Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الهدف من هذه المخطوطة هو تقديم طريقة تعتمد على السونوغرافيا تسمح في التصوير الحي لتدفق الدم في الشرايين الدماغية في الفئران. نحن نظهر تطبيقه لتحديد التغيرات في سرعات تدفق الدم المرتبطة vasospasm في نماذج مورين من نزيف تحت العنكبوتية (SAH).

Abstract

توسع الأوعية الدماغية الذي يحدث في الأسابيع التي تلت بعد نزيف تحت العنكبوتية, نوع من السكتة الدماغية النزفية, يساهم في تأخر نقص التروية الدماغية. مشكلة واجهت في الدراسات التجريبية باستخدام نماذج مورين من SAH هو أن أساليب الرصد في الجسم الحي من vasospasm الدماغي في الفئران تفتقر. هنا، ونحن نظهر تطبيق الموجات فوق الصوتية عالية التردد لإجراء فحوص السونوغرافيا المزدوجة عبر الجمجمة على الفئران. باستخدام هذه الطريقة، يمكن التعرف على الشرايين السباتية الداخلية (ICA). تسارعت سرعات تدفق الدم في ICAs داخل الجمجمة بشكل كبير بعد تحريض SAH ، في حين ظلت سرعات تدفق الدم في ICAs خارج الجمجمة منخفضة ، مما يشير إلى زيادة الأوعية الدماغية. في الختام، فإن الطريقة التي أظهرت هنا يسمح وظيفية، غير الباضعة في رصد الجسم الحي من vasospasm الدماغي في نموذج SAH مورين.

Introduction

نزيف تحت العنكبوتية العفوي (SAH) هو شكل من أشكال السكتة الدماغية النزفية الناجمة في الغالب عن تمزق تمدد الأوعية الدموية داخل الجمجمة1. تتأثر النتيجة العصبية بشكل رئيسي بعاملين: إصابة الدماغ المبكرة (EBI) ، والتي تسببها آثار النزيف وما يرتبط به من نقص التروية الدماغية الدماغية العالمية العابرة ، وتأخر نقص التروية الدماغية (DCI) ، والذي يحدث خلال الأسابيع التالية للنزيف2،3. وأفادت التقارير DCI تؤثر على ما يصل إلى 30٪ من المرضى SAH2. الفيزيولوجيا المرضية من DCI ينطوي على الأوعية الدموية الدماغية، دوران الأوعية الدقيقة المضطربة الناجمة عن microvasospasms وmicrothrombosis، والاكتئاب انتشار القشرية، والآثار الناجمة عن التهاب4. لسوء الحظ، لا يزال الفيزيولوجيا المرضية الدقيقة غير واضحة ولا يوجد علاج متاح يمنع بشكل فعال DCI3. لذلك، يتم التحقيق DCI في العديد من الدراسات السريرية والتجريبية.

في الوقت الحاضر، معظم الدراسات التجريبية على SAH استخدام نماذج الحيوانات الصغيرة، وخاصة في الفئران5،6،7،8،9،10،11،12،13. في مثل هذه الدراسات، يتم التحقيق في كثير من الأحيان فصام الأوعية الدماغي كنقطة نهاية. ومن الشائع تحديد درجة من vasospasm ex vivo. وذلك لأن الأساليب غير الباضعة لفحص الأوعية الدموية الدماغية في الجسم الحي التي تتطلب وقتا قصيرا للتخدير وفرض القليل من الضيق على الحيوانات غير موجودة. ومع ذلك ، فإن فحص الأوعية الدموية الدماغية في الجسم الحي سيكون مفيدا. وذلك لأنه سيسمح الطولية في الدراسات الحية على vasospasm في الفئران (أي تصوير الأوعية الدموية الدماغية في نقاط زمنية مختلفة خلال الأيام التي تلت تحريض SAH). ومن شأن ذلك أن يعزز إمكانية مقارنة البيانات المكتسبة في نقاط زمنية مختلفة. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام تصميم دراسة طولية هو استراتيجية للحد من أعداد الحيوانات.

هنا نحن نثبت استخدام الموجات فوق الصوتية عبر الجمجمة عالية التردد لتحديد تدفق الدم في الشرايين الدماغية في الفئران. نظهر أنه ، على غرار السونوغرافيا دوبلر عبر الجمجمة (TCD) أو السونوغرافيا المزدوجة المرمزة بالألوان عبر الجمجمة (TCCD) في الممارسة السريرية14و15و16و17و18، يمكن استخدام هذه الطريقة لمراقبة انسداد الأوعية الدماغية عن طريق قياس سرعات تدفق الدم للشرايين داخل الجمجمة بعد تحريض SAH في نموذج المورين.

Protocol

تمت الموافقة على التجارب الحيوانية من قبل لجنة رعاية الحيوان المسؤولة (Landesuntersuchungsamt راينلاند-بفالز) وأجريت وفقا لقانون رعاية الحيوان الألماني (TierSchG). واتبعت جميع المبادئ التوجيهية الدولية والوطنية والمؤسسية المعمول بها لرعاية الحيوانات واستخدامها. في هذه الدراسة، قمنا بإجراء قياسات لسرعات تدفق الدم من الشرايين داخل الجمجمة وخارج الجمجمة في الفئران C57BL/6N الإناث الذين تتراوح أعمارهم بين 11-12 أسبوعا مع وزن الجسم بين 19-21 غرام. الفئران تعرضت إما لتحريض SAH أو جراحة صورية ، والتي تم وصفها بالتفصيل في مكان آخر10،12،13.

1. إعداد المواد

  1. قم بتشغيل جهاز الموجات فوق الصوتية وأدخل معرف الحيوان.
  2. قم بتسخين لوحة التدفئة في نظام الموجات فوق الصوتية إلى 37 درجة مئوية. تأكد من أن مسبار درجة حرارة المستقيم جاهز للاستخدام.
  3. استخدام حمام مائي لتسخين هلام الموجات فوق الصوتية إلى 37 درجة مئوية. إعداد كريم إزالة الشعر، كريم الاتصال للأقطاب الكهربائية، ومرهم العين.

2. التخدير

  1. حث التخدير عن طريق وضع الماوس في غرفة مسح مع 4٪ isoflurane و 40٪ O2 لمدة 1 دقيقة. حماية العينين مع مرهم العين. استمر فقط بعد الوصول إلى تخدير عميق بما فيه الكفاية (عدم وجود ردود فعل على محفزات الألم).
  2. الحفاظ على التخدير مع 1.5٪ isoflurane و 40٪ O 2 باستخدام قناعالتخدير طوال العملية بأكملها.

3. تحديد سرعات تدفق الدم من الشرايين السباتية الداخلية داخل الجمجمة مع السونوغرافيا المزدوجة عبر الجمجمة عالية التردد

  1. ضع الماوس في موضع عرضة على لوحة التدفئة من نظام الموجات فوق الصوتية للحفاظ على درجة حرارة الجسم من 37 درجة مئوية.
  2. معطف الأطراف الأربعة للحيوان مع عجينة موصل وإصلاحها مع الشريط على أقطاب تخطيط القلب جزءا لا يتجزأ من المجلس. تحقق مما إذا كانت المعلمات الفسيولوجية (تخطيط القلب، إشارة التنفس) معروضة بشكل صحيح على شاشة نظام التصوير (على سبيل المثال، Vevo3100). إذا لزم الأمر، ضبط مستوى التخدير للحصول على معدل ضربات القلب المستهدفة من 400-500 نبضة في الدقيقة (bpm).
  3. ضع التشحيم على مسبار درجة حرارة المستقيم وأدخله بعناية لمراقبة درجة حرارة الجسم. استخدم مصباحا إضافيا للتدفئة إذا لزم الأمر.
  4. قبل الفحص الأول، قم بإزالة الفراء في أوكسيبوت كيميائيا باستخدام كريم إزالة الشعر. استخدمي مسحة قطنية لنشر وفرك الكريم لمدة دقيقتين حتى يبدأ الشعر في السقوط.
    1. بعد دقيقتين إضافيتين، قم بإزالة الكريمة والشعر مع ملعقة وتطهير الجلد بمطهر جلدي كحولي. معطف مع هلام الموجات فوق الصوتية تدفأ إلى 37 درجة مئوية.
  5. استخدم محول صفيف خطي 38 ميغاهرتز ومعدل إطار أعلى من 200 إطار/ثانية للحصول على صور بالموجات فوق الصوتية والتركيز على المسبار في الذراع الميكانيكية. ضع المحول على الجهاز الممال للخلف بمقدار 30 درجة.
  6. استخدام السطوع-(B)-وضع واللون-موجة-(CW) دوبلر-وضع لتصور الشريان السباتي الداخلية داخل الجمجمة اليمنى وتحريك محول مع وحدة التحكم ذهابا وإيابا، حتى يتم العثور على التدفق الأقصى للشرايين.
  7. لجمع المعلومات التشريحية، استخدم وضع B-Mode التقليدي ووضع CW-Doppler وابدأ في الاستحواذ بالنقر على زر الحصول.
    1. لتسجيل المعلومات حول خصائص تدفق الأوعية داخل الجمجمة انقر على زر دوبلر Pulse-Wave (PW) ، ضع حجم العينة في وسط السفينة ، والحصول على حلقة سينية أطول من 3 ثوان.
  8. المضي قدما بشكل متطابق مع الجانب الأيسر.
  9. المضي قدما في الشرايين السباتية خارج الجمجمة.

4. تحديد سرعات تدفق الدم من الشرايين السباتية الداخلية خارج الجمجمة مع السونوغرافيا المزدوجة عالية التردد

  1. ضع الماوس في وضعية السبق على لوحة التدفئة في نظام الموجات فوق الصوتية للحفاظ على درجة حرارة الجسم 37 درجة مئوية.
  2. معطف الأطراف الأربعة للحيوان مع عجينة موصل وإصلاحها مع الشريط على أقطاب تخطيط القلب جزءا لا يتجزأ من المجلس. تحقق مرة أخرى من العرض الصحيح للمعلمات الفسيولوجية على الشاشة.
  3. قبل الفحص الأول، قم بإزالة الشعر في الرقبة الأمامية كيميائيا باستخدام كريم إزالة الشعر كما هو موضح أعلاه. معطف الرقبة الأمامية مع هلام الموجات فوق الصوتية تدفأ إلى 37 درجة مئوية.
  4. استخدم محول صفيف خطي 38 ميغاهرتز ومعدل إطار أعلى من 200 إطار/ثانية للحصول على صور بالموجات فوق الصوتية. ضع المحول الموازي للحيوان وضبط الموضع من أجل الحصول على صور طولية للشريان السباتي الأيمن.
  5. استخدم وضع السطوع-(B)-و وضع الموجة اللونية-(CW) دوبلر-وضع لتصور الشريان السباتي الأيمن. يجب أن تحتوي الصورة على الشريان السباتي الشائع الصحيح (RCC) والشريان السباتي الداخلي الأيمن (RICA) والشريان السباتي الخارجي الأيمن (RECA).
  6. لجمع المعلومات التشريحية، استخدم وضع B-Mode التقليدي ووضع CW-Doppler وابدأ في الاستحواذ بالنقر على زر الحصول.
    1. لتسجيل معلومات حول خصائص تدفق الشريان السباتي خارج الجمجمة انقر على زر دوبلر Pulse-Wave (PW) ، ضع حجم العينة في وسط منتصف الشريان السباتي الشائع والشريان السباتي الداخلي والشريان السباتي الخارجي والحصول على حلقة سينية أطول من 3 ثوان.
  7. المضي قدما بشكل متطابق مع الجانب الأيسر.
  8. إنهاء التخدير وإزالة الحيوان من لوحة الاحترار. إعادة الحيوان إلى قفص وضعت في حاضنة ساخنة إلى 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لمنع انخفاض حرارة الجسم والتحقق من الشفاء التام.

5. معالجة بيانات التصوير التكسوني الفائق

  1. استخدم محطة عمل خارجية لمعالجة بيانات الموجات فوق الصوتية عالية التردد. تصدير وضع B، CW-دوبلر-وضع و PW-دوبلر-وضع الصور والحلقات سيني.
  2. افتح دراسة الموجات فوق الصوتية المصدرة. حدد واحد وفتح PW-دوبلر حلقة سيني من الشريان السباتي داخل الجمجمة. في هذا البروتوكول عادة 7 إلى 8 ضربات القلب ويتم تسجيل منحنيات سرعة التدفق المقابلة.
  3. وقفة حلقة cine وانقر على زر القياس. اختر حزمة الأوعية الدموية وانقر على RICA PSV لقياس ذروة الضغط الانقباضي (PSV). الآن انقر على اليسار على ذروة منحنى السرعة وسحب خط مستقيم إلى خط الصفر. تحديد القياس بنقرة زر الماوس الأيمن.
  4. الآن اختيار EDV ريكا لقياس السرعة الانقباضية (EDV). انقر على اليسار على الحد الأدنى من طفح منحنى السرعة في نهاية diastole. اسحب الخط مباشرة إلى خط الصفر وحدد القياس بنقرة زر الماوس الأيمن.
  5. اختر ريكا VTI لقياس السرعة وقت متكامل (VTI). انقر على اليسار في بداية منحنى السرعة واتبع المنحنى مع الماوس حتى نهاية الهضبة الانبساطية. ثم انقر بزر الماوس الأيمن مرة أخرى لتحديد القياس.
  6. تصدير البيانات من الشرايين السباتية الداخلية داخل المخ باستخدام زر التقرير. اضغط تصدير وحفظ البيانات كملف تقرير VSI.
  7. استخدم نفس النهج لقياس PSV و EDV و VTI للشرايين السباتية الداخلية خارج الجمجمة الصحيحة وتصدير البيانات وفقا لذلك.
  8. المضي قدما بشكل متطابق مع الجانب الأيسر.

النتائج

في 6 فئران، تم حث 3 منها SAH باستخدام نموذج ثقب خيوط الأوعية الدموية الداخلية في حين حصل 3 على جراحة صورية، وتم تحديد سرعات تدفق الدم في الشريان السباتي الداخلي داخل الجمجمة (ICA) وICA خارج الجمجمة قبل يوم واحد من الجراحة، وبعد 1 و 3 و 7 أيام من الجراحة. تم إجراء القياسات كجزء من فحوصات تخطيط صدى الق?...

Discussion

على حد علمنا، هذه الدراسة هي الأولى لتقديم بروتوكول لرصد vasospasm الدماغي في نموذج مورين من SAH مع ارتفاع وتيرة عبر الجمجمة اللون المرمزة الموجات فوق الصوتية المزدوجة. نظهر أن هذه الطريقة يمكن قياس زيادة في سرعات تدفق الدم داخل الجمجمة بعد التعريفي SAH في الفئران. في الطب البشري هذه الظاهرة معرو...

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

ويود المؤلفان أن يشكرا ستيفان كيندل على إعداد الرسوم التوضيحية في الفيديو. وقد تم دعم PW وMM وSHK من قبل الوزارة الاتحادية الألمانية للتعليم والبحث (BMBF 01EO1503). وقد تم دعم العمل بمنحة كبيرة للأجهزة من مؤسسة البحوث الألمانية (DFG INST 371/47-1 FUGG). وقد تم دعم MM بمنحة من ال Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2020_EKEA.144).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Balea hair removal cremeBalea; GermanyASIN B0759XM39Vhair removal creme
C57BL/6N miceJanvier; Saint-Berthevin Cedex, Francen.a.mice
CorneregelBausch&Lomb; Rochester, NY, USAREF 81552983eye ointment, lube
cotton swabsHecht Assistent; Sondenheim vor der Röhn, GermanyREF 44302010cotton swabs
Ecco-XS razorTondeo; Soligen, GermanyDE 28693396razor
Electrode creamGE; Boston, MA, USAREF 21708318conductive paste
Heating plateMedax; Kiel, Germany2005-205-01
IsofluraneAbvie; Wiesbaden, Germanyn.a.volatile anesthetic
LeukofixBSN medical; Hamburg, GermanyREF 02137-00tape
Mechanical arm + micromanipulatorVisualSonics; FujiFilm, Toronto, CAP/N 11277
Microbac tissuesPaul Hartmann AG; Hamburg, GermanyREF 981387antimicrobial tissues
MZ400, 38 MHz linear array transducerVisualSonics; FujiFilm, Toronto, CAREF 51068-30ultrasound transducer
SonosidASID Bonz GmbH; Herrenberg, GermanyREF 782010ultrasonography gel
Ultrasound platform with heating plate and ECG-recordingVisualSonics; FujiFilm, Toronto, CAP/N 11179
UniVet-PortaGroppler; Oberperasberg, GermanyS/N BKGM0437isoflurane vaporizer
Vevo3100VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CAREF 51073-45ultrasonography device
VevoLab softwareVisualSonics; FujiFilm, Toronto, CAn.a.evaluation software

References

  1. Macdonald, R. L., Schweizer, T. A. Spontaneous subarachnoid haemorrhage. Lancet. 389 (10069), 655-666 (2017).
  2. Macdonald, R. L. Delayed neurological deterioration after subarachnoid haemorrhage. Nature Reviews Neurology. 10 (1), 44-58 (2014).
  3. Francoeur, C. L., Mayer, S. A. Management of delayed cerebral ischemia after subarachnoid hemorrhage. Critical Care. 20 (1), 277 (2016).
  4. van Lieshout, J. H., et al. An introduction to the pathophysiology of aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Neurosurgical Review. , (2017).
  5. Altay, T., et al. A novel method for subarachnoid hemorrhage to induce vasospasm in mice. J Neurosci Methods. 183 (2), 136-140 (2009).
  6. Momin, E. N., et al. Controlled delivery of nitric oxide inhibits leukocyte migration and prevents vasospasm in haptoglobin 2-2 mice after subarachnoid hemorrhage. Neurosurgery. 65 (5), 937-945 (2009).
  7. Froehler, M. T., et al. Vasospasm after subarachnoid hemorrhage in haptoglobin 2-2 mice can be prevented with a glutathione peroxidase mimetic. Journal of Clinical Neuroscience. 17 (9), 1169-1172 (2010).
  8. Provencio, J. J., Altay, T., Smithason, S., Moore, S. K., Ransohoff, R. M. Depletion of Ly6G/C(+) cells ameliorates delayed cerebral vasospasm in subarachnoid hemorrhage. Journal of Neuroimmunology. 232 (1-2), 94-100 (2011).
  9. Kamp, M. A., et al. Evaluation of a murine single-blood-injection SAH model. PLoS One. 9 (12), 114946 (2014).
  10. Luh, C., et al. The Contractile Apparatus Is Essential for the Integrity of the Blood-Brain Barrier After Experimental Subarachnoid Hemorrhage. Translational Stroke Research. , (2018).
  11. Neulen, A., et al. A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
  12. Neulen, A., et al. Large Vessel Vasospasm Is Not Associated with Cerebral Cortical Hypoperfusion in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage. Translational Stroke Research. , (2018).
  13. Neulen, A., et al. Neutrophils mediate early cerebral cortical hypoperfusion in a murine model of subarachnoid haemorrhage. Scientific Reports. 9 (1), 8460 (2019).
  14. Neulen, A., et al. Volumetric analysis of intracranial vessels: a novel tool for evaluation of cerebral vasospasm. Int J Comput Assist Radiol Surg. 14 (1), 157-167 (2019).
  15. Washington, C. W., Zipfel, G. J. Participants in the International Multi-disciplinary Consensus Conference on the Critical Care Management of Subarachnoid, H. Detection and monitoring of vasospasm and delayed cerebral ischemia: a review and assessment of the literature. NeuroCritical Care. 15 (2), 312-317 (2011).
  16. Greke, C., et al. Image-guided transcranial Doppler sonography for monitoring of defined segments of intracranial arteries. Journal of Neurosurgical Anesthesiology. 25 (1), 55-61 (2013).
  17. Neulen, A., Prokesch, E., Stein, M., Konig, J., Giese, A. Image-guided transcranial Doppler sonography for monitoring of vasospasm after subarachnoid hemorrhage. Clinical Neurology and Neurosurgery. 145, 14-18 (2016).
  18. Neulen, A., et al. Image-Guided Transcranial Doppler Ultrasound for Monitoring Posthemorrhagic Vasospasms of Infratentorial Arteries: A Feasibility Study. World Neurosurgery. 134, 284-291 (2020).
  19. Neulen, A., et al. Correlation of cardiac function and cerebral perfusion in a murine model of subarachnoid hemorrhage. Scientific Reports. 11 (1), 3317 (2021).
  20. Neulen, A., et al. A segmentation-based volumetric approach to localize and quantify cerebral vasospasm based on tomographic imaging data. PLoS One. 12 (2), 0172010 (2017).
  21. Marbacher, S., et al. Systematic Review of In Vivo Animal Models of Subarachnoid Hemorrhage: Species, Standard Parameters, and Outcomes. Translational Stroke Research. , (2018).
  22. Figueiredo, G., et al. Comparison of digital subtraction angiography, micro-computed tomography angiography and magnetic resonance angiography in the assessment of the cerebrovascular system in live mice. Clinical Neuroradiology. 22 (1), 21-28 (2012).
  23. Lindegaard, K. F., Nornes, H., Bakke, S. J., Sorteberg, W., Nakstad, P. Cerebral vasospasm diagnosis by means of angiography and blood velocity measurements. Acta Neurochirurgica. 100 (1-2), 12-24 (1989).
  24. Cassia, G. S., Faingold, R., Bernard, C., Sant'Anna, G. M. Neonatal hypoxic-ischemic injury: sonography and dynamic color Doppler sonography perfusion of the brain and abdomen with pathologic correlation. American Journal of Roentgenology. 199 (6), 743-752 (2012).
  25. Shen, Q., Stuart, J., Venkatesh, B., Wallace, J., Lipman, J. Inter observer variability of the transcranial Doppler ultrasound technique: impact of lack of practice on the accuracy of measurement. Journal of Clinical Monitoring and Computing. 15 (3-4), 179-184 (1999).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

172

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved