高频颅内双体超声波的苏巴拉赫诺德出血的穆林模型脑血管痉挛分析

摘要

本手稿的目的是提出一种基于声学的方法，允许 在体内 成像小鼠脑动脉的血流。我们演示了它的应用，以确定与血管痉挛相关的血流速度的变化，在亚拉氏出血（SAH）的穆林模型。

摘要

脑血管痉挛发生在亚拉氏出血后的几周内，这是一种出血性中风，导致脑缺血延迟。在使用SAH的murine模型的实验研究中遇到的一个问题是缺乏对小鼠脑血管痉挛进行 体内 监测的方法。在这里，我们演示了高频超声波在小鼠身上进行颅面双子全息检查的应用。使用该方法，可以识别内部胡萝卜动脉 （ICA）。吸入SAH后，颅内ICA的血流速度显著加快，而颅内ICA的血流速度仍然很低，表明脑血管痉挛。最后，这里演示的方法允许在murine SAH模型中对脑血管痉挛进行功能性、非侵入性的 体内 监测。

引言

自发性亚拉氏出血（SAH）是一种出血性中风，主要由颅内动脉瘤¹破裂引起。神经学结果主要受两个因素的影响:早期脑损伤（EBI），这是由出血和相关的瞬态全球脑缺血的影响，和延迟脑缺血（DCI），这发生在出血^后2，3的几个星期。据报道，DCI影响高达30%的SAH患者^2。DCI的病理生理学涉及血管造影脑血管痉挛，一种由微血管痉挛和微血栓引起的干扰微循环，皮质扩散性抑郁症，以及炎症⁴引起的影响。不幸的是，确切的病理生理学仍然不清楚，没有可用的治疗方法，有效地防止DCI^3。因此，DCI在许多临床和实验研究中都进行了研究。

如今，大多数关于SAH的实验研究都使用小型动物模型，特别是在小鼠^{5、6、7、8、9、10、11、12、13。}在此类研究中，脑血管痉挛经常被调查为终点。这是常见的，以确定血管痉挛前活体的程度。这是因为脑血管痉挛的体内检查的非侵入性方法需要很短的麻醉时间，只对动物造成很少的困扰。然而，在体内检查脑血管痉挛将是有利的。这是因为它允许在体内对小鼠血管痉挛的研究（即在SAH诱导后的几天内在不同时间点对脑血管痉挛进行成像）。这将提高在不同时间点获得的数据的可比性。此外，使用纵向研究设计是减少动物数量的策略。

在这里，我们演示使用高频颅外超声波来确定小鼠脑动脉的血流量。我们表明，类似于颅内多普勒声像（TCD）或颅内颜色编码的双体声学（TCCD）在临床实践14，15，16，17，18，这种方法可用于监测脑血管痉挛，测量血流速度后，SAH诱导在Murine模型。

研究方案

动物实验由负责动物护理委员会（莱茵兰-普法尔茨）批准，并根据德国动物福利法（TierSchG）进行。遵循所有适用的国际、国家和机构关于照顾和使用动物的准则。在这项研究中，我们进行了女性C57BL/6N小鼠颅内和颅外动脉血流速度的测量，年龄在11-12周，体重在19-21克之间。这些老鼠要么接受SAH诱导手术，要么接受虚假手术，这在其他地方已经详细描述了10、12、13。

1. 材料准备

1. 打开超声波机，输入动物 ID 。
2. 将超声波系统的加热板加热至 37 °C。 确保直肠温度探头已准备就绪，可使用。
3. 使用水浴将超声波凝胶加热至37°C。 准备脱毛霜、电极接触霜和眼药膏。

2. 麻醉

1. 通过将鼠标放入一个用4%异氟兰和40%O₂ 冲洗1分钟的腔室来诱导麻醉。用眼药膏保护眼睛。只有在达到足够深的麻醉（对疼痛刺激没有反应）后才能继续。
2. 在整个过程中使用麻醉面膜保持麻醉1.5%异氟兰和40%O_2。

3. 通过颅内高频双曲声像，确定颅内胡萝卜动脉的血流速度

1. 将鼠标放在超声波系统加热板的易感位置，以保持 37 °C 的体温。
2. 用导电膏涂上动物的四肢，用嵌入在板中的ECG电极上的胶带固定它们。检查成像系统屏幕上是否正确显示生理参数（ECG、呼吸信号）（例如 Vevo3100）。如有必要，调整麻醉水平，以获得每分钟 400-500 次（bpm）的目标心率。
3. 将润滑油放在直肠温度探头上，并小心插入以监测体温。如有必要，请使用额外的加热灯。
4. 在第一次检查之前，使用脱毛霜化学地去除手术部的皮毛。使用棉签展开并擦奶油2分钟，直到头发开始脱落。
   1. 再过2分钟，用铲子取出奶油和头发，用酒精性皮肤防腐剂对皮肤进行消毒。涂上超声波凝胶加热至37°C。
5. 使用 38 MHz 线性阵列传感器和高于 200 帧/s 的帧速率来获取超声波图像并固定机械臂中的探头。将传感器放在向后倾斜 30°的 occiput 上。
6. 使用亮度-（B）模式和色波-（CW）多普勒模式可视化右 颅内 胡萝卜动脉，并用控制单元来回移动传感器，直到找到动脉的最大流量。
7. 要收集解剖信息，请使用传统的 B 模式和 CW-多普勒模式，然后单击 "获取 "按钮开始获取。
   1. 要记录颅内血管的流动特征信息，请单击脉冲波 （PW） 多普勒按钮，将样本量放在容器中心，并获取超过 3 s 的 Cine 循环。
8. 与左侧进行相同的。
9. 继续进行颅外胡萝卜动脉。

4. 高频双体声像外内胡萝卜动脉血流速度的确定

1. 将鼠标放在超声波系统加热板的超音速位置，以保持 37 °C 的体温。
2. 用导电膏涂上动物的四肢，用嵌入在板中的ECG电极上的胶带固定它们。再次检查屏幕上生理参数的正确显示。
3. 在第一次检查之前，使用上述脱毛霜化学地去除前颈部的头发。涂上超声波凝胶的前颈部，加热至37°C。
4. 使用 38 MHz 线性阵列传感器和高于 200 帧/s 的帧速率获取超声波图像。将传感器与动物平行放置并调整位置，以获取右胡萝卜动脉的纵向图像。
5. 使用亮度-（B）模式和色波-（CW）多普勒模式来可视化右胡萝卜动脉。图像应包含正确的普通胡萝卜动脉 （RCC）、右内胡萝卜动脉 （RICA） 和右外部胡萝卜动脉 （RECA）。
6. 要收集解剖信息，请使用传统的 B 模式和 CW-多普勒模式，然后单击 "获取 "按钮开始获取。
   1. 要记录颅外胡萝卜动脉的流动特征信息，请单击 脉冲波 （PW） 多普勒 按钮，将样本体积置于普通胡萝卜动脉、内胡萝卜动脉和外部胡萝卜动脉中间的中心，并获取超过 3 s 的阴离子循环。
7. 与左侧进行相同的。
8. 终止麻醉，将动物从加热板中取出。将动物放回放在加热至37°C的笼子里1小时，以防止体温过低，并检查是否完全恢复。

5. 处理超声波数据

1. 使用外部工作站对高频超声波数据进行后期处理。导出 B 模式、CW-多普勒模式和 PW-多普勒模式图像和胶片循环。
2. 打开出口超声波研究。选择一种动物，打开颅内胡萝卜动脉的PW-多普勒阴循环。在此协议中，通常记录 7 到 8 个心跳和相应的流速曲线。
3. 暂停胶片循环并单击 测量 按钮。选择 血管包 ，然后单击 RICA PSV 以测量峰值收缩压 （PSV）。现在单击速度曲线的峰值，将直线拉至零线。通过点击正确的鼠标按钮确定测量结果。
4. 现在选择 RICA EDV 来测量末端糖尿病速度 （EDV）。单击在硅油末端速度曲线的最小皮疹。将线直接拉到零线，然后用正确的鼠标按钮单击确定测量结果。
5. 选择 RICA VTI 以测量速度时间积分 （VTI）。单击速度曲线的开头左侧，然后用鼠标跟随曲线，直到舒张高原结束。然后再次右键单击以确定测量结果。
6. 使用报告按钮导出颅内胡萝卜动脉的数据。按 下导出 并保存数据作为 VSI 报告文件。
7. 使用相同的方法测量右颅内胡萝卜动脉的 PSV、EDV 和 VTI，并相应地导出数据。
8. 与左侧进行相同的。

结果

在6只小鼠中，其中3只小鼠使用血管内丝穿孔模型诱导SAH，3只获得假手术，颅内胡萝卜动脉（ICA）和颅外ICA的血流速度在手术前一天确定，手术后1天、3天和7天确定。测量是作为另一项研究的回声心动图检查的一部分，麻醉下与异氟兰，同时保持体温在37°C^19。

手术前，颅外和颅内血流速度，以及颅内和颅外血流的商数在SAH和假动物之间相似。在SAH上岗后的?...

讨论

据我们所知，这项研究是第一次提出一个协议，以监测大脑血管痉挛在SAH的murine模型与高频颅面颜色编码双面超声波。我们表明，这种方法可以测量小鼠SAH诱导后颅内血流速度的增加。在人类医学中，这种现象是众所周知的^3，15。多项临床研究表明，大颅内动脉血流速度升高和颅内和颅内血流速度升高是血管变窄的功能后果，与血管血管痉挛相关

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balea hair removal creme	Balea; Germany	ASIN B0759XM39V	hair removal creme
C57BL/6N mice	Janvier; Saint-Berthevin Cedex, France	n.a.	mice
Corneregel	Bausch&Lomb; Rochester, NY, USA	REF 81552983	eye ointment, lube
cotton swabs	Hecht Assistent; Sondenheim vor der Röhn, Germany	REF 44302010	cotton swabs
Ecco-XS razor	Tondeo; Soligen, Germany	DE 28693396	razor
Electrode cream	GE; Boston, MA, USA	REF 21708318	conductive paste
Heating plate	Medax; Kiel, Germany	2005-205-01
Isoflurane	Abvie; Wiesbaden, Germany	n.a.	volatile anesthetic
Leukofix	BSN medical; Hamburg, Germany	REF 02137-00	tape
Mechanical arm + micromanipulator	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	P/N 11277
Microbac tissues	Paul Hartmann AG; Hamburg, Germany	REF 981387	antimicrobial tissues
MZ400, 38 MHz linear array transducer	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	REF 51068-30	ultrasound transducer
Sonosid	ASID Bonz GmbH; Herrenberg, Germany	REF 782010	ultrasonography gel
Ultrasound platform with heating plate and ECG-recording	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	P/N 11179
UniVet-Porta	Groppler; Oberperasberg, Germany	S/N BKGM0437	isoflurane vaporizer
Vevo3100	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	REF 51073-45	ultrasonography device
VevoLab software	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	n.a.	evaluation software