存率、低い標準Wntシグナル伝達発現、および凝縮した細胞質領域により、Axin2-mTurquoise2モデルの検出感度を表すモデルシステムとして使用されます。さらに、胸腺細胞懸濁液の組織学的全β-カテニン染色手順が説明され、細胞質のβ-カテニンレベルを測定し、レポーターと組み合わせて核活性カノニカルWntシグナル伝達を検証します。

プロトコル

注:すべてのマウス手順は、ライデン大学医療センター(LUMC)の動物実験倫理委員会の承認を得て行われました。Axin2-mTurquoise2レポーターコンストラクトの挿入がないオスとメス、生後6〜12週齢、野生型(wt)、Axin2-murquoise2レポーターコンストラクトの1回の挿入によるヘテロ接合体(Tg / 0)、したがって1つの破壊された Axin2 遺伝子、およびAxin2-mTurquoise2レポーターコンストラクトの挿入によるホモ接合体(Tg / Tg)両方の対立遺伝子、したがって2つの破壊された Axin2 遺伝子。Axin2-mターコイズ2マウス(B6;CBA-Axin2^em1Fstl/Jマウス)を実験に用いた。動物は、臓器隔離の前に_CO2 安楽死によって犠牲にされました。手順全体を通して、サンプルの光への曝露を最小限に抑え、特に指示がない限り、常に氷上または4°Cに保ちます。サンプルをアルミホイルで覆います。すべてのステップは、バイオセーフティキャビネットを備えた標準的な実験室で実行する必要があります。

1. 胸腺細胞懸濁液の調製

1. マウスの腹部を切り開き、鉗子で胸腺を摘出することにより、血液汚染のないマウスから胸腺を慎重に採取します。2.5%の子牛胎児血清(FCS)を含む氷冷したIscoveのModified Dulbecco's Medium(IMDM)で一時的に保管/輸送します。
   注:血液のこぼれや胸腺の損傷の可能性を避けるために、子宮頸部脱臼によってマウスを犠牲にしないでください。.
2. 70 μmのセルストレーナーを備えた50 mLチューブを準備し、1 mLの冷たいIMDM/2.5%FCS培地でフィルターを濡らします。
3. 1 mLシリンジプランジャーの背面先端で臓器をつぶし、冷たいIMDM / 2.5%FCS培地で2回洗浄します(図1A)。必要に応じて、最終濃度50 U/mLのDNAse IをIMDM/2.5% FCS培地に添加して、死細胞の凝集を防ぎます。フィルターを冷たいIMDM/2.5%FCS培地で2回すすぎ、50 mLチューブに穏やかに再懸濁します。
   注:合計終了容量が10mLを超えないようにしてください。細胞は、後続のステップや取り扱いがないときは、氷上や暗闇に置いてください。
4. 330 × g で4°Cで5分間遠心分離し、細胞ペレットから上清を穏やかに吸引します。細胞ペレットを冷たくない不完全なIMDM/2.5% FCS培地に穏やかに再懸濁し、細胞計数の準備をします。
   注:必要に応じて、胸腺細胞を凍結し、FCS-10%ジメチルスルホキシドの液体窒素で保存して、後の実験に使用します。適切な細胞の凍結と融解により、過剰な細胞死が減少します。平均して、胸腺細胞の半分は、胸腺での自然なT細胞選択により、融解後にアポトーシスを起こす可能性があり、クライオバイアルごとに凍結する胸腺細胞の数を決定する際に考慮する必要があります。バイアルあたり2.5×10⁶ 個以上の胸腺細胞を凍結する必要があります。

2. 胸腺細胞フローサイトメトリー用調製

1. 氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)で染色サンプルあたり2.5 × 10⁶ 胸腺細胞を調製することにより、細胞表面染色手順用の胸腺細胞を調製します(図1B)。胸腺細胞が以前に凍結されていた場合は、解凍後の生細胞の数を数えます。必要に応じて、最終濃度50 U/mLのDNAse Iを添加して、死細胞の凝集を防ぎます。
2. 抗体染色パネルは、完全な胸腺細胞サブセットの細胞表面特性評価に使用します。
   注:蛍光色素の他の組み合わせを選択できます。明るい蛍光蛍光色素のまれなポピュレーションマーカーを選択し、可能であれば、生死マーカーを追加します。V450 と V500 のどちらの蛍光色素も、スペクトルが重なるため、mTurquoise2 蛍光レポーターと組み合わせて使用しないでください。mTurquoise2の蛍光スペクトルと青および緑の蛍光色素の組み合わせを常に確認してください(補足図1A)。
   1. 抗体を、PBS/0.2%ウシ血清アルブミン(BSA)/0.1%NaN₃ (アジ化ナトリウム)緩衝液中で、系統陰性(Lin-)パネルの事前に定義された比率で別々に混合します。
      注:すべての不要な細胞(胸腺に存在する非胸腺細胞)は、ストレプトアビジン二次抗体(この例ではフィコエリトリン(Pe)-Cy7およびアロフィコシアニン(APC)-Cy7)で2ステップのプロセスで染色され、フローサイトメトリー分析で「ダンプゲート」を使用して除外できます。
   2. ダブルネガティブ(DN)染色パネルの事前に定義した比率の抗体を、PBS/0.2% BSA/0.1% NaN₃ バッファー中のストレプトアビジン二次抗体Pe-Cy7と混合します。このミックスからLin-パネルを除外します(表1)。
   3. 未熟なシングルポジティブ(ISP)、ダブルポジティブ(DP)、およびシングルポジティブ(SP)染色パネルの事前に定義された比率で抗体を、PBS/0.2% BSA/0.1% NaN₃ バッファー中のストレプトアビジン二次抗体APC-Cy7と混合します。このミックスからLin-パネルを除外します(表1)。
   4. まず、Lin-パネルのビオチン一次抗体混合物を使用して、暗闇の氷上で30分間、胸腺細胞を不要な非T細胞集団で染色します。
      注:各Lin-パネルは異なる細胞セットであるため、1つのサンプルで一緒に染色しないでください。
   5. 300 × g、4°Cで5分間スピンダウンし、上清を取り除きます。胸腺細胞を氷冷PBS/0.2%BSA/0.1%NaN₃ バッファー150μLで洗浄し、300 × g、4°Cで5分間スピンダウンします。
   6. DNパネルと対応するリン染色のISP/DP/SPパネルで、暗所の氷上で30分間染色します。300 × g、4°Cで5分間スピンダウンし、上清を取り除きます。胸腺細胞を氷冷PBS/0.2%BSA/0.1%NaN₃ バッファー150μLで洗浄し、300 × g、4°Cで5分間スピンダウンします。
3. 35 μmのセルストレーナーチューブでホモジナイズし、PBS/0.2% BSA/0.1% NaN₃ バッファーで細胞を取り込み、フローサイトメトリー測定用の細胞を調製します。細胞を光から保護し、フローサイトメーターの測定まで、および測定中も氷上に留まります。
   注:NaN₃ (アジ化ナトリウム)は非常に毒性が高く、致命的です。この物質を扱うときは特別な注意を払う必要があります。取り扱い後は手をよく洗い、NaN₃ を飲み込んだ場合は直ちに毒物管理センターまたは医師または医師に連絡してください。

3. フローサイトメーター測定

注:mTurquoise2シグナルを他のいくつかの蛍光色素と組み合わせて測定するには、実験の経験と知識豊富な平坦化が必要であるため、経験の浅いユーザーはまずフローサイトメーターのトレーニングを受ける必要があります。フローサイトメーターについては、 材料の表 を参照してください。

1. ユーザーマニュアルまたはその他の確立されたプロトコルに従ってフローサイトメーターを始動します。バンドパスフィルターをフローサイトメーターにセットし、必要に応じて調整して、最適な蛍光検出戦略を実現します。
   注:mTurquoise2の推奨フィルターは、紫外線405 nm、407 nm、またはあまり一般的ではない440 nmレーザーラインで470/20 nmです。
2. 市販のコンペンセーションビーズと安定トランスフェクトされたmTurquoise2発現293T細胞を使用してコンペンセーション設定を確立することにより、フローサイトメーターをキャリブレーションします。
   注:単一染色されたwt胸腺細胞は、補償ビーズの代わりに使用できます。この場合、ビーズによる補償は、細胞を使用するよりも同等に効率的で便利でした。
   1. 実験で使用した個々の蛍光色素でビーズを標識し、未染色のビーズを含めます。ビーズを測定してコンペンセーション設定パネルを設置し、ビーズに使用できるmTurquoise2に一致する蛍光色素がないため、mTurquoise2を発現する293T細胞を測定します。実際の実験で使用するために、補正設定を保存します。
      注:コンペンセーション設定に使用するmTurquoise2発現細胞は、実際の実験のmTurquoise2発現胸腺細胞と同じかそれ以上に明るくなければなりません。mTurquoise2陰性の293T細胞も存在することを確認してください。
   2. 実験には、mTurquoise2 FMOのwtサンプルと各マウス遺伝子型の未染色胸腺細胞のサンプルを含む、蛍光マイナス1(FMO)Tg/Tg染色胸腺細胞を分析部分のポジティブコントロールとして含めます。
      注:これらのコントロールは、ポジティブセルのゲートを適切に設定するために重要です。残りの実験サンプルは、完全な染色パネルで染色されます(表1)。
      1. 実験を作成し、フローサイトメーターソフトウェアでチューブ数を追加して名前を付け、蛍光色素の完全なセットの染色細胞を視覚化するための散布図を作成します。
      2. 以前に設定した補正設定を実験に適用します。未染色の胸腺細胞で前方散乱光(FSC)と側方散乱光(SSC)を調整し、細胞の全集団が散布図に表示されるまで調整します。まず、未染色のTg/Tg mTurquoise2発現胸腺細胞を測定し、陽性集団が見えるようにします。
      3. Tg/Tgを完全に染色した胸腺細胞サンプルを測定し、すべての蛍光色素の組み合わせを確認します。必要に応じて、誤った補正を示す蛍光色素に対して以前に設定した補正値を調整します。残りの実験サンプルを測定し、サンプルの測定中に設定を調整しないでください。
         注:その後の補正調整は、解析ソフトウェアパッケージで実行することもできます。使用可能なセルの数が制限要因になる可能性がありますが、測定中にこの手順を実行することをお勧めします。mTurquoise2 強度値を比較するために、すべてのサンプル間で設定を等しく保ちます。

4. フローサイトメトリー解析

注:フローサイトメトリー解析は、 材料表に記載されている特定のソフトウェアを使用して実施しました。ただし、他のフローサイトメトリー解析プログラムも利用できます。

1. 生細胞と胸腺細胞サブセットをFSCおよびSSC値に従ってゲートします。
2. サンプルの左側にある コンペンセーションマトリックス ダイアログボックスのコンペンセーション設定をチェックして、蛍光色素の干渉がないこと、およびスピルオーバーやブリードスルーを避けるために適切なコンペンセーションが行われていることを確認してください。
   1. 取得定義のマトリックスを調整する必要がある場合は、母集団がほぼ完全な水平線または垂直線を示さないように、すべての蛍光色素の組み合わせの補正値を単に増減して、補正マトリックスの値を変更します(補足図1B)。
3. mTurquoise2の強度を視覚的に広げて適切な正のゲーティングを実現するには、mTurquoise2のX軸ディスプレイをリニアに変更します(補足図2)。
   1. mTurquoise2 FMOコントロールをmTurquoise2ポジティブシグナルゲーティングのネガティブコントロールとして使用します。細胞集団ごとの正しい閾値ゲーティングを修正します(図2)。
      注:(wt)mTurquoise2 FMOコントロールセルにはmTurquoise2マーカーがないため、Axin2レポーター活性のバックグラウンド閾値として使用できます。
4. 適切な検出チャネルを使用してmTurquoise2陽性細胞をゲートし、Wnt陽性の細胞の数を定義します。
5. 幾何平均と中央値を計算して、目的の細胞の蛍光強度の量を定義します。
   1. [統計] |パネル内に mTurquoise2 陽性セルを示す統計量を追加します。
   2. 統計法、対象母集団、mTurquoise2の検出チャネルを定義し、 追加をクリックします。幾何平均と中央値の蛍光強度を任意の単位(AU)で表してグラフをプロットします。
      注:中央値は蛍光強度の中央値を表しているため、蛍光強度の人口シフトに関する情報を提供します。必要に応じて、バックグラウンド補正を行うことで、mTurquoise2レポーターのダイナミックレンジをより鮮明に視覚化することができます。これは、ゲートされた特定の細胞タイプのmTurquoise2陽性細胞の総頻度から重量バックグラウンド染色頻度を差し引くことによって行うことができます。

5. 共焦点イメージングのための胸腺細胞細胞スピンの調製

注:胸腺細胞のサイトスピンは、非接着細胞の細胞懸濁液を扱う場合に推奨されます。胸腺細胞におけるAxin2-mTurquoise2の発現は胸腺上皮細胞よりも低いため、イメージングにはろ過された胸腺細胞懸濁液を使用しました。

1. 採取したばかりまたは凍結した胸腺細胞の細胞懸濁液から始めます。胸腺細胞の遺伝子型ごとに、100 μL の冷 PBS/0.5% BSA/10% FCS に ~20,000 個の胸腺細胞を懸濁します。
   注:必要に応じて、以前に凍結した胸腺細胞で作業するときに細胞の生存率を最大限に維持するために、細胞を穏やかに解凍します。これにより、細胞をイメージングする際の自家蛍光が少なくなります。サンプルの品質を確保するために、細胞の生存率を確認します。サイトスピン法は、壊れやすい胸腺細胞に適応した機械的な力を使用します。それにもかかわらず、それは非常に生存可能な開始人口を必要とします。生存率を高めるためには、凍結した胸腺細胞ではなく、収穫したばかりのものから始めることをお勧めします。
2. フィルターカードの開口部の周りの領域をPBSで事前に濡らします。cytospinサンプルチャンバーホルダーは、マニュアルに従って組み立てます(図1C)。
   1. フィルターカードをフロストスライド(スライドガラスに対して滑らかな面)に置きます。両方のアイテムをサンプルチャンバーホルダーに置きます。フィルターカードをサンプルチャンバーホルダーの穴に正確に配置するように注意し、サンプルチャンバーホルダー全体をローターに配置します。
3. 胸腺細胞を慎重に再懸濁し、サンプルチャンバーに100μLの細胞懸濁液を加えます。胸腺細胞懸濁液を ~350 × g で 4 分間、フロストスライド上に回転させます。セルに触れずに、フィルターカードをフロストスライドから慎重に取り外します。細胞スピンを室温で1時間から一晩までの期間風乾します。
   注:他の細胞タイプで作業する場合は、最適な結果を得るために異なる細胞密度をテストしてください。サイトスピンは、後で実験するために、密閉された箱で-20°Cで凍結できます。細胞スピンを解凍し、室温で1時間さらに取り扱います。

6. 全β-カテニンによるサイトスピン免疫染色

1. 細胞スピンを100%メタノール中で室温で15分間固定します。スライドを室温で10分間風乾します。疎水性ペンでスライドガラス上の胸腺細胞集団の周りに円を描きます。
   注:この固定ステップは、β-カテニン染色に特化して最適化されています。
2. スライドをPBS/0.05% Tween-20に室温で10分間置き、ブロッキングおよびインキュベーションステップ中に暗く湿ったボックスに移します。スライド1枚あたり100 μLのPBS/10%正常マウス血清(NMS)を加え、室温で10分間湿ったボックスに入れておきます。スライドを軽くたたいて10% NMSを取り出し、スライド1枚につき100 μLのPBS/10%正常ヤギ血清(NGS)を加え、室温で30分間湿った箱に入れておきます。
   注:PBS/10% NMSによるインキュベーションは非特異的一次抗体の結合をブロックし(図1D)、PBS/10% NGSによるインキュベーションは非特異的二次抗体の結合をブロックします。
3. 細胞染色用の追加の抗体を調製します。0.5 μgの総β-カテニン抗体をAF568標識フラグメントと混合します。
   注:この設定では、市販の標識キットを使用して、一次抗マウス総β-カテニンと二次ヤギ-抗マウスIgG1 FabフラグメントをAlexa Fluor 568(AF568)蛍光色素ラベルで事前に標識し、胸腺細胞に添加しました。いくつかの濃度をテストする必要がある場合があるため、製造元のプロトコルに従ってラベリングを実行します。β-カテニン-AF568標識抗体を30分以内に使用してください。
4. サイトスピンスライド1枚につき、総β-カテニン-AF568標識抗体50 μL (0.5 μg) を湿った箱に4°Cで一晩加えます。メーカーのプロトコルに従ったネガティブ染色コントロール、または直接ラベリングプロトコルの場合はアイソタイプコントロールを含めてください。
5. PBS/0.05% Tween-20 を室温で 20 分間洗浄します。次に、攪拌しながら瓶の中で室温でPBSで20分間洗浄します。抗体が抗原に結合することを確認するために、2回目の固定ステップを実行します:湿ったボックス内のPBS中の100μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を室温で10分間。
   注意: スライドは暗く保管してください。メタノールもPFAの固定も、mTurquoise2の発現に有意に影響しない²⁷。
6. スライドをPBSに浸します。TO-PRO-3 (1:1500) 50 μL の TO-PRO-3 (1:1500) を室温で 10 分間、湿潤ボックス内で核染色します。スライドをPBSで室温で20分間、攪拌しながら瓶に入れて洗浄します。
   注:TO-PRO3濃度は、蛍光スペクトルが近くにある他の蛍光色素の使用に応じて滴定できます。
7. メーカーのプロトコルに従って、試料に色あせ防止剤を埋め込み、カバースリップで覆います。室温で24時間風乾します。スライドを蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡で直接観察するか、後でイメージングするために-20°Cで保存します。

7. 共焦点顕微鏡測定

注意: 共焦点顕微鏡については、 材料の表 を参照してください。

1. マニュアルまたは確立されたプロトコルに従って共焦点顕微鏡のスイッチを入れます。共焦点設定の一次調整には、ネガティブおよびポジティブの安定トランスフェクトmTurquoise2 293T細胞株コントロールを使用してください。その後、wt Axin2-mTurquoise2および Tg/Tg (ノックアウト)Axin2-mTurquoise2胸腺細胞をそれぞれネガティブコントロールおよびポジティブコントロールとして使用し、mTurquoise2シグナルの曝露不足がないことを確認します。
2. シーケンシャルスキャン用のソフトウェアを準備するには、レーザーとフィルター幅をプログラミングします。最初に最も波長の高いレーザーラインから始めて、最も低い波長に向かって作業します。すべてのシーケンシャルスキャンステップがインストールされたら、サンプルを顕微鏡ステージにロードし、サンプルの焦点を合わせ、 Live を押して、共焦点ソフトウェアまたはオプションのマニュアルパネルのそれぞれのボタンを使用して レーザー出力 と スマートゲイン を最適化します。
   注:スライドの試料切片は、光退色が発生する可能性があるため、シグナル定量のためにイメージングしないでください。しかし、mTurquoise2は光安定性^が高い25。
3. mTurquoise2の発現が非常に低い場合は、蛍光シグナルが観察されるまでレーザー出力とスマートゲインを増やし、ネガティブコントロールサンプルで真の陽性シグナルを確認します。40×1.4のオイルレンズ、63×1.4のオイルレンズ、または100×1.4のオイルレンズで胸腺細胞を可視化します。
   注:この研究では、ライカSP5顕微鏡を使用しました。
4. サンプルを測定する前に、これらの共焦点イメージング設定を顕微鏡で使用してください。
   1. 強度値の範囲を12ビット画像に調整するには、[ Configuration |設定 | [ビット深度 ] オプションで 12 ビットに変更すると、より広範な強度スケールが作成され、低蛍光シグナルと高蛍光シグナルの区別が広がります。
   2. XYをクリックして画像の解像度を調整し、フォーマットを1024 x 1024に増やすと、スキャン時間が2倍になります。スキャン速度を400〜600 Hzに調整するには、[速度]をクリックします|[その他] をクリックして、手動で設定を変更します。さらに、双方向スキャンオプションを有効にします。
   3. 感度スライダーを調整して、バックグラウンド信号を減らします。 Quick LUT(ルックアップテーブル) オプションで、正しいレーザー出力とスマートゲインを最適化します。
      注:12ビット画像では、スライダーのグレースケール強度値は0〜4095です。これは、後で無料のオフラインLas Xソフトウェアを使用して行うこともできます。緑色は黒い背景を示し、青色はサンプルの飽和ピクセルを示します。
5. すべてのイメージング設定が最適化されたら、[ Start]をクリックしてサンプルを測定すると、3つのチャンネルすべてのシーケンシャルイメージングが開始されます。
   1. TO-PRO-3 核蛍光シグナルを測定します。TO-PRO-3は633nmレーザーとHyD 640-750nmで検出します。
      注:このセットアップでは、6%のレーザー出力が15%のスマートゲインで使用されました。この設定は、TO-PRO-3染色の強度によって変わることがあります。非常に明るい場合、過度に励起されると、低強度の蛍光色素に影響を与える可能性があります。このような場合は、染色濃度を下げてください。
   2. β-カテニンの核および細胞質の蛍光シグナルを測定します。β-カテニンを561 nmレーザーとHyD 580-605 nmで検出します。AF568信号が少ない場合は、ソフトウェア内の XY ボックスの設定をライン平均2で調整することにより、1つの画像に対して最大568スキャンを蓄積します。
      注:このセットアップでは、85%のレーザー出力が87%のスマートゲインで使用されました。
   3. mTurquoise2細胞質蛍光シグナルを測定します。mTurquoise2を458 nmレーザーとHyD 490-600 nmで検出します。mTurquoise2信号が低い場合は、ソフトウェア内の XY ボックスで設定を調整し、ライン平均4で1つの画像に対して最大4スキャンを蓄積します。
      注:このプロトコルに使用された共焦点顕微鏡の古いレーザーと低mTurquoise2信号のため、405 nmが90 %のレーザー出力で使用され、458 nmおよび476 nmのレーザーが100 %のレーザー出力で使用され、HyD 490-550 nmが100 %のスマートゲインで使用されました。440 nmレーザーは、共焦点顕微鏡にはあまり一般的ではありませんが、最も最適です。高出力のレーザーは慎重に取り扱い、シーケンシャルイメージングでのみ実行する必要があります。検出器の過度の露出を避けるために、緊急設定が実施されていることを確認してください。他の共焦点顕微鏡のレーザー出力は、より強力なレーザーまたは新しいレーザーのために、このプロトコルで提案されているものよりも劣る可能性があります。イメージング前に蛍光シグナルが失われないことを確認できるように、漂白試験を実施することができます。提案されたセットアップでは、mTurquoise2の光退色は許容範囲内でした。
   4. 明視野イメージングを実施して、細胞全体を可視化します。488 nmレーザーとPMT Scan-DICで胸腺細胞を検出します。画像解析用に LIF ファイルをエクスポートします。
      注:このセットアップでは、59%のレーザー出力を使用し、ゲインは212V、データオフセットは-4.3%でした。LIFファイルは、オフラインのLAS xソフトウェアで読み込んで画像補正を行うことができます。

8. 共焦点顕微鏡分析

1. 画像処理ソフトウェア²⁸ (補足図3)を使用して画像を分析します。ソフトウェアに画像をロードします。
   注:複数の形式を使用できますが、LUTを使用したTIFFファイル、または画像処理ソフトウェアへのLIFファイルの直接インポートをお勧めします。
2. 胸腺細胞核内の活性β-カテニンシグナルを測定します。
   1. 活性型β-カテニンの解析のために、赤灰色の画像でTO-PRO-3染色胸腺細胞の核を選択します。これは手動で行うか、ソフトウェアで自動セル選択を使用します。
      注:自動セル選択では、適切な閾値処理と粒子分析のために画像処理が必要になる場合があります。手動の細胞選択は面倒な場合がありますが、一般的には画像処理を必要とせず、このプロトコルで推奨されます。
   2. ワークバーの選択ツールのいずれかを使用して手動選択をアクティブにします。
      1. 核のコンターを選択し、それを関心領域 (ROI) マネージャーに追加します。ROIマネージャーをアクティブにするには、[ 分析]|ツール |ROI マネージャーを選択し、新しい ROI マネージャー ウィンドウが開いたら、最初のオプション [追加] (t) をクリックするか、キーボード ショートカットの t を使用します。すべての核が定義され、ROIマネージャーに追加されるまで、前の手順を繰り返します。ROI マネージャーの [ すべて表示 ] オプションを使用して、選択したセルを視覚化します。
   3. セルが存在しない >3 個の背景領域を選択し、これらを ROI マネージャーに追加します。
      注:この場合、サイズと形状は重要ではありません。これらの領域は、最終計算のバックグラウンドノイズ計測として機能します。
      1. 画像上の測定値を定義するには、[ 分析] |測定値を設定します。新しいウィンドウが開き、さまざまな測定オプションが表示されたら、[ 面積]、[積分密度]、および [平均グレー値 ]をアクティブにします。 [OK]をクリックします。
      2. β-カテニンのグレー値の画像をクリックしてアクティブにし、ROIマネージャーでShow all をクリックして選択した核と背景領域を視覚化します。選択したすべての領域が β-catenin 画像に表示されていることを確認します。
      3. ROI Managerで Measure をクリックするか、 Analyze |測定します。新しい [結果 ] ウィンドウが開き、ROI 内の β-catenin 信号の結果が表示されます。
      4. 結果をスプレッドシート計算プログラムに転送するには、[ 編集] |すべて選択します。さらに計算するために、リストをスプレッドシートにコピー/貼り付けます。ROIマネージャーを後で参照できるように保存して、核の選択を繰り返すことなく、[ その他] |セーブ。。。。
   4. 自動セル選択の場合は、多くの画像処理設定が元に戻せないため、処理する画像の 複製 (キーボードCtrl D)を作成します。
      注:自動核標識には、ほとんどの場合、原子核を自動的かつ正確に定義するための画像処理が必要です。画像処理は、エリア選択の目的でのみ行う必要があります。処理された画像は、ピクセル値が変更されるため、蛍光強度の測定には役立ちません。
      1. ガウス フィルターを実行するには、[ プロセス] |フィルター |画像を滑らかにするためのガウスぼかし 。複数のシグマ(半径)値をテストし、 プレビュー オプションをアクティブにして効果を視覚化してから [OK]をクリックします。
      2. 画像を反転するには、[ 編集] |反転。明るさとコントラストを確認するには、[ 画像]をクリックします|調整 |明るさ/コントラスト。 [自動 ] オプションを使用するか、できれば手動で値を変更します。
         注: 変更 を適用する と、イメージのプロパティが変更されるため、適用しないでください。目的の画像が取得されたら、 B&C ウィンドウを閉じるだけです。
      3. しきい値を作成するには、[ 画像] |調整 |[しきい値] を選択し、すべてのセルがほとんど表示される最適な [しきい値] 設定を定義します。 [適用 ] をクリックして、しきい値設定を適用します。
         注: 穴が表示されているセルにしきい値が適用されていない場合は、[ プロセス] |バイナリ |穴を埋め て、セル内のギャップを埋めます。セルがしきい値設定とともに融合されている場合は、[ Process |バイナリ | これらのセルを分離するための分水界。細い 1 ピクセルの線は、プログラムが融合したと解釈するセルを分離します。
      4. フリーハンド選択ツールで選択した核を手動で選択し、ROIマネージャーに追加して、画像内の最小および最大の核を定義します。
      5. 粒子(原子核)を分析するには、[分析] |パーティクルを分析し、最小の Area と最大の Area を Size (^2) ボックスにハイフン (-) を挟んで挿入します。「結果を表示」、「マネージャーに追加」、および「エッジで除外」ボックスをアクティブにしてから、「OK」をクリックします。手順 8.2.3 に進み、プロトコルを完了します。
3. 胸腺細胞の細胞質mTurquoise2およびβ-カテニンシグナルを測定します。
   1. 上記と同じ手順に従って、明視野画像で胸腺細胞全体の輪郭を選択します。
   2. セルが存在しない >3 個の背景領域を選択し、これらを ROI マネージャーに追加します。
      注:この場合、サイズと形状は必須ではありません。これらの領域は、最終計算のバックグラウンドノイズ計測として機能します。
      1. mTurquoise2 グレー値の画像をクリックしてアクティブにし、ROI マネージャーで [ すべて表示 ] をクリックして、選択したセルの合計 ROI と背景領域を視覚化します。mTurquoise2 画像に表示されている選択した領域をすべて観察します。
      2. ROI マネージャーで [測定 ] をクリックするか、[ 分析] |測定します。新しい [結果 ] ウィンドウが開き、mTurquoise2 信号の測定結果が表示されます。
      3. 結果をスプレッドシート計算プログラムに転送するには、[ 編集] |すべてを選択し、リストをコピーしてスプレッドシートに貼り付けて、さらに計算します。
      4. β-cateninグレー値の画像をクリックしてアクティブにし、ROIマネージャーでShow all をクリックして、選択したセルROIの合計と背景領域を視覚化します。β-catenin画像に表示されている選択した領域をすべて観察します。
      5. ROI マネージャーで [測定 ] をクリックするか、[ 分析] |測定します。新しい 結果 ウィンドウが開き、細胞全体のβ-カテニンシグナルの測定結果が表示されます。
      6. 結果をスプレッドシート計算プログラムに転送するには、[ 編集] |すべてを選択し、リストをコピーしてスプレッドシートに貼り付けて、さらに計算します。ROIマネージャーを後で参照できるように保存しておけば、セルの選択を繰り返すことなく、[ 詳細] |セーブ。。。。
4. 式 1 を使用して、活性型 β-カテニンの補正済み全核蛍光 (CTNF) を計算します。
   CTNF = 積分密度 - (面積 × 平均背景面積) (1)
5. 式 2 を使用して、mTurquoise2 の補正済み全細胞蛍光 (CTCF) を計算します。
   CTCF = 積分密度 - (面積 × 平均背景面積) (2)
6. ステップ8.2.3.3で得られた核β-カテニンの値を差し引くことにより、活性核β-カテニンと細胞質β-カテニンを区別します。ステップ8.3.2.5で得られた全細胞β-カテニン値から、細胞質不活性β-カテニンを得る。
   注意: 測定が同じセル内で行われていることを確認してください。
   1. 背景領域の平均強度の平均を計算します。式 1 と 2 を使用して CTNF と CTCF を計算します。 IntDen (選択した領域内のすべてのピクセルの合計) を RawIntDen ではなく、Integrated density と見なします。
   2. 必要に応じて、グラフをプロットするためのIntDen値の標準偏差を計算します。Mann-Whitney U検定を使用した統計分析のために、最大200個の別々のセルを考えます。
7. 結果を個々のデータポイントグラフにプロットし、Y軸にCTNFまたはCTCFの値で 相対蛍光単位(RFU)のラベルを付けます。

結果

標準的なWntシグナル伝達の役割を調べるために、Axin2-mTurquoise2の標準的なWntレポーターモデルをβ-カテニンタンパク質の発現と組み合わせて試験しました。胸腺細胞は壊れやすいことが知られており、胸腺細胞の成熟過程のいくつかの段階で標準的なWntシグナル伝達が低く、細胞質と核の比率が低くなっています。これらすべての要因が、細胞質のmTurquoise2またはβ-?...

ディスカッション

いくつかの標準的なWntレポーターは、異なるレポーター感度と実際のレポータータンパク質で利用可能です。合成的に導入された多量体TCF/LEF結合部位を用いたレポーターモデルは、蛍光レポータータンパク質とともに利用可能です。しかし、このような導入遺伝子の反復は、育種中または長期間の in vivo 実験中に失われることがあり、レポーターの発現に影?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD FACScantoII flow cytometer	BD Biosciences	not aplicable	Serial number V96300710. The flow cytometer setup in this protocol contains a 405 nm laser line with 505 longpass filter and 530/30 nm bandpass filter, and 470/20 nm bandpass filter; a 488 nm laser with 735 nm longpass filter and 780/60 nm bandpass filter, 670 nm longpass filter and 655 nm longpass filter, 610 nm longpass filter, 550 nm longpass filter and 575/26 nm bandpass filter, 505 nm longpass filter and 530/30 nm bandpass filter, and 488/10 nm bandpass filter; and a 633 nm laser line with 735 nm longpass filter and 780/60 nm bandpass filter, 685 nm longpass filter, and 660/20 nm bandpass filter.
BSA	Sigma	A9647
Corning 70 μm cell strainer	Falcon/Corning	352350
Cytospin 4 Type A78300101	Thermo Scientific	not aplicable
DMSO	Sigma Aldrich	D5879-1L
DNAse I	Sigma	A9647
Falcon 50 mL Conical Centrifuge tubes	Greiner bio-one	227261
Falcon round-bottom Polystyrene Test tubes with cell strainer snap cap	Fisher Scientific	352235
Fetal Calf Serum (FCS)	Greiner Bio-One B.V.	not aplicable	Depends on origin
Fiji software	ImageJ	not aplicable	Version 1.53
Filter card white (for cytospin)	VWR	SHAN5991022
FlowJo 10 software	Treestar	not aplicable	Version 10.5.3
Frost slides	Klinipath
Gibco IMDM medium	Fisher Scientific	12440053
HCX PL APLO 40x 1.4 OIL lens	Leica microsystems	not aplicable
Hydrophobic pen: Omm Edge pen	Vector	not aplicable
Leica TCS SP5 DMI6000	Leica microsystems	not aplicable	The microscope setup in this protocol consisted of an HCX PL APO 40x/1.2 oil-immersion objective with 8-bit resolution, 1024 pixels x 1024 pixels, 400 Hz speed, pinhole 68 µm, and zoom factor of 1.5 at room temperature. This system contains a 405 diode laser, argon laser, DPSS 561 laser, HeNe 594 laser and HeNe 633 laser with 4 hybrid detectors (HyDs) and 5 photomultiplier tubes (PMTs).
Methanol	VWR	1060091000
NaN3/sodium azide	Hospital farmacy	not aplicable
Normal mouse serum	Own mice	not aplicable
PBS	Lonza	BE17-517Q
ProLong Diamond Antifade Mountant	Fisher Scientific	P36965
Purified mouse anti-β-catenin (CTNNB1)	BD Biosciences	610154
TO-PRO-3 Iodide	Thermofisher	T3605
Transparent nailpolish	at any drugstore	not aplicable
Tween-20	Sigma Aldrich	P1379-500ml
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 labeling kit	Thermofisher	Z25006