مقياس فلوريمتر مصغر مفتوح المصدر لمراقبة تفاعلات تضخيم حمض النيوكليك Isothermal في الوقت الفعلي في الإعدادات المحدودة الموارد

Summary

يتم توفير تعليمات مفصلة لبناء مفتوحة المصدر، وحدات الفلورمتر التي تتوافق مع العديد من سخانات منخفضة التكلفة لأداء الوقت الحقيقي، والكمي التضخيم حمض النووي isothermal.

Abstract

تعتمد الطرق التقليدية للكشف عن الأحماض النووية وقياسها كميا على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتتطلب استخدام مدورات حرارية باهظة الثمن مع اكتشاف مضان متكامل لل amplicons. تقنيات تضخيم الحمض النووي Isothermal القضاء على الحاجة إلى ركوب الدراجات الحرارية; ومع ذلك، لا يزال الكشف عن المنتجات القائم على الفلورسينس مطلوبا لتحقيق نتائج كمية في الوقت الحقيقي. العديد من سخانات isothermal المحمولة مع الكشف عن مضان متكاملة متاحة الآن تجاريا; ومع ذلك، تظل تكلفة هذه الأجهزة عائقا كبيرا أمام اعتمادها على نطاق واسع في البيئات المحدودة الموارد. وصف هنا هو بروتوكول لتصميم وتجميع وحدات، منخفضة التكلفة الفلوريمتر شيدت من المكونات الجاهزة. تم تصميم مقياس الفلوري، المغلق في مسكن مطبوع ثلاثي الأبعاد مدمج، ليتم وضعه فوق كتلة حرارية متاحة تجاريا تحمل أنبوب PCR. تم تحسين مقياس الفلوريمتر الموصوف هنا للكشف عن صبغة إيزوثيوسيانات الفلورسين (FITC) ، ولكن يمكن تعديل النظام للاستخدام مع الأصباغ المستخدمة عادة كمراسلين في تفاعلات تضخيم حمض النيوكليك في الوقت الحقيقي. ويتجلى التطبيق السريري للنظام من خلال إجراء الكشف عن الحمض النووي في الوقت الحقيقي مع اثنين من تقنيات التضخيم إيزوثرمال: إعادة دمج بوليمرات التضخيم (RPA) للكشف عن الحمض النووي للسيطرة الإيجابية المقدمة في مجموعة تجارية والنسخ العكسي حلقة بوساطة التضخيم الحراري (RT-LAMP) للكشف عن مستويات ذات مغزى سريريا من سارس-CoV-2 RNA.

Introduction

وتستخدم على نطاق واسع تقنيات التضخيم Isothermal للكشف عن الأحماض النووية. بالمقارنة مع النهج التقليدية PCR التي تتطلب التربيع الحراري، والتضخيم isothermal يسمح تضخيم الحمض النووي أن يحدث في درجة حرارة واحدة، وبالتالي تمكين أسرع الوقت إلى النتائج والتسامح أفضل من^{مثبطات 1،2}. فائدة رئيسية أخرى من التضخيم isothermal هو انخفاض تعقيد الأجهزة. معظم تفاعلات التضخيم isothermal تتطلب فقط كتلة الحرارة والكشف عن طريقة إما في الوقت الحقيقي عن طريق رصد الفلورية أو الكشف عن نقطة النهاية، على سبيل المثال عن طريق التدفق الجانبي أو هلام electrophoresis^3،4. يتم إنجاز الكشف عن الفلورسينس في الوقت الحقيقي من خلال الكشف عن الفلورسينس التي تنتجها الأصباغ المتشابكة التي تنشط في وجود الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل أو مسابير الفلورسنت المروية التي تنشط في وجود تسلسل الحمض النووي المحدد المزدوج الذين تقطعت بهم السبل.

في حين أن تتوفر تجاريا benchtop isothermal الفلورية موجودة ، وكثير من عدم التخصيص لتنفيذ المقايسة. على سبيل المثال، تتطلب العديد من الأجهزة المواد الاستهلاكية المحددة أو التي توفرها الشركة، أو توصي البائعين المفضلين، أو تستخدم برامج خاصة للحصول على النتائج المعلن عنها. وتكلف معظم هذه النظم أكثر من 000 5 دولار أمريكي، مما يمثل حاجزا كبيرا أمام الاستخدام الواسع النطاق في البيئات المحدودة الموارد. وبالإضافة إلى ذلك، يواجه المستخدمون في البيئات منخفضة الموارد تحديات في صيانة المعدات المصممة لبيئات الموارد العالية بسبب الظروف البيئية القاسية، وضعف سلاسل التوريد لقطع الغيار، والأدوات المتخصصة اللازمة للصيانة والإصلاح^5. لتلبية هذه الحاجة، وصفها هنا هو تصميم وتجميع وحدات ومنخفضة التكلفة الفلوريمتر شيدت من المكونات الجاهزة المغلقة في السكن المطبوعة 3D المدمجة (الشكل 1A-C) مع اثنين من التكوينات الاختيارية. يستخدم التكوين الأول لهذا الجهاز مرشحات زجاجية متاحة تجاريا ومرآة ديكهروبيك لمنع ضوء الخلفية الزائد وتبلغ التكلفة الإجمالية للتجميع 830 دولارا أمريكيا. في حين أن هذه المرشحات تستخدم عادة في أنظمة التصوير القائمة على الفلورسينس ، فإن استبدال رقائق التصفية البصرية عالية الجودة باهظة الثمن قد ثبت سابقا أنه يسمح بالكشف عن الحمض النووي⁶. التكوين الثاني من الفلوريمتر يتضمن هذه المرشحات غير مكلفة ويستبدل المرايا ديكهروي مع φ1/2 "شعاع التقسيمات, خفض التكلفة الإجمالية للنظام من $830 إلى $450 USD.

يتم عرض الصور التمثيلية للتكوين الأول في الشكل 1 والشكل 2، ولكن يمكن العثور على صور مماثلة للتكوين الثاني في الملف التكميلي 6. ولتجنب الحاجة إلى محاذاة بصرية متخصصة، حدد النظام البصري مناطق لوضع كل مكون بصري ويمكن صنعها بطابعة ثلاثية الأبعاد منخفضة نسبيا، مما يسمح بالاستخدام الواسع النطاق للتصميم. الاختلافات الوحيدة في البناء والتجميع للتكوينين هي الملفات المستخدمة للطباعة ثلاثية الأبعاد والمكونات البصرية الموضوعة في الحاوية. الأبعاد الخارجية للعلبة المطبوعة ثلاثية الأبعاد لكلا النظامين هي نفسها. وتظهر مقارنة تكلفة النظامين في الجدول 1.

كما هو مبين في الشكل 1A، للحفاظ على عامل شكل صغير ، يتكون الفلوريمتر من البصريات Φ1 /2 " (~ 12.5 مم) ، إلى جانب الإضاءة المدمجة والكشف التي يتم وضعها لقياس الإشارة من خلال الجزء العلوي من أنبوب PCR. تم تصميم النظام في الشكل 1 للكشف عن الأصباغ مع ذروة الإثارة والأطوال الموجية الانبعاثات بالقرب من 490 نانومتر و 525 نانومتر، على التوالي، بما في ذلك FITC والأصباغ ذات الصلة الوثيقة مثل SYBR و SYTO-9، والتي تستخدم عادة كمراسلين في الوقت الحقيقي تفاعلات تضخيم حمض النيوكليك^7،8. مصدر الإثارة، والمرشحات البصرية، وكاشف يمكن بسهولة أن تحل محل المكونات المتوافقة مع الأصباغ الفلورية المختلفة على النحو المطلوب. وعادة ما يتم تنفيذ تفاعلات تضخيم الحمض النووي في أنابيب PCR، وقد تم تصميم الفلورمتر ليتم وضعه فوق أي كتلة حرارية متاحة تجاريا تحمل أنابيب PCR(الشكل 1D)مما يسمح بمراقبة التفاعلات الحرارية في الوقت الحقيقي. تتوفر كتل الحرارة المناسبة في معظم مختبرات الطب الحيوي ويمكن شراؤها بأقل من 500 دولار أمريكي.

وقد ثبت في السابق استخدام أجهزة الكمبيوتر ذات اللوح الواحد لتوفير بديل منخفض التكلفة ونقطة رعاية للتحكم في تقنيات التصوير^9. بناء على هذا العمل ، في هذا البروتوكول واجهة مستخدم رسومية واحدة تعمل بالكمبيوتر(الشكل 1D)يستخدم لتسهيل تسجيل البيانات في الوقت الحقيقي وعرض النتائج عند نقطة الرعاية ، مما يلغي الحاجة إلى جهاز كمبيوتر محمول لمعالجة البيانات أو تصورها. ونقلت قياسات الفلورسينس من خلال بروتوكول I²C من أجهزة استشعار الضوء إلى متحكم دقيق، ثم أتيحت للكمبيوتر أحادي اللوح من خلال الاتصالات التسلسلية. وتم توفير وصلات كهربائية للإضاءة ونقل البيانات من خلال أسلاك مبسطة وحام على ألواح الخبز المصغرة، مما ينفي الحاجة إلى لوحات دوائر مطبوعة متخصصة. البرنامج المطلوب لتشغيل الفلوريمتر متاح من خلال أطر البرمجيات مفتوحة المصدر ويتم توفير التعليمات البرمجية المطلوبة لتشغيل الجهاز في ملفات الترميز التكميلية. يمكن تجميع الفلوريمتر الكامل مقابل ما بين 450 إلى 830 دولارا أمريكيا ، وتظهر النتائج أنه يوفر قياسات مفلورة دقيقة وموثوقة لمراقبة التضخيم الحراري الحقيقي للأحماض النووية.

Protocol

1. خطوات التحضير: الطباعة ثلاثية الأبعاد والحام

ملاحظة: تم تصميم النظام البصري الموضح في هذا البروتوكول لسخان كتلة جافة قياسية.

1. لإنشاء التكوين الأول، طباعة 3D CAD الملفات المقدمة كملفات تكميلية 1 و 2 و 3 على التوالي:
2. لإنشاء التكوين الثاني، طباعة 3D CAD الملفات المقدمة كملفات تكميلية 3 و 4 و 5، على التوالي:
   ملاحظة: تم تصميم هذه الأجزاء ليتم طباعتها مع دعامات. في هذا الدليل، يتم استخدام خيوط البولي الأسود التي يمكن أن تحافظ على شكلها بعد التعرض لدرجات حرارة تصل إلى 110 درجة مئوية. بشكل عام ، يمكن استخدام أي مادة يمكن تسخينها لدرجة حرارة التفاعل الإيزوثرمال المطلوب دون تشوه كبير. لتقليل تأثير الانعكاسات الداخلية وتداخل الضوء المحيط، يوصى باستخدام مادة سوداء أو لون داكن آخر.
3. إعداد وحدتي تقييم أجهزة الاستشعار من الضوء إلى الرقمي لرصد عينتين متوازيتين. على واحدة من لوحات اختبار الاستشعار، وإزالة المقاوم R4، ولحام سلك الطائر من لوحة الحق في منطقة R4 على PCB إلى لوحة أعلى في منطقة R1 على PCB. وهذا سيغير عنوان I²C للمستشعر ، مما يسمح بقياس متزامن لكلا المستشعرين.
   ملاحظة: يتكون المستشعر المستخدم من ثنائي الفينيل متعدد الكلور: لوحة محول USB ولوحة اختبار استشعار تحتوي على مستشعر الضوء؛ فقط هو حاجة إلى لوحة اختبار الاستشعار لهذا الجهاز.
4. أسلاك لحام إلى كل من اثنين من الثنائيات الباعثة للضوء (المصابيح). قم بتوصيل سلك أحمر (موجب) بالوسادة المسماة "1" على الصمام وسلك أسود (سالب) على اللوحة المسماة "2" على الصمام. ضعي طبقة رقيقة من اللاصق الحراري على الجزء الخلفي من الصمام، وضعي الصمام على قمة غطاء النهاية، وانتظري حتى يشفي اللاصق الحراري. على الجانب الآخر من الغطاء نهاية, إضافة بالوعة الحرارة.
   ملاحظة: عند اختبار المصابيح قبل أن يتم ختمها في الحاوية، تأكد من ارتداء ضوء أزرق مناسب يمنع حماية العين.
5. لإنشاء التكوين الثاني، اقطع دائرتين قطرهما 1/4 بوصة من ورقة احباط الإثارة الزرقاء وأربع دوائر قطرها 1/4 بوصة من ورقة رقائق الانبعاثات الصفراء مع مقص أو شفرة حلاقة.
6. اضغط على إدخال M2.5 سداسي الشكل في كل من الثقوب الأربعة على الجزء المائل من الجزء "LCD_Screen_Holder.stl".

2. التجميع البصري

1. ضع إدراج 3/16 بوصة طويلة 4-40 مترابطة في حفرة على الجزء العلوي من الجزء 'Optics_Enclosure_Bottom.stl'. ضع إدراج 4-40 مترابطة 1/4 بوصة طويلة في جميع الثقوب الأخرى من الجزء المطبوع 3D كما هو مبين في الشكل 2A.
2. أدخل لوحة اختبار المستشعر في التجويف العلوي للإسكان، مع مواجهة الدبابيس الخمسة نحو أعلى وأقرب محور مركزي للجهاز. آمنة مع المسمار 3/16 بوصة طويلة 4-40 من خلال ثقب على لوحة اختبار الاستشعار (الشكل 2B).
3. ضع إحدى عدسات البعد البؤري مقاس 20 مم في القسم أسفل لوحة اختبار المستشعر مع الجانب الحراري الذي يتجه نحو أسفل الجهاز وبعيدا عن لوحة الاختبار(الشكل 2C).
4. لإنشاء التكوين الأول، ضع مرشح تمريرة طويلة في القسم التالي تحت عدسة البعد البؤري 20 ملم (الشكل 2D) وضعت في الخطوة السابقة. لإنشاء التكوين الثاني، ضع ورقتي فلتر الانبعاثات الصفراء في القسم أسفل العدسة.
5. لإنشاء التكوين الأول، ضع المرآة ال dichroic في المقطع قطري بالقرب من وسط التغليف أثناء مراقبة اتجاه التصفية المحدد من قبل الشركة المصنعة(الشكل 2E). لإنشاء التكوين الثاني، ضع مقسم الحزمة في المقطع القطري. لا يلزم توجيه محدد لمقسم الحزمة.
6. ضع عدسة البعد البؤري الثانية مقاس 20 مم في القسم أسفل المرآة الديكهروبية (أو مقسم الحزمة، حسب التكوين) مع توجيه الجانب الحراري نحو أعلى الجهاز(الشكل 2F).
7. لإنشاء التكوين الأول، ضع مرشح الإثارة في القسم إلى يمين المرآة الديكهروية، مع التأكد من أن السهم يشير نحو المرآة الإملاءية(الشكل 2G). لإنشاء التكوين الثاني، ضع ورق تصفية الإثارة الأزرق في القسم الموجود على يمين مقسم الحزمة.
8. ضع عدسة البعد البؤري مقاس 15 مم على يمين فلتر الإثارة مع الجانب الحراري المواجه للمرآة ال dichroic (الشكل 2H).
9. ضع LED في القسم المتبقي من الطباعة، مع مواجهة LED نحو المرآة الديكهروية (أو مقسم الحزمة، اعتمادا على التكوين). تأكد من إدخال السلكين المؤديين من الصمام إلى القنوات المتعطلة بحيث يتم إغلاق الطباعة بإحكام.
10. كرر الخطوات 2.3-2.9 للجانب الآخر من الجزء المطبوع ثلاثي الأبعاد(الشكل 2I).
11. أغلق الجانب الفارغ من الطباعة أعلى الطباعة باستخدام المكونات البصرية عن طريق وضع الأجزاء المبثوفة من النصف العلوي من التغليف في الأخافير المتعطلة للنصف السفلي من التغليف. تأمين الأجزاء المطبوعة اثنين جنبا إلى جنب مع 3/8 بوصة طويلة 4-40 مسامير (الشكل 2J).
    ملاحظة: إذا لم يتم إغلاق الأجزاء المطبوعة اثنين تماما، يمكن أن الضوء الإثارة الضالة الهروب من السكن البصري. ضمان ضوء أزرق مناسب منع حماية العين يتم ارتداؤها حتى يتم تحقيق ختم السليم. إعادة ختم الضميمة حتى لا يهرب الضوء الزائد.

3. الالكترونيات والتجميع تعمل باللمس

1. ربط اثنين من لوحات الخبز مصغرة معا، ومن ثم وضع المتحكم الدقيق على واحدة من لوحات الخبز. تأكد من أن منفذ microUSB للمتحكم الدقيق يواجه إلى الخارج.
2. لتوصيل تعديل LED، قم بتوصيل دبوس CTL الخاص بمحرك LED (+) إلى دبوس رقمي للمتحكم الدقيق ودبوس LED (-) الخاص بمساق LED إلى دبوس GND للمتحكم الدقيق.
3. إزالة الأغطية البلاستيكية على الجزء الخلفي من ألواح الخبز. اضغط على دعم لاصق من ألواح الخبز إلى الجزء المطبوع 3D لإرفاق لوحات الخبز مجتمعة إلى داخل الجزء الخلفي من الجزء المطبوع 'LCD_Screen_Holder.stl'.
4. قم بتأمين حامل شاشة شاشة العرض الكريستالي السائل (LCD) مع لوحات الخبز المجمعة في الداخل إلى الحاوية البصرية المجمعة في القسم 2 مع مسامير بطول بوصة واحدة 4-40.
5. لتوصيل مصدر طاقة LED، قم بتوصيل دبوس LED (+) الخاص بمحرك LED بالسلك الموجب للواد الأول. قم بتوصيل السلك السالب لل LED الأول بالسلك الإيجابي لل LED الثاني على لوح الخبز. قم بتوصيل السلك السالب لل LED الثاني بالانصاق LED (-) الخاص بمساق LED.
   ملاحظة: ترتيب LED الأول أو الثاني هو إجباري.
6. لتوصيل مصدر طاقة برنامج تشغيل LED، قم بتوصيل الأسلاك الإيجابية والسلبية لإمدادات الطاقة 10 V بدبابيس VIN+ وVIN الخاصة بمحرك LED على التوالي. (تم استخدام مقبس برميل إلى محول ثنائي الدبوس.)
7. قم بتوصيل وحدة إمداد الطاقة ونقل البيانات في لوحة اختبار الاستشعار. يتم استخدام أربعة دبابيس فقط على لوحة اختبار الاستشعار: SCK، SDA، VDUT، وGND. خذ أنثى من 4 دبوس إلى سلك الطائر الذكور وربط تلك الدبابيس على لوحات اختبار الاستشعار من الضوء إلى الرقمي إلى لوحة الخبز المصغرة من خلال الفجوة في أعلى يمين طباعة حامل LCD.
8. على لوحة الخبز، تأكد من وجود اتصالات بين ما يلي: دبوس 3.3 V من المتحكم الدقيق ودبوس VDUT لكلا لوحي الاختبار؛ دبوس GND من المتحكم الدقيق ودبوس GND من كل من لوحات الاختبار; التناظرية 4 (A4) دبوس من المتحكم الدقيق ودبوس SDA من كل من لوحات الاختبار; ودبوس 5 (A5) التناظرية من المتحكم الدقيق ودبوس SCK من كل من لوحات الاختبار.
   ملاحظة: لأنه يتم استخدام الاتصالات I²C لأجهزة استشعار الضوء، يمكن توجيه دبابيس SCK وSDA من كل من أجهزة الاستشعار إلى نفس دبابيس المتحكم الدقيق.
9. قم بتأمين الكمبيوتر أحادي اللوحة على حامل شاشة LCD باستخدام أربعة مسامير M2.5. تأكد من أن منافذ محول الطاقة و HDMI للكمبيوتر أحادية اللوحة تواجه لأعلى وأن الكمبيوتر أحادي اللوحة يتم توسيطه على الجزء المطبوع ثلاثي الأبعاد.
10. قم بتوصيل شاشة اللمس بالكمبيوتر أحادي اللوحة وفقا لتعليمات شاشة اللمس، ثم قم بتوصيل منفذ HDMI للكمبيوتر أحادي اللوحة بمنفذ HDMI الخاص بشاشة اللمس.

4. تثبيت البرامج

1. تثبيت واستخدام محرر الويب لتحميل رسم مخصص "MiniFluorimeter_2Diode.ino" المنصوص عليها في ملف الترميز التكميلي 1 على المتحكم الدقيق. تأكد من تثبيت مكتبة "ClosedCube OPT3002" باستخدام إدارة المكتبة.
2. تغيير المتغير led_A_pin إلى رقم الرقم السري الرقمي المستخدم في الخطوة 3.3 (قسم تجميع الأجهزة الإلكترونية والشاشة التي تعمل باللمس).
3. ضبط عدد المللي ثانية التي يتم تشغيل LED عند الحصول على قياسات الفلورسينس عن طريق تغيير قيمة وقت التعرض المتغير. ضبط عدد المللي ثانية بين التعرض LED عن طريق تغيير قيمة المتغير led_A_Interval.
4. تغيير المتغير led_Power إلى رقم بين صفر وواحد لضبط سطوع المصابيح أثناء التعرض. صفر يعطي أقصى قدر من السطوع واحد يعطي أقل قدر من السطوع.
5. قم بتشغيل القدرة على التحكم في الشاشة عبر شاشة اللمس باتباع إرشادات الشركة المصنعة المزودة بشاشة 3.5 بوصة.
   ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، يمكن استخدام الشاشة مقاس 3.5 بوصة كشاشة بدون إمكانيات تعمل باللمس، ويمكن توصيل لوحة المفاتيح والماوس بمنافذ USB للكمبيوتر أحادي اللوحة للتحكم في الكمبيوتر أحادي اللوحة.
6. تحميل ملف "MiniFluorimeter_2Diode_GUI.py" من ملف الترميز التكميلي 2 إلى الموقع المطلوب على الكمبيوتر أحادية المجلس.
7. تأكد من تثبيت إصدار عمل من Python على الكمبيوتر أحادي اللوحة . تم استخدام Python 3.7 في وحدة Python المقدمة ، ولكن يمكن استخدام أي إصدار بايثون مستقر مع التغييرات المناسبة على السيناريو المقدم. تثبيت المكتبات اللازمة لبرنامج Python على الكمبيوتر أحادية المجلس.
8. تغيير المتغير measurement_time إلى طول الوقت المطلوب لأخذ القياسات. ينتهي البرنامج من الاستحواذ ويغلق بعد انقضاء الوقت المطلوب. تسمح واجهة المستخدم الرسومية أيضا بنهاية عملية الاستحواذ من خلال زر على واجهة المستخدم.
9. تغيير المتغير التسلسلي إلى العنوان التسلسلي للمتحكم الدقيق المتصل.

5. تسجيل بيانات الفلورسينس في الوقت الحقيقي

1. بدوره على كتلة الحرارة التجارية والسماح لها للوصول إلى درجة الحرارة المطلوبة.
2. قم بتشغيل الكمبيوتر أحادي اللوحة بإمدادات طاقة قياسية 5 V مزودة بمعظم عمليات شراء الكمبيوتر أحادية اللوحة. قم بتوصيل الكمبيوتر أحادي الرقعة بجهاز التحكم الدقيق باستخدام ميكرو أوسب إلى كابل USB.
3. باستخدام شاشة اللمس، افتح البرنامج النصي المتوفر ل Python. تغيير المتغيرات measurement_time والمنفذ التسلسلي إلى القيم المطلوبة. تغيير outputFilepath متغير إلى اسم ملف البيانات الذي ينشئ البرنامج. تأكد من أن اسم الملف ينتهي ب ".xlsx".
4. ضع أنبوبين PCR يحتويان على ردود الفعل ليتم رصدها في كتلة الحرارة. تأكد من أن موضع أنابيب PCR يتماشى مع القنوات البصرية للفلوريمتر بمجرد وضعه على كتلة الحرارة.
5. ضع مقياس الفلورمتر فوق كتلة الحرارة مع أنابيب PCR التي تركزت بين الأوتاد الأربعة التي تقذف من كل قناة بصرية من الفلوريمتر. للقياسات المثلى، تأكد من أن مقياس الفلور ثلاثي الأبعاد المطبوع متصل بشكل آمن في آبار الكتلة الحرارية.
6. إرفاق الفلوريمتر بشكل آمن، قم بتوصيل محول إمدادات الطاقة للمصابيح.
7. استخدم شاشة اللمس لبدء تشغيل برنامج Python. تظهر واجهة مستخدم رسومية (GUI) على شاشة LCD وتقيس الفلورسينس في الوقت الحقيقي.
8. مراقبة قياسات الفلورسينس في الوقت الحقيقي مع مرور الوقت لكلا أنابيب PCR التي يتم عرضها للمستخدم على واجهة المستخدم الرسومية.
9. بعد انقضاء وقت التجربة الذي يحدده المستخدم، يتوقف الاستحواذ. عرض القياسات في ملف بيانات الإخراج المحفوظة في الموقع المعرفة من قبل المستخدم. لإنهاء القياسات مبكرا، انقر فوق الزر المسمى "إيقاف الاستحواذ" على واجهة المستخدم.

النتائج

بمجرد تجميعها، يمكن التحقق من صحة أداء الفلوريمتر عن طريق قياس الفلورسينس من سلسلة تخفيف صبغة FITC. في الشكل 3A، تظهر قياسات صبغ FITC بتركيزات 0 و 20 و 40 و 60 و 80 pg /μL التي تم إعدادها في برنامج تلفزيوني 1x على قناتي التكوين الأول للفلوريمتر. تم قياس كل عينة ثلاث مرات مع التعرض LED من 1.5 ثانية على فترات 20 ثانية. تظهر كلتا قناتي الفلوريمتر استجابة خطية عبر النطاق المطلوب.

وقد تجلت إمكانية التطبيق السريري للفلوريمتر كذلك باستخدام النظام جنبا إلى جنب مع كتلة الحرارة الجافة المتاحة تجاريا لإجراء التضخيم مع اثنين من تقنيات التضخيم الحراري: RPA وRT-LAMP.

ويبين الشكل 3B المسار الزمني المطرح لخط الأساس للفلورسينس الذي يقاس خلال تضخيم 39 درجة مئوية قدره 50 ميكرولتر من ردود الفعل الإيجابية والسلبية للتحكم في RPA في الوقت الحقيقي للحمض النووي للتحكم الإيجابي للمجموعة المقدم في مجموعة تجارية قياسية والمعدة لكل تعليمات الشركة المصنعة. تم قياس ردود فعل RPA ، التي تنتج مستوى منخفضا نسبيا من الفلورسينس ، باستخدام التكوين الأول للفلوريمتر الذي يحقق قمعا أفضل لضوء الإثارة.

يوضح الشكل 3C قياس الدورة الزمنية لمقايسة RT-LAMP المخصصة عند 65 درجة مئوية باستخدام مجموعات التهيئة N2 و E1 و As1e التي وصفها تشانغ وآخرون¹⁰ورابي وسيبكو¹¹. تنتج تفاعلات RT-LAMP كمية أكبر من الفلورسينس وتم قياسها باستخدام التكوين الثاني الأقل تكلفة للفلورمتر. تم شراء أوليغونوكليوتيدات وإعادة إنفاقها في 2x TE العازلة بتركيز 1 mM. تم طلب التمهيدي الداخلي الأمامي (FIP) و أوليغو التمهيدي الداخلي الخلفي (BIP) مع تنقية الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء. كل مجموعة التمهيدي (N2، تم الجمع بين E1 و As1e) لجعل 1000 ميكرولتر من مزيج 25x على النحو التالي: 40 ميكرولتر من FIP، 40 ميكرولتر من BIP، 5 ميكرولتر من F3، 5 ميكرولتر من B3، 10 ميكرولتر من LF، 10 ميكرولتر من LB، و 890 ميكروغرام من 1x TE المخزن المؤقت. لتجميع كل رد فعل RT-LAMP، تمت إضافة 1 ميكرولتر من كل مجموعة التمهيدي إلى 0.5 ميكرولتر من صبغة الفلورسنت 50x و 12.5 ميكروغرام من مزيج رئيسي 2x وتم إحضار حجم التفاعل تصل إلى 20 ميكرولتر مع المياه الخالية من النيوكليز لكل تعليمات الشركة المصنعة. تم تخفيف التحكم في الحمض النووي الريبي سارس-CoV-2 بشكل متسلسل في مياه خالية من النيوكليز إلى تركيزات 10 أو 100 أو 1000 نسخة لكل ميكرولتر، وأضيفت 5 ميكرولتر لحجم تفاعل إجمالي قدره 25 ميكرولتر. ولم تكن السيطرة على الأهداف المستخدمة في جميع التجارب هي المياه الخالية من النيوكليز. تم تراكب ردود فعل RT-LAMP مع 25 ميكرولتر من الزيت المعدني الجزيئي من الدرجة البيولوجيا.

تم تجميع ردود فعل RPA و RT-LAMP في بئرين من شريط PCR منخفض الأضواء سعة 0.2 مل 8 أنبوب وتوج بقبعات مسطحة فائقة التخليص. تم تشغيل كل رد فعل RPA وRT-LAMP في ثلاثية. في جميع الاختبارات، نجح مقياس الفلورمتر المصغر في قياس الزيادة الزمنية لمستويات الفلورسينس المرتبطة بتضخيم الحمض النووي.

الشكل 1: الإسكان البصري وتجميعها الفلوريمتر مصغرة فوق كتلة الحرارة. (أ) رسم بياني للإسكان البصري تظهر المكونات البصرية وضعت في قناة واحدة الكشف. (ب) رسم تخطيطي للتكوين الأول للفلوريمتر المصغر التالي للتجميع. (ج) صورة فوتوغرافية للمساكن البصرية مع المكونات البصرية وضعت في قناة واحدة الكشف. (D) صورة فوتوغرافية لمضا المقنن المصغر المجمعة الموضوعة فوق كتلة حرارية متاحة تجاريا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: الرسم التخطيطي للتجميع والتحكم الكهربائي للفلورميتر المصغر. A-J) وضع خطوة بخطوة من المكونات البصرية في السكن البصري المطبوعة 3D لتكوين النظام الأول. (ك)الرسم التخطيطي الكهربائي للفلوريمتر مصغرة لكلا التكوينات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3:تظهرالقياسات التمثيلية التي تم الحصول عليها باستخدام مقياس الفلورميتر المصغر( A)الفلورية المقاسة مقابل تركيز صبغ FITC في كلتا القناتين استجابة خطية عبر النطاق الديناميكي المطلوب. (ب)في الوقت الحقيقي مضان مقابل الوقت لتضخيم isothermal من الضوابط الإيجابية والسلبية من عدة المتاحة تجاريا. يحدث التضخيم كما هو متوقع لعنصر التحكم الإيجابي. (ج)في الوقت الحقيقي مضان مقابل الوقت لتضخيم isothermal من 50 و 500 و 5000 نسخة من سارس - CoV - 2 الجيش الملكي النيبالي وعينة المجلس الوطني الانتقالي من مخصص RT - مصباح المقايسة. يحدث التضخيم كما هو متوقع بالقرب من حد الكشف عن المقايسة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

	النظام 1		النظام 2
بند	كم	السعر الإجمالي (دولار أمريكي)	كم	السعر الإجمالي (دولار أمريكي)
المكونات البصرية
العدسات	6	158.14	6	158.14
المرايا	2	244.56	2	60
مرشحات بصرية	4	200	6	5
	المجموع الفرعي	602.7	المجموع الفرعي	223.14
الإضاءة والكشف
المصابيح	2	72.62	2	72.62
سائق LED	1	11.49	1	11.49
الصمام الثنائي الضوئي	2	50	2	50
	المجموع الفرعي	134.11	المجموع الفرعي	134.11
الالكترونيات والعرض
أردوينو نانو	1	20.7	1	20.7
التوت بي	1	35	1	35
شاشة LCD	1	25	1	25
لوحة الخبز الصغيرة	1	4	1	4
10 فولت امدادات الطاقة	1	8.6	1	8.6
	المجموع الفرعي	93.3	المجموع الفرعي	93.3
التكلفة الإجمالية (دولار أمريكي)		830.11		450.55

الجدول 1: مقارنة تكلفة تكويني الفلوريمتر المصغر.

الملف التكميلي 1: System1_Optics_Enclosure_Top.stl يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: System1_Optics_Enclosure_Bottom.stl، ويرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: LCD_Screen_Holder.stl الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 4: System2_Optics_Enclosure_Top.stl الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 5: System2_Optics_Enclosure_Bottom.stl، ويرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 6: System2_BuildInstructions.pdf الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

ملف الترميز التكميلي 1: MiniFluorimeter_2Diode.ino يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف الترميز.

ملف الترميز التكميلي 2: MiniFluorimeter_2Diode_GUI.py الرجاء الضغط هنا لتحميل ملف الترميز هذا.

Discussion

الموصوف هنا هو مفتوح المصدر، منخفضة التكلفة، وحدات، مضاد المحمولة للكشف عن الفلورية الكمية من تفاعلات التضخيم isothermal. تسهل المشاريع المفتوحة المصدر الصيانة السريعة وغير المكلفة مع قطع الغيار المتاحة بسهولة وتتيح للمستخدمين المرونة لتكييف النظام مع احتياجاتهم على أساس التصميم المعياري. يصف هذا البروتوكول عملية تجميع المكونات الميكانيكية والبصرية والكهربائية، والتحقق من الأداء البصري. وعلاوة على ذلك، أظهرت مرونة الفلوريمتر لرصد نوعين مختلفين من المقايسات التضخيم isothermal مع درجة حرارة مختلفة إلى حد كبير، وحجم، ومتطلبات الفلورسينس، RPA exo وRT-مصباح. يتم تنفيذ RPA عند 39 درجة مئوية في 50 تفاعلات ميكرولتر التي تستخدم مسبارا موسوما ب FAM محدد التسلسل لتوليد الفلورسينس ، في حين يتم تنفيذ RT-LAMP عند 65 درجة مئوية في حجم تفاعل 25 ميكرولتر ويستخدم صبغة متداخلة للإبلاغ عن وجود الحمض النووي المضخم. ولأن قياسات الفلورسينس تتم من خلال الجزء العلوي من أنابيب PCR ذات القبعات المسطحة، فإن مقياس الفلورمتر قادر على اكتشاف الفلورسينس من كلا حجمي المقايسة، ومتطلبات الحرارة محدودة فقط من خلال كتلة الحرارة التجارية المختارة. وعلاوة على ذلك، فإن كثافة الفلورسينس المنتجة في RT-LAMP هي تقريبا في ترتيب حجم أكبر من تلك التي تنتج في الجيش الوطني الرواندي، وذلك بسبب أساليب الصباغة مقابل التحقيق القائم على توليد إشارة مضان. ومع ذلك ، فإن النطاق الديناميكي للمستشعر البصري المختار يمكن الكشف عن كل من الإشارات وتحديدها كميا ، وخوارزميات الطرح الأساسية مسؤولة عن هذه الاختلافات لإنتاج قراءات مضان موثوق بها.

ولتيسير نشر التكنولوجيا وتقليل تكاليف الصيانة المحتملة، استخدم تصميم نمطي يتوافق مع السخانات المتاحة على نطاق واسع في بيئات مختلفة. وفي البروتوكول الحالي، استخدم سخان كتلة جافة مشترك؛ ويمكن تكييف نفس التصميم البصري والكهربائي بسهولة لسخانات أخرى متاحة تجاريا. إذا كان آخر سخان كتلة جافة لاستخدامها، وسوف تكون هناك حاجة إلى تغييرات طفيفة في تصميم الإسكان 3D. على وجه التحديد، يجب تعديل أوتاد أسفل ملفات STL الضميمة البصرية لضمان المواءمة المناسبة مع آبار الكتل الحرارية التجارية الأخرى. بينما تمت طباعة المرفقات المعروضة في الأمثلة على طابعة ثلاثية الأبعاد منخفضة الوضوح نسبيا (انظر جدول المواد)،يجب الحرص على ضمان أن تكون دقة الطابعة و/أو تفاوت الطباعة ملائمة لاستيعاب المكونات البصرية والإدراجات المترابطة. في ملفات STL المتوفرة، تمت إضافة تفاوت 0.01-0.02 بوصة على جانبي المكونات البصرية في الاتجاهين الشعاعي والماكسي استنادا إلى الأبعاد المحددة من قبل الشركة المصنعة. وهذا يضمن احتواء جميع المكونات البصرية بشكل آمن داخل الطباعة وأن العلبة تمنع الضوء الزائد تماما من الدخول أو الهروب. لضمان ملائمة ضغط مناسب لإدراج مترابطة، تم طرح التسامح مماثلة من 0.01-0.02 بوصة من قطر الشركة المصنعة المتوفرة في ملف CAD.

تم رصد تفاعلات RPA بنجاح باستخدام تكوين الفلوريمتر الأول ، في حين يمكن مراقبة تفاعلات RT-LAMP باستخدام أي من التكوينين. كان الرفض الخفيف الضال المحسن للتكوين الأول ضروريا لمراقبة المستويات المنخفضة من الفلورسينس التي ينتجها المسبار الفلوري في ردود فعل الجيش الوطني الرواندي. وعلى النقيض من ذلك، يستخدم RT-LAMP صبغة متداخلة لتوليد الإشارات، مما يؤدي إلى كثافة مضان أعلى تتوافق مع النطاق الديناميكي الأدنى للتكوين الثاني باستخدام رقائق فلتر التصوير الفوتوغرافي. يجب على المستخدمين تحديد تكوين الفلوريمتر الذي يطابق إشارة الفلورسينس التي تولد صبغة متداخلة العناصر أو مسبار فلوري من المقايسة الخاصة بهم.

أحد قيود هذا النظام هو أن يتم توفير التدفئة عن طريق كتلة الحرارة المتاحة تجاريا تعمل بالطاقة من خلال منفذ الجدار القياسية. ويمكن مواصلة تطوير هذا النظام لاستخدامه في المناطق التي تفتقر إلى إمكانية الحصول على الكهرباء عن طريق دمج حزم البطاريات المحمولة وال قابلة لإعادة الشحن كما هو مبين في المجموعات الأخرى¹². وثمة قيد آخر هو الإنتاجية المنخفضة نسبيا للنظام، الذي يسمح بقياس الفلورسينس المتزامن لعينتين فقط في كل مرة. يمكن وضع مطبوعات متعددة من الضميمة فوق كتلة الحرارة نفسها لزيادة الإنتاجية؛ ومع ذلك ، فإن استشعار الضوء المستخدمة لديها أربعة عناوين فريدة من نوعها أنا²C. وهذا يقيد الحد الأقصى لعدد العينات التي يمكن قياسها في وقت واحد إلى أربعة. هناك حاجة إلى مستشعر ضوء مختلف مع عدد أكبر من عناوين I²C الفريدة لزيادة الإنتاجية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4-inch-long 4-40 threaded insert	McMaster-Carr	90742A116	Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together.
10v power supply	GlobTek, Inc.	WR9HU1800CCP-F(R6B)	AC/DC Wall Mount Adapter 10V 18W
15 mm focal length lens	Thorlabs	LA 1074	Two total are used for the fluorimeter. This lens is used to focus the LED illumination.
1-inch-long 4-40 screws	McMaster-Carr
20 mm focal length lens	Thorlabs	LA 1540	Four total are used for the fluorimeter.
2x WarmStart LAMP Master Mix	New England Biolabs, Inc	E1700	Master mix was used to create the LAMP reactions shown in Figure 3C
3.5” Touch Screen	Uctronics	BO10601
3/16-inch-long 4-40 screw	McMaster-Carr	90128A105
3/16-inch-long 4-40 threaded insert	McMaster-Carr	90742A115	Used to secure the OPT3002 test board onto the 3D printed enclosure
3/8-inch-long 4-40 screws	McMaster-Carr	90128A108	Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together.
3D printer filament	3D Universe	UMNFC-PC285-BLACK	Black or another dark color preferred
3D printer used	Ultimaker	Ultimaker 2+
8-tube PCR strips	BioRad	#TLS0801
Advanced Mini Dry Block Heater	VWR International	10153-320	The following heat blocks are acceptable substitutes without the need for redesigning the optical assembly: 949VWMNLUS, 949VWMHLUS, and 949VWMHLEU
barrel jack to two-pin adapter	SparkFun Electronics	1568-1238-ND
Blue Excitation Filter Foil	LEE	LE071S	Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different filters.
Blue LED - 460 nm	Mouser	LZ1-30DB00-0100	Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts
Dichroic Mirror	Thorlabs	DMLP505T	Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts
Emission Filter	Edmunds Optics	OG-515	Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts. The arrow on the part points away from the illumination source.
Excitation Filter	Omega Filters	490AESP	Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts
LED Driver	LEDdynamics	3021-D-I-700
M2.5 Hex Shaped insert	McMaster-Carr	91292A009	Used to secure the Raspberry Pi to the 3D printed LCD Screen Holder
Microcontroller	Arduino	Nano
Mini Breadboard	Adafruit	65
Molecular biology-grade mineral oil	Sigma Aldrich	69794
OPT3002EVM - Light-to-Digital Sensor	Texas Instruments	OPT3002EVM:	Light-to-digital sensor used. Consists of two PCBs: a SM-USB_DIG board and the OPT3002 test board; only the OPT3002 test board is needed for this device.
Purchased oligonucleotides	Integrated DNA Technologies
RPA kit positive control DNA	TwistDx Limited	CONTROL01DNAE
SARS-CoV-2 RNA Control	Twist Biosciences	MN908947.3
Single board computer	Raspberry Pi	Raspberry Pi 3
TwistAmp RPA exo kit	TwistDx Limited	TAEXO02KIT
Ultraclear flat caps	BioRad	#TCS0803
Yellow Emmission Filter Foil	LEE	LE767S	Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts