Analisi del vasospasmo cerebrale in un modello murino di emorragia subaracnoidea con ultrasuoni duplex transcranici ad alta frequenza

Riepilogo

Lo scopo di questo manoscritto è quello di presentare un metodo basato sulla sonografia che consenta l'imaging in vivo del flusso sanguigno nelle arterie cerebrali nei topi. Dimostriamo la sua applicazione per determinare i cambiamenti nelle velocità del flusso sanguigno associati al vasospasmo nei modelli murini di emorragia subaracnoidea (SAH).

Abstract

Il vasospasmo cerebrale che si verifica nelle settimane successive all'emorragia subaracnoidea, un tipo di ictus emorragico, contribuisce all'ischemia cerebrale ritardata. Un problema riscontrato in studi sperimentali che utilizzano modelli murini di SAH è che mancano metodi per il monitoraggio in vivo del vasospasmo cerebrale nei topi. Qui, dimostriamo l'applicazione di ultrasuoni ad alta frequenza per eseguire esami ecografici Duplex transcranici sui topi. Utilizzando il metodo, potrebbero essere identificate le arterie carotide interne (ICA). Le velocità del flusso sanguigno nelle ICA intracranici sono state accelerate significativamente dopo l'induzione di SAH, mentre le velocità del flusso sanguigno nelle ICA extracranici sono rimaste basse, indicando vasospasmo cerebrale. In conclusione, il metodo qui dimostrato consente il monitoraggio funzionale e non invasivo in vivo del vasospasmo cerebrale in un modello di SAH murino.

Introduzione

L'emorragia subaracnoidea spontanea (SAH) è una forma di ictus emorragico causato principalmente dalla rottura di un aneurisma intracranica¹. L'esito neurologico è principalmente influenzato da due fattori: la lesione cerebrale precoce (EBI), che è causata dagli effetti del sanguinamento e dall'ischemia cerebrale globale transitoria associata, e l'ischemia cerebrale ritardata (DCI), che si verifica durante le settimane successive al^{sanguinamento 2,3}. È stato riferito che il DCI colpisce fino al 30% dei pazienti affetti da SAH². La fisiopatologia del DCI comporta vasospasmo cerebrale angiografico, un microcircolo disturbato causato da microvassopasi e microtrombosi, depressioni corticali di diffusione ed effetti innescati^{dall'infiammazione 4}. Sfortunatamente, l'esatta fisiopatologia rimane poco chiara e non è disponibile alcun trattamento che prevenga efficacemente il DCI³. Pertanto, il DCI è studiato in molti studi clinici e sperimentali.

Al giorno d'oggi, la maggior parte degli studi sperimentali sui SAH utilizzano piccoli modelli animali, specialmente nei^{topi 5,6,7,8,9,10,11,12,13}. In tali studi, il vasospasmo cerebrale è spesso studiato come un endpoint. È comune determinare il grado di vasospasmo ex vivo. Questo perché mancano metodi non invasivi per l'esame in vivo del vasospasmo cerebrale che richiede un breve tempo di anestesia e impone solo poca angoscia agli animali. Tuttavia, l'esame del vasospasmo cerebrale in vivo sarebbe vantaggioso. Questo perché consentirebbe studi longitudinali in vivo sul vasospasmo nei topi (cioè l'imaging del vasospasmo cerebrale in diversi momenti durante i giorni successivi all'induzione del SAH). Ciò migliorerebbe la comparabilità dei dati acquisiti in diversi punti di tempo. Inoltre, l'utilizzo di un progetto di studio longitudinale è una strategia per ridurre il numero di animali.

Qui dimostriamo l'uso di ultrasuoni transcranici ad alta frequenza per determinare il flusso sanguigno nelle arterie cerebrali nei topi. Mostriamo che, simile alla sonografia Doppler transcraniciale (TCD) o alla sonografia Duplex transcranici codificata a colori (TCCD) nella pratica clinica^{14,15,16,17,18}, questo metodo può essere utilizzato per monitorare il vasospasmo cerebrale misurando le velocità del flusso sanguigno delle arterie intracranici dopo l'induzione di SAH nel modello murino.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato responsabile per la cura degli animali (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz) e condotti in conformità con la legge tedesca sul benessere degli animali (TierSchG). Sono state seguite tutte le linee guida internazionali, nazionali e istituzionali applicabili per la cura e l'uso degli animali. In questo studio, abbiamo eseguito misurazioni delle velocità del flusso sanguigno delle arterie intracranici ed extracraniali nei topi C57BL/6N femminili di età compresa tra 11 e 12 settimane con un peso corporeo compreso tra 19-21 g. I topi sono stati sottoposti a induzione di SAH o a chirurgia fittizia, che è stata descritta in dettaglio altrove^10,12,13.

1. Preparazione dei materiali

1. Accendere la macchina ad ultrasuoni e inserire l'ID animale.
2. Riscaldare la piastra riscaldante del sistema ad ultrasuoni a 37 °C. Assicurarsi che la sonda di temperatura rettale sia pronta per l'uso.
3. Utilizzare un bagno d'acqua per riscaldare il gel ad ultrasuoni a 37 °C. Preparare la crema per la depilazione, la crema a contatto per gli elettrodi e l'unguento per gli occhi.

2. Anestesia

1. Indurre l'anestesia mettendo il mouse in una camera lavata con il 4% di isoflurane e il 40% O₂ per 1 min. Proteggi gli occhi con unguento per gli occhi. Continuare solo dopo aver raggiunto un'anestesia sufficientemente profonda (assenza di reazioni agli stimoli del dolore).
2. Mantenere l'anestesia con l'1,5% di isoflurane e il 40% O₂ utilizzando una maschera di anestesia durante l'intera procedura.

3. Determinazione delle velocità del flusso sanguigno delle arterie carotide interne intracranici con sonografia Duplex ad alta frequenza transcranici

1. Posizionare il mouse nella posizione prona sulla piastra riscaldante del sistema ad ultrasuoni per mantenere una temperatura corporea di 37 °C.
2. Rivestire le quattro estremità dell'animale con pasta conduttiva e fissarle con nastro adesivo sugli elettrodi ECG incorporati nella scheda. Verificare se i parametri fisiologici (ECG, segnale di respirazione) sono visualizzati correttamente sullo schermo del sistema di imaging (ad esempio, Vevo3100). Se necessario, regolare il livello di anestesia per ottenere una frequenza cardiaca target di 400-500 battiti al minuto (bpm).
3. Posizionare il lubrificante su una sonda di temperatura rettale e inserirlo con cura per monitorare la temperatura corporea. Se necessario, utilizzare una lampada riscaldante aggiuntiva.
4. Prima del primo esame, rimuovere la pelliccia all'occipite usando chimicamente la crema per la depilazione. Usa un batuffolo di cotone per stendere e strofinare la crema per 2 minuti fino a quando i peli iniziano a cadere.
   1. Dopo altri 2 minuti, rimuovere la crema e i peli con una spatola e disinfettare la pelle con un antisettico alcolico della pelle. Rivestirlo con gel ad ultrasuoni riscaldato a 37 °C.
5. Utilizzare un trasduttore array lineare a 38 MHz e una frequenza fotogrammi superiore a 200 fotogrammi/s per acquisire immagini ad ultrasuoni e fissare la sonda nel braccio meccanico. Posizionare il trasduttore sull'occipite inclinato all'indietro di 30°.
6. Utilizzare la modalità Doppler Brightness-(B) e color-wave-(CW) per visualizzare l'arteria carotide interna intracranica destra e spostare il trasduttore con l'unità di controllo avanti e indietro, fino a trovare il flusso massimo delle arterie.
7. Per raccogliere informazioni anatomiche, utilizzare la tradizionale modalità B e CW-Doppler e iniziare l'acquisizione cliccando sul pulsante Acquista.
   1. Per registrare informazioni sulle caratteristiche di flusso dei recipienti intracranici, fare clic sul pulsante Doppler Pulse-Wave (PW), posizionare il volume del campione al centro della nave e acquisire un ciclo cine più lungo di 3 s.
8. Procedere in modo identico con il lato sinistro.
9. Procedere con le arterie carotidi extracraniali.

4. Determinazione delle velocità del flusso sanguigno delle arterie carotide interne extracranici con sonografia Duplex ad alta frequenza

1. Posizionare il mouse in posizione supina sulla piastra riscaldante del sistema ad ultrasuoni per mantenere una temperatura corporea di 37 °C.
2. Rivestire le quattro estremità dell'animale con pasta conduttiva e fissarle con nastro adesivo sugli elettrodi ECG incorporati nella scheda. Verificare nuovamente la corretta visualizzazione dei parametri fisiologici sullo schermo.
3. Prima del primo esame, rimuovere chimicamente i capelli sul collo anteriore utilizzando la crema per la depilazione come descritto sopra. Rivestire il collo anteriore con gel ad ultrasuoni riscaldato a 37 °C.
4. Utilizzare un trasduttore array lineare a 38 MHz e una frequenza fotogrammi superiore a 200 fotogrammi/s per acquisire immagini ad ultrasuoni. Posizionare il trasduttore parallelo all'animale e regolare la posizione in modo da ottenere immagini longitudinali dell'arteria carotidea destra.
5. Utilizzare la modalità Doppler Brightness-(B) e color-wave-(CW) per visualizzare l'arteria carotidea destra. L'immagine deve contenere la giusta arteria carotide comune (RCC), l'arteria carotide interna destra (RICA) e l'arteria carotide esterna destra (RECA).
6. Per raccogliere informazioni anatomiche, utilizzare la tradizionale modalità B e CW-Doppler e iniziare l'acquisizione cliccando sul pulsante Acquista.
   1. Per registrare informazioni sulle caratteristiche di flusso dell'arteria carotide extracranica cliccare sul pulsante Doppler Pulse-Wave (PW), posizionare il volume del campione al centro della comune arteria carotide, l'arteria carotide interna e l'arteria carotide esterna e acquisire un ciclo cine più lungo di 3 s.
7. Procedere in modo identico con il lato sinistro.
8. Termina l'anestesia e rimuovi l'animale dalla piastra riscaldante. Riportare l'animale in una gabbia posta in un'incubatrice riscaldata a 37 °C per 1 ora per prevenire l'ipotermia e verificare il pieno recupero.

5. Trattamento dei dati di ultrasonografia

1. Utilizzare una workstation esterna per la post-elaborazione dei dati ecografico ad alta frequenza. Esportare le immagini e i cicli cine in modalità B, CW-Doppler e PW-Doppler.
2. Aprire lo studio ecografico esportato. Selezionare un animale e aprire il circuito cine PW-Doppler dell'arteria carotide intracranica. In questo protocollo vengono tipicamente registrati da 7 a 8 battiti cardiaci e corrispondenti curve di velocità di flusso.
3. Mettere in pausa il ciclo del cine e fare clic sul pulsante Misurazione. Scegliete il pacchetto vascolare e fate clic su RICA PSV per misurare la pressione sistolica di picco (PSV). Ora fare clic a sinistra sul picco di una curva di velocità e tirare la linea retta sulla linea zero. Determinare la misurazione con un clic con il pulsante destro del mouse.
4. Ora scegliete RICA EDV per misurare la velocità enddiastolica (EDV). Fare clic a sinistra su un'eruzione cutanea minima della curva di velocità alla fine del diastole. Tirare la linea direttamente sulla linea zero e determinare la misurazione con un clic con il pulsante destro del mouse.
5. Selezionate RICA VTI per misurare l'integrale del tempo di velocità (VTI). Fate clic a sinistra all'inizio di una curva di velocità e seguite la curva con il mouse fino alla fine dell'altopiano diastolico. Quindi fare di nuovo clic con il pulsante destro del mouse per determinare la misurazione.
6. Esportare i dati delle arterie carotidi interne intracerebrali utilizzando il pulsante del report. Premere Esporta e salvare i dati come file di report VSI.
7. Utilizzare lo stesso approccio per misurare PSV, EDV e VTI delle arterie carotidi interne extracranici giuste ed esportare i dati di conseguenza.
8. Procedere in modo identico con il lato sinistro.

Risultati

In 6 topi, in 3 dei quali il SAH è stato indotto utilizzando il modello di perforazione del filamento endovascolare mentre 3 hanno ottenuto un intervento chirurgico fittizio, le velocità del flusso sanguigno dell'arteria carotide interna intracranica (ICA) e dell'ICA extracranica sono state determinate un giorno prima dell'intervento chirurgico e 1, 3 e 7 giorni dopo l'intervento chirurgico. Le misurazioni sono state effettuate nell'ambito degli esami ecocardiografici di un altro studio in anestesia con isoflurane mant...

Discussione

Per quanto ne so, questo studio è il primo a presentare un protocollo per il monitoraggio del vasospasmo cerebrale in un modello murino di SAH con ultrasuoni Duplex transcranici ad alta frequenza codificati a colori. Mostriamo che questo metodo può misurare un aumento delle velocità del flusso sanguigno intracranici dopo l'induzione di SAH nei topi. Nella medicina umana questo fenomeno è ben noto^3,15. Diversi studi clinici hanno dimostrato che elevate velocit...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balea hair removal creme	Balea; Germany	ASIN B0759XM39V	hair removal creme
C57BL/6N mice	Janvier; Saint-Berthevin Cedex, France	n.a.	mice
Corneregel	Bausch&Lomb; Rochester, NY, USA	REF 81552983	eye ointment, lube
cotton swabs	Hecht Assistent; Sondenheim vor der Röhn, Germany	REF 44302010	cotton swabs
Ecco-XS razor	Tondeo; Soligen, Germany	DE 28693396	razor
Electrode cream	GE; Boston, MA, USA	REF 21708318	conductive paste
Heating plate	Medax; Kiel, Germany	2005-205-01
Isoflurane	Abvie; Wiesbaden, Germany	n.a.	volatile anesthetic
Leukofix	BSN medical; Hamburg, Germany	REF 02137-00	tape
Mechanical arm + micromanipulator	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	P/N 11277
Microbac tissues	Paul Hartmann AG; Hamburg, Germany	REF 981387	antimicrobial tissues
MZ400, 38 MHz linear array transducer	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	REF 51068-30	ultrasound transducer
Sonosid	ASID Bonz GmbH; Herrenberg, Germany	REF 782010	ultrasonography gel
Ultrasound platform with heating plate and ECG-recording	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	P/N 11179
UniVet-Porta	Groppler; Oberperasberg, Germany	S/N BKGM0437	isoflurane vaporizer
Vevo3100	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	REF 51073-45	ultrasonography device
VevoLab software	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	n.a.	evaluation software