高周波経頭蓋二重超音波を用いたくも膜下出血のマウスモデルにおける脳血管れん縮の解析

要約

本稿の目的は、マウスにおける大脳動脈の血流の インビボ イメージングを可能にするソノグラフィーベースの方法を提示することである。我々は、くも膜下出血(SAH)のマウスモデルにおける血管れん縮に伴う血流速度の変化を決定するための応用を実証する。

要約

くも膜下出血後数週間に起こる脳血管れん縮は、出血性脳卒中の一種であり、脳虚血の遅延に寄与する。SAHのマウスモデルを用いた実験研究で遭遇する問題は、マウスにおける脳血管れん縮の インビボ モニタリングの方法が欠けていることである。ここでは、マウスに対して経頭蓋二重超音波検査を行う高周波超音波の応用を示す。この方法を用いて、内頸動脈(ICA)を同定することができた。頭蓋内ICAの血流速度はSAHの誘導後に有意に加速したが、頭蓋外のICAの血流速度は低いままであり、脳血管れん縮を示す。結論として、ここで示す方法は、マウスSAHモデルにおける脳血管れん縮の機能的、非侵襲的な インビボ モニタリングを可能にする。

概要

自然くも膜下出血(SAH)は、主に頭蓋内動脈瘤の破裂によって引き起こされる出血性脳卒中の一種である^。神経学的結果は、主に2つの要因によって影響される:早期脳損傷(EBI)は、出血および関連する一過性の脳虚血の影響によって引き起こされる、および出血^後の数週間に起こる遅延脳虚血(DCI)2、3。DCIは、SAH患者の最大30%に影響を及ぼすと報告^された2.DCIの病態生理学は、血管造影大血管れん縮、微小血管痙攣および微小血栓症によって引き起こされる微小循環の乱れ、皮質広がりのうつ病、および炎症によって引き起こされる効果^{を含む4。}残念ながら、正確な病態生理学は不明のままであり、効果的にDCI³を防ぐ治療法はありません。従って、DCIは多くの臨床および実験的研究で調べられます。

今日では、SAHに関するほとんどの実験的研究は、特にマウス^{5、6、7、8、9、10、11、12、13}の小動物モデル^を使用^{しています}。このような研究では、脳血管れん縮がエンドポイントとして頻繁に調査される。血管れん縮ex vivoの程度を決定することが一般的である。これは、短い麻酔時間を必要とし、動物に少しの苦痛を課す脳血管れん縮のインビボ検査のための非侵襲的な方法が欠けているためです。しかし、生体内での脳血管れん縮の検査は有利であろう。これは、マウスの血管れん縮に関するインビボでの縦方向の研究(すなわち、SAHの誘導後の日の間に異なる時点での脳血管れん縮のイメージング)を可能にするためである。これにより、異なる時点で取得されたデータの比較可能性が向上します。さらに、縦方向の研究設計を用いて、動物数を減らす戦略である。

ここでは、マウスの脳動脈の血流を決定するための高周波経頭蓋超音波の使用を実証する。我々は、^{臨床実践における}経頭蓋ドップラー超音波検査(TCD)または経頭蓋色分けされた二重ソノグラフィー(TCCD)と同様に^、この方法は、SAH誘導後の脳血管痙攣を測定することによって脳血管れん縮をモニタリングするために使用できることを示す。

プロトコル

動物実験は、責任ある動物ケア委員会(ランデスンテルストゥンサムト・マインラント・プファルツ)によって承認され、ドイツ動物福祉法(TierSchG)に従って実施されました。動物のケアと使用に関するすべての適用可能な国際、国内、制度的ガイドラインに従った。本研究では、体重11~12週齢の雌C57BL/6Nマウスにおける頭蓋内および頭蓋外動脈の血流速度の測定を19~21gの体重で行った。マウスをSAH誘導または偽の手術のいずれかを行ったが、これは他の場所^10、12、13に詳細に記載されている。

1. 材料の準備

1. 超音波マシンのスイッチを入れ、動物IDを入力します。
2. 超音波システムの加熱プレートを37°Cに温めます。 直腸温度プローブが使用できる状態であることを確認します。
3. 水浴を使用して超音波ゲルを37°Cに加熱します。 脱毛クリーム、電極用コンタクトクリーム、眼軟膏を用意します。

2. 麻酔

1. 4%のイソフルランを洗い流したチャンバーにマウスを入れ、40%O2を1分間洗浄して麻酔を誘発する。目の軟膏で目を保護します。十分に深い麻酔に達した後にのみ続ける(痛み刺激に対する反応の欠如)。
2. 麻酔マスクを使用して1.5%のイソフルランと40%O2で麻酔を維持します。

3. 経頭蓋高周波二重超音波による頭蓋内頸動脈の血流速度の測定

1. 超音波システムの加熱プレート上の起こりやすい位置にマウスを置き、37°Cの体温を維持する。
2. 動物の四肢を導電性ペーストでコーティングし、ボードに埋め込まれたECG電極にテープで固定します。生理学的パラメータ(ECG、呼吸信号)が画像化システムの画面(例えば、Vevo3100)に正しく表示されているかどうかを確認してください。必要に応じて、麻酔のレベルを調整して、毎分400〜500拍(bpm)の目標心拍数を得る。
3. 直腸温度プローブに潤滑油を置き、慎重に体温を監視するために挿入します。必要に応じて追加のウォーミングランプを使用してください。
4. 最初の試験の前に、毛取りクリームを使用して化学的にオクシプットで毛皮を取り除きます。綿棒を使って、髪が抜け始めるまでクリームを2分間広げてこすります。
   1. さらに2分後、ヘラでクリームと毛を取り除き、アルコール性皮膚消毒剤で皮膚を消毒します。37°Cに温めた超音波ゲルでコーティングします。
5. 38 MHzリニアアレイトランスデューサと200フレーム/s以上のフレームレートを使用して、超音波画像を取得し、メカニカルアームにプローブを固定します。トランスデューサをオクシプットの上に30°前後に傾けます。
6. 明るさ-(B)モードと色波-(CW)ドップラーモードを使用して、右 頭蓋内 頸動脈を可視化し、動脈の最大流量が見つかるまで、制御ユニットを前後にトランスデューサーを動かします。
7. 解剖学的情報を収集するには、従来のBモードとCW-ドップラーモードを使用して 、取得 ボタンをクリックして取得を開始します。
   1. 頭蓋内血管の流れ特性に関する情報を記録するには、パルス波(PW)ドップラーボタンをクリックし、サンプルボリュームを容器の中央に置き、3sより長いシネループを取得します。
8. 左側と同じように進みます。
9. 頭蓋外頸動脈を進める。

4. 高周波二重超音波による頭蓋外頸動脈の血流速度の測定

1. 超音波システムの加熱板上の位置にマウスを置き、37°Cの体温を維持する。
2. 動物の四肢を導電性ペーストでコーティングし、ボードに埋め込まれたECG電極にテープで固定します。画面上の生理学的パラメータの正しい表示をもう一度確認してください。
3. 最初の試験の前に、上記のように脱毛クリームを使用して、前輪の毛を化学的に除去します。37°Cに温めた超音波ゲルで前輪をコーティングします。
4. 超音波画像を取得するには、38 MHzリニアアレイトランスデューサと200フレーム/s以上のフレームレートを使用します。トランスデューサを動物に平行に置き、右頸動脈の縦方向の画像を得るために位置を調整する。
5. 右頸動脈を可視化するには、明るさ-(B)モードと色波モード(CW)ドップラーモードを使用します。画像には、右共通頸動脈(RCC)、右内頸動脈(RICA)および右外頸動脈(RECA)が含まれている必要があります。
6. 解剖学的情報を収集するには、従来のBモードとCW-ドップラーモードを使用して 、取得 ボタンをクリックして取得を開始します。
   1. 頭蓋外頸動脈の流れ特性に関する情報を記録するには、 パルス波(PW)ドップラー ボタンをクリックし、サンプル体積を一般的な頸動脈の中央、頸動脈の中、内頸動脈および外頸動脈の中央に配置し、3sより長いシネループを取得する。
7. 左側と同じように進みます。
8. 麻酔を終了し、温暖化プレートから動物を取り除きます。37°Cに加熱したインキュベーターに1時間加熱したケージに動物を戻し、低体温症を予防し、完全な回復を確認します。

5. 超音波データの処理

1. 高周波超音波データの後処理には外部ワークステーションを使用してください。Bモード、CW-ドップラーモード、PW-ドップラーモードのイメージとシネループをエクスポートします。
2. エクスポートされた超音波研究を開きます。1匹の動物を選択し、頭蓋内頸動脈のPW-ドップラーシネループを開きます。このプロトコルでは、通常7~8個のハートビートと対応する流速曲線が記録されます。
3. cine ループを一時停止し、 測定 ボタンをクリックします。 血管パッケージ を選択し、ピーク収縮期圧(PSV)を測定するために RICA PSV をクリックしてください。次に、速度曲線のピークの左をクリックし、直線をゼロラインに引き出します。マウスの右ボタンでクリックして測定を決定します。
4. 次に 、リカEDV を選択して、末端の速度(EDV)を測定します。ダイストールの終わりに速度曲線の最小限の発疹を左クリックします。直線をゼロラインまでまっすぐ引き上げ、マウスの右ボタンでクリックして測定を決定します。
5. 速度時間積分 (VTI)を測定するには、RICA VTI を選択します。速度曲線の始めで左クリックし、拡張期の高原の終わりまでマウスでカーブをたどります。次に、もう一度右クリックして測定を決定します。
6. レポートボタンを使用して、脳内頸動脈のデータをエクスポートします。 [エクスポート] を押して、データを VSI レポート ファイルとして保存します。
7. 同じアプローチを使用して、右頭蓋外頸動脈のPSV、EDVおよびVTIを測定し、それに応じてデータをエクスポートします。
8. 左側と同じように進みます。

結果

6匹のマウスにおいて、SAHが内血管フィラメントモデルを用いて誘導された3匹では、3人が偽の手術を得たが、頭蓋内頸動脈(ICA)および頭蓋外ICAの血流速度は手術の1日前、手術後1、3、7日目に決定された。測定は、37°C19で体温を維持しながら、イソフルランによる麻酔下での別の研究の心エコー検査の一部として行った。

手術前、余分および頭蓋内血流?...

ディスカッション

我々の知る限りでは、この研究は、高周波経頭蓋色分けされた二重超音波を有するSAHのマウスモデルにおける脳血管れん縮のモニタリングプロトコルを提示する最初の研究である。この方法は、マウスでのSAH誘導後の頭蓋内血流速度の増加を測定できることを示す。ヒト医学では、この現象は^3,15でよく知られている。いくつかの臨床研究は、大頭?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balea hair removal creme	Balea; Germany	ASIN B0759XM39V	hair removal creme
C57BL/6N mice	Janvier; Saint-Berthevin Cedex, France	n.a.	mice
Corneregel	Bausch&Lomb; Rochester, NY, USA	REF 81552983	eye ointment, lube
cotton swabs	Hecht Assistent; Sondenheim vor der Röhn, Germany	REF 44302010	cotton swabs
Ecco-XS razor	Tondeo; Soligen, Germany	DE 28693396	razor
Electrode cream	GE; Boston, MA, USA	REF 21708318	conductive paste
Heating plate	Medax; Kiel, Germany	2005-205-01
Isoflurane	Abvie; Wiesbaden, Germany	n.a.	volatile anesthetic
Leukofix	BSN medical; Hamburg, Germany	REF 02137-00	tape
Mechanical arm + micromanipulator	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	P/N 11277
Microbac tissues	Paul Hartmann AG; Hamburg, Germany	REF 981387	antimicrobial tissues
MZ400, 38 MHz linear array transducer	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	REF 51068-30	ultrasound transducer
Sonosid	ASID Bonz GmbH; Herrenberg, Germany	REF 782010	ultrasonography gel
Ultrasound platform with heating plate and ECG-recording	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	P/N 11179
UniVet-Porta	Groppler; Oberperasberg, Germany	S/N BKGM0437	isoflurane vaporizer
Vevo3100	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	REF 51073-45	ultrasonography device
VevoLab software	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	n.a.	evaluation software