Análisis Del Vasospasmo Cerebral En Un Modelo Murino De Hemorragia Subaracnoidea Con Ultrasonido Dúplex Transcraneal De Alta Frecuencia

Resumen

El objetivo de este manuscrito es presentar un método basado en la sonografía que permite la obtención de imágenes in vivo del flujo sanguíneo en las arterias cerebrales en ratones. Demostramos su uso para determinar los cambios en las velocidades del flujo de sangre asociadas al vasospasm en modelos murine de la hemorragia subaracoidea (SAH).

Resumen

El vasospasm cerebral que ocurre en las semanas después de la hemorragia subaracoidea, un tipo de movimiento hemorrágico, contribuye a la isquemia cerebral retrasada. Un problema encontrado en estudios experimentales usando los modelos murine de SAH es que los métodos para la supervisión in vivo del vasospasm cerebral en ratones están careciendo. Aquí, se demuestra la aplicación de ultrasonido de alta frecuencia para realizar exámenes de ecografía dúplex transcraneal en ratones. Usando el método, las arterias carótidas internas (AIC) podían ser identificadas. Las velocidades del flujo de sangre en el ICAs intracraneal fueron aceleradas perceptiblemente después de la inducción de SAH, mientras que las velocidades del flujo de sangre en el ICAs extracraneal seguían siendo bajas, indicando el vasospasm cerebral. En conclusión, el método demostrado aquí permite la supervisión in vivo funcional, no invasor del vasospasm cerebral en un modelo murine de SAH.

Introducción

La hemorragia subaracoidea espontánea (HAS) es una forma de accidente cerebrovascular hemorrágico causado principalmente por la ruptura de un aneurisma intracraneal^1. El desenlace neurológico está influenciado principalmente por dos factores: la lesión cerebral precoz (EBI), causada por los efectos del sangrado y la isquemia cerebral global transitoria asociada, y la isquemia cerebral retardada (DCI), que ocurre durante las semanas posteriores al sangrado^2,3. DCI fue divulgado para afectar al hasta 30% de pacientes de SAH^2. La fisiopatología del DCI implica vasoespasmo cerebral angiográfico, una microcirculación perturbada causada por microvasospasmos y microtrombosis, depresiones de diseminación cortical y efectos desencadenados por la inflamación^4. Desafortunadamente, la fisiopatología exacta sigue siendo confusa y no hay tratamiento disponible que prevenga con eficacia DCI^3. Por lo tanto, DCI se investiga en muchos estudios clínicos y experimentales.

Hoy en día, la mayoría de los estudios experimentales sobre SAH utilizan modelos de animales pequeños, especialmente en ratones^{5,6,7,8,9,10,11,12,13.} En tales estudios, el vasospasmo cerebral se investiga con frecuencia como punto final. Es común determinar el grado de vasoespasmo ex vivo. Esto es porque los métodos no invasores para la examinación in vivo del vasospasm cerebral que requiere tiempo corto de la anestesia e imponiendo solamente poca señal de socorro en los animales están careciendo. Sin embargo, la examinación del vasospasm cerebral in vivo sería ventajosa. Esto es porque permitiría estudios longitudinales in vivo en vasospasm en ratones (es decir, proyección de imagen del vasospasm cerebral en diversos puntos del tiempo durante los días después de la inducción de SAH). Esto mejoraría la comparabilidad de los datos adquiridos en diferentes momentos. Además, el uso de un diseño de estudio longitudinal es una estrategia para reducir el número de animales.

Aquí se demuestra el uso de ultrasonido transcraneal de alta frecuencia para determinar el flujo sanguíneo en las arterias cerebrales en ratones. Mostramos que, similar a la sonografía transcraneal de Doppler (TCD) o a la sonografía dúplex codificada por colores transcraneales (TCCD) en la práctica clínica^{14,15,16,17,18,}este método se puede utilizar para monitorear el vasoespasmo cerebral midiendo las velocidades del flujo sanguíneo de las arterias intracraneales después de la inducción de SAH en el modelo murino.

Protocolo

Los experimentos con animales fueron aprobados por el comité responsable de cuidado de animales (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz) y llevados a cabo de acuerdo con la Ley alemana de bienestar animal (TierSchG). Se siguieron todas las directrices internacionales, nacionales e institucionales aplicables para el cuidado y uso de animales. En este estudio, realizamos medidas de las velocidades del flujo de sangre de arterias intracraneales y extracraneales en ratones femeninos de C57BL/6N envejecidos 11-12 semanas con un peso corporal entre 19-21 g. Los ratones fueron sometidos a la inducción de SAH o a una cirugía simulada, que se ha descrito en detalle en otras partes^10,12,13.

1. Preparación de materiales

1. Encienda la máquina de ultrasonido e ingrese la identificación del animal.
2. Caliente la placa de calentamiento del sistema de ultrasonido a 37 °C. Asegúrese de que la sonda de temperatura rectal esté lista para su uso.
3. Use un baño de agua para calentar el gel de ultrasonido a 37 °C. Prepare crema de depilación, crema de contacto para los electrodos y ungüento para los ojos.

2. Anestesia

1. Induzca la anestesia poniendo el ratón en una cámara enrojecida con isoflurano al 4% y al 40%_O2 durante 1 min. Proteja los ojos con ungüento para los ojos. Continuar sólo después de que se haya alcanzado una anestesia suficientemente profunda (ausencia de reacciones a los estímulos de dolor).
2. Mantener la anestesia con isoflurano al 1,5% y_O2 al 40% utilizando una máscara anestésica durante todo el procedimiento.

3. Determinación de las velocidades del flujo sanguíneo de las arterias carótidas internas intracraneales con sonografía dúplex de alta frecuencia transcraneal

1. Coloque el ratón en posición decúbito prono en la placa de calentamiento del sistema de ultrasonido para mantener una temperatura corporal de 37 °C.
2. Cubra las cuatro extremidades del animal con pasta conductora y fijarlas con cinta adhesiva en los electrodos de ECG incrustados en el tablero. Compruebe si los parámetros fisiológicos (ECG, señal de respiración) se muestran correctamente en la pantalla del sistema de imágenes (por ejemplo, Vevo3100). Si es necesario, ajuste el nivel de anestesia para obtener una frecuencia cardíaca objetivo de 400-500 latidos por minuto (lpm).
3. Coloque lubricante en una sonda de temperatura rectal e insértela cuidadosamente para controlar la temperatura corporal. Utilice una lámpara de calentamiento adicional si es necesario.
4. Antes del primer examen, retire el pelaje en el occipucio químicamente usando crema de depilación. Use un hisopo de algodón para extender y frotar la crema durante 2 minutos hasta que los pelos comiencen a caerse.
   1. Después de 2 min adicionales, retire la crema y los pelos con una espátula y desinfecte la piel con un antiséptico alcohólico de la piel. Recubrirlo con gel de ultrasonido calentado a 37 °C.
5. Utilice un transductor de matriz lineal de 38 MHz y una velocidad de fotogramas superior a 200 fotogramas/s para adquirir imágenes de ultrasonido y fijar la sonda en el brazo mecánico. Coloque el transductor en el occipucio inclinado hacia atrás por 30°.
6. Utilice el modo Doppler Brillo(B) y el modo Doppler de onda de color (CW) para visualizar la arteria carótida interna intracraneal derecha y mueva el transductor con la unidad de control hacia atrás y hacia adelante, hasta que se encuentre el flujo máximo de las arterias.
7. Para recopilar información anatómica, utilice el modo B tradicional y el modo CW-Doppler e inicie la adquisición haciendo clic en el botón Adquirir.
   1. Para registrar información sobre las características de flujo de los recipientes intracraneales, haga clic en el botón Doppler de onda de pulso (PW), coloque el volumen de la muestra en el centro del recipiente y adquiera un bucle de cine de más de 3 s.
8. Proceda idénticamente con el lado izquierdo.
9. Proceda con las arterias carótidas extracraneales.

4. Determinación de las velocidades del flujo sanguíneo de las arterias carótidas internas extracraneales con sonografía dúplex de alta frecuencia

1. Coloque el ratón en decúbito supino sobre la placa de calentamiento del sistema de ultrasonido para mantener una temperatura corporal de 37 °C.
2. Cubra las cuatro extremidades del animal con pasta conductora y fijarlas con cinta adhesiva en los electrodos de ECG incrustados en el tablero. Compruebe de nuevo la visualización correcta de los parámetros fisiológicos en la pantalla.
3. Antes del primer examen, retire el vello en la parte delantera del cuello químicamente mediante el uso de crema de depilación como se describió anteriormente. Cubra el cuello delantero con gel de ultrasonido calentado a 37 °C.
4. Utilice un transductor de matriz lineal de 38 MHz y una velocidad de fotogramas superior a 200 fotogramas/s para adquirir imágenes de ultrasonido. Coloque el transductor paralelo al animal y ajuste la posición para obtener imágenes longitudinales de la arteria carótida derecha.
5. Utilice el modo Doppler Brillo(B) y el modo Doppler De onda de color (CW) para visualizar la arteria carótida derecha. La imagen debe contener la arteria carótida común derecha (CCR), la arteria carótida interna derecha (RICA) y la arteria carótida externa derecha (RECA).
6. Para recopilar información anatómica, utilice el modo B tradicional y el modo CW-Doppler e inicie la adquisición haciendo clic en el botón Adquirir.
   1. Para registrar la información sobre las características de flujo de la arteria carótida extracraneal, haga clic en el botón Doppler de onda de pulso (PW), coloque el volumen de la muestra en el centro del centro de la arteria carótida común, la arteria carótida interna y la arteria carótida externa y adquiera un bucle cine más largo que 3 s.
7. Proceda idénticamente con el lado izquierdo.
8. Termine la anestesia y retire al animal de la placa de calentamiento. Devolver al animal a una jaula colocada en una incubadora calentada a 37 °C durante 1 hora para prevenir la hipotermia y comprobar la recuperación completa.

5. Tratamiento de datos de ecografía

1. Utilice una estación de trabajo externa para el post-procesamiento de los datos de ultrasonido de alta frecuencia. Exporte las imágenes en modo B, modo CW-Doppler y modo PW-Doppler y bucles cine.
2. Abra el estudio de ultrasonido exportado. Seleccione un animal y abra el bucle cine PW-Doppler de la arteria carótida intracraneal. En este protocolo típicamente se registran de 7 a 8 latidos del corazón y las curvas de velocidad de flujo correspondientes.
3. Pausa el bucle de cine y haz clic en el botón Medición. Elija el Paquete Vascular y haga clic en RICA PSV para medir la presión sistólica máxima (PSV). Ahora haga clic a la izquierda en el pico de una curva de velocidad y tire de la línea recta a la línea cero. Determine la medición con un clic con el botón derecho del ratón.
4. Ahora elija RICA EDV para medir la velocidad enddiastólica (EDV). Haga clic a la izquierda en la erupción mínima de la curva de velocidad al final de la diástole. Tire de la línea recta a la línea cero y determinar la medición mediante un clic con el botón derecho del ratón.
5. Elija RICA VTI para medir la integral de tiempo de velocidad (VTI). Haga clic a la izquierda al principio de una curva de velocidad y siga la curva con el ratón hasta el final de la meseta diastólica. A continuación, haga clic a la derecha de nuevo para determinar la medición.
6. Exporte los datos de las arterias carótidas internas intracerebrales utilizando el botón de informe. Pulse Exportar y guarde los datos como un archivo de informe VSI.
7. Utilice el mismo enfoque para medir psv, EDV y VTI de las arterias carótidas internas extracraneales derechas y exportar los datos en consecuencia.
8. Proceda idénticamente con el lado izquierdo.

Resultados

En 6 ratones, en 3 cuyo SAH fue inducido usando el modelo endovascular de la perforación del filamento mientras que 3 obtuvieron cirugía falsa, las velocidades del flujo de sangre de la arteria carótida interna intracraneal (AIC) y del AIC extracraneal fueron determinadas un día antes de cirugía, y 1, 3, y 7 días después de la cirugía. Las mediciones se realizaron como parte de los exámenes ecocardiográficos de otro estudio bajo anestesia con isoflurano manteniendo la temperatura corporal a 37 °C

Discusión

Al mejor de nuestro conocimiento, este estudio es el primer para presentar un protocolo para la supervisión del vasospasm cerebral en un modelo murine de SAH con ultrasonido a dos caras color-codificado transcranial de alta frecuencia. Mostramos que este método puede medir un aumento en las velocidades intracraneales del flujo sanguíneo después de la inducción de SAH en ratones. En medicina humana este fenómeno es bien conocido^3,15. Varios estudios clínico...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balea hair removal creme	Balea; Germany	ASIN B0759XM39V	hair removal creme
C57BL/6N mice	Janvier; Saint-Berthevin Cedex, France	n.a.	mice
Corneregel	Bausch&Lomb; Rochester, NY, USA	REF 81552983	eye ointment, lube
cotton swabs	Hecht Assistent; Sondenheim vor der Röhn, Germany	REF 44302010	cotton swabs
Ecco-XS razor	Tondeo; Soligen, Germany	DE 28693396	razor
Electrode cream	GE; Boston, MA, USA	REF 21708318	conductive paste
Heating plate	Medax; Kiel, Germany	2005-205-01
Isoflurane	Abvie; Wiesbaden, Germany	n.a.	volatile anesthetic
Leukofix	BSN medical; Hamburg, Germany	REF 02137-00	tape
Mechanical arm + micromanipulator	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	P/N 11277
Microbac tissues	Paul Hartmann AG; Hamburg, Germany	REF 981387	antimicrobial tissues
MZ400, 38 MHz linear array transducer	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	REF 51068-30	ultrasound transducer
Sonosid	ASID Bonz GmbH; Herrenberg, Germany	REF 782010	ultrasonography gel
Ultrasound platform with heating plate and ECG-recording	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	P/N 11179
UniVet-Porta	Groppler; Oberperasberg, Germany	S/N BKGM0437	isoflurane vaporizer
Vevo3100	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	REF 51073-45	ultrasonography device
VevoLab software	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	n.a.	evaluation software