Análise do Vasospasmo Cerebral em um Modelo Murine de Hemorragia Subaracnóide com Ultrassom Duplex Transcranial de Alta Frequência

Resumo

O objetivo deste manuscrito é apresentar um método baseado em sonografia que permita imagens in vivo do fluxo sanguíneo em artérias cerebrais em camundongos. Demonstramos sua aplicação para determinar alterações nas velocidades de fluxo sanguíneo associadas ao vasospasmo em modelos murinos de hemorragia subaracnóide (SAH).

Resumo

O vasospasmo cerebral que ocorre nas semanas após a hemorragia subaracnóide, um tipo de derrame hemorrágico, contribui para isquemia cerebral retardada. Um problema encontrado em estudos experimentais usando modelos murinos de SAH é que faltam métodos para monitoramento in vivo de vasospasmo cerebral em camundongos. Aqui, demonstramos a aplicação de ultrassom de alta frequência para realizar exames de sonografia duplex transcranária em camundongos. Utilizando o método, as artérias carótidas internas (ICA) puderam ser identificadas. As velocidades de fluxo sanguíneo nas ICAs intracranianas foram aceleradas significativamente após a indução de SAH, enquanto as velocidades de fluxo sanguíneo nas ICAs extracranianas permaneceram baixas, indicando vasospasmo cerebral. Em conclusão, o método aqui demonstrado permite o monitoramento in vivo funcional e não invasivo do vasospasmo cerebral em um modelo MURine SAH.

Introdução

A hemorragia subaracnóide espontânea (SAH) é uma forma de derrame hemorrágico causado principalmente pela ruptura de um aneurisma intracraniano¹. O desfecho neurológico é influenciado principalmente por dois fatores: lesão cerebral precoce (EBI), causada pelos efeitos do sangramento e da isquemia cerebral global transitória associada, e isquemia cerebral retardada (ICD), que ocorre durante as semanas seguintes ao sangramento^2,3. O ICD foi relatado para afetar até 30% dos pacientes de HAS². A fisiopasiologia do ICD envolve vasospasmo cerebral angiográfico, microcirculação perturbada causada por microvasospasmos e microtrombose, depressões corticais e efeitos desencadeados pela inflamação⁴. Infelizmente, a fisiopatologia exata permanece incerta e não há tratamento disponível que efetivamente previne o DCI³. Portanto, o ICD é investigado em muitos estudos clínicos e experimentais.

Atualmente, a maioria dos estudos experimentais sobre HAS utiliza pequenos modelos animais, especialmente em camundongos^{5,6,7,8,9,10,11,12,13}. Nesses estudos, o vasospasmo cerebral é frequentemente investigado como ponto final. É comum determinar o grau de vasospasmo ex vivo. Isso porque faltam métodos não invasivos para exame in vivo do vasospasmo cerebral que requerem pouco tempo de anestesia e impondo pouca angústia aos animais. No entanto, o exame do vasospasmo cerebral in vivo seria vantajoso. Isso porque permitiria estudos longitudinais in vivo sobre vasospasmo em camundongos (ou seja, imagem de vasospasmo cerebral em diferentes pontos de tempo durante os dias após a indução de SAH). Isso aumentaria a comparabilidade dos dados adquiridos em diferentes pontos de tempo. Além disso, usar um desenho de estudo longitudinal é uma estratégia para reduzir o número de animais.

Aqui demonstramos o uso de ultrassom transcranário de alta frequência para determinar o fluxo sanguíneo em artérias cerebrais em camundongos. Mostramos que, semelhante à sonografia doppler transcraniana (TCD) ou sonografia duplex codificada por cores transcranianas (TCCD) na prática clínica^{14,15,16,17,18}, este método pode ser usado para monitorar o vasospasmo cerebral medindo as velocidades de fluxo sanguíneo das artérias intracranianas após a indução da SAH no modelo murina.

Protocolo

Os experimentos em animais foram aprovados pelo comitê responsável de cuidados com animais (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz) e conduzidos de acordo com a Lei Alemã de Bem-Estar Animal (TierSchG). Todas as diretrizes internacionais, nacionais e institucionais aplicáveis para o cuidado e o uso dos animais foram seguidas. Neste estudo, foram realizadas medições de velocidades de fluxo sanguíneo de artérias intracranianas e extracranianas em camundongos C57BL/6N femininos de 11 a 12 semanas com peso corporal entre 19 e 21 g. Os camundongos foram submetidos à indução de HAS ou à cirurgia falsa, que foi descrita em detalhes em outros lugares^10,12,13.

1. Preparação de materiais

1. Ligue a máquina de ultrassom e digite a 8h do animal.
2. Aqueça a placa de aquecimento do sistema de ultrassom a 37 °C. Certifique-se de que a sonda de temperatura retal está pronta para uso.
3. Use um banho de água para aquecer o gel de ultrassom a 37 °C. Prepare creme de depilação, creme de contato para os eletrodos e pomada ocular.

2. Anestesia

1. Induzir anestesia colocando o rato em uma câmara lavada com 4% de isoflurane e 40% O₂ por 1 min. Proteja os olhos com pomada ocular. Continue somente depois que uma anestesia suficientemente profunda for alcançada (ausência de reações a estímulos de dor).
2. Mantenha anestesia com isoflurane de 1,5% e 40% O₂ usando uma máscara de anestesia durante todo o procedimento.

3. Determinação das velocidades de fluxo sanguíneo das artérias carótidas internas intracranianas com sonografia duplex transcraniana de alta frequência

1. Coloque o mouse na posição propensa na placa de aquecimento do sistema de ultrassom para manter uma temperatura corporal de 37 °C.
2. Cubra as quatro extremidades do animal com pasta condutora e fixe-as com fita nos eletrodos ECG embutidos na placa. Verifique se os parâmetros fisiológicos (ECG, sinal de respiração) são exibidos corretamente na tela do sistema de imagem (por exemplo, Vevo3100). Se necessário, ajuste o nível de anestesia para obter a frequência cardíaca alvo de 400-500 batidas por minuto (bpm).
3. Coloque o lubrificante em uma sonda de temperatura retal e insira-o cuidadosamente para monitorar a temperatura corporal. Use uma lâmpada de aquecimento adicional, se necessário.
4. Antes do primeiro exame, remova a pele na occiput quimicamente usando creme de depilação. Use um cotonete para espalhar e esfregue o creme por 2 minutos até os cabelos começarem a cair.
   1. Depois de mais 2 minutos, remova o creme e os cabelos com uma espátula e desinfete a pele com um antisséptico de pele alcoólica. Cubra-o com gel de ultrassom aquecido a 37 °C.
5. Use um transdutor de matriz linear de 38 MHz e uma taxa de quadros acima de 200 quadros/s para adquirir imagens de ultrassom e fixar a sonda no braço mecânico. Coloque o transdutor na occiput inclinada para trás em 30°.
6. Use o modo Brightness-(B)-mode e Color-wave-(CW) Doppler-mode para visualizar a artéria carótida interna intracraniana direita e mover o transdutor com a unidade de controle para trás e para frente, até que o fluxo máximo das artérias seja encontrado.
7. Para coletar informações anatômicas, use o modo B-Mode e CW-Doppler tradicionais e comece a ser adquirido clicando no botão Adquirir.
   1. Para registrar informações sobre as características de fluxo dos vasos intracranianos clique no botão Doppler Pulse-Wave (PW), coloque o volume da amostra no centro da embarcação e adquira um loop cine com mais de 3 s.
8. Prossiga de forma idêntica com o lado esquerdo.
9. Prossiga com as artérias carótidas extracranais.

4. Determinação das velocidades de fluxo sanguíneo das artérias carótidas internas extracranais com sonografia duplex de alta frequência

1. Coloque o mouse na posição supina na placa de aquecimento do sistema de ultrassom para manter uma temperatura corporal de 37 °C.
2. Cubra as quatro extremidades do animal com pasta condutora e fixe-as com fita nos eletrodos ECG embutidos na placa. Verifique novamente se há uma exibição correta dos parâmetros fisiológicos na tela.
3. Antes do primeiro exame, remova quimicamente o cabelo do pescoço frontal usando creme de depilação como descrito acima. Cubra o pescoço dianteiro com gel de ultrassom aquecido a 37 °C.
4. Use um transdutor de matriz linear de 38 MHz e uma taxa de quadros acima de 200 quadros/s para adquirir imagens de ultrassom. Coloque o transdutor paralelamente ao animal e ajuste a posição para obter imagens longitudinais da artéria carótida direita.
5. Use o modo Brightness-(B)-mode e o modo Doppler de onda colorida para visualizar a artéria carótida direita. A imagem deve conter a artéria carótida comum direita (RCC), a artéria carótida interna direita (RICA) e a artéria carótida externa direita (RECA).
6. Para coletar informações anatômicas, use o modo B-Mode e CW-Doppler tradicionais e comece a ser adquirido clicando no botão Adquirir.
   1. Para registrar informações sobre as características de fluxo da artéria carótida extracranal clique no botão Doppler Pulse-Wave (PW), coloque o volume amostral no centro do meio da artéria carótida comum, a artéria carótida interna e a artéria carótida externa e adquira um laço de cine com mais de 3 s.
7. Prossiga de forma idêntica com o lado esquerdo.
8. Termine a anestesia e remova o animal da placa de aquecimento. Volte o animal para uma gaiola colocada em uma incubadora aquecida a 37 °C durante 1 hora para evitar hipotermia e verifique se há recuperação completa.

5. Processamento de dados de ultrassonografia

1. Use uma estação de trabalho externa para pós-processamento dos dados de ultrassom de alta frequência. Exporte as imagens e loops de cine do modo B, do modo CW-Doppler e do modo PW-Doppler.
2. Abra o estudo de ultrassom exportado. Selecione um animal e abra o laço cine PW-Doppler da artéria carótida intracraniana. Neste protocolo normalmente são registrados 7 a 8 batimentos cardíacos e curvas correspondentes de velocidade de fluxo.
3. Pause o loop do cine e clique no botão Medição. Escolha o Pacote Vascular e clique em PSV rico para medir o pico de pressão sistólica (PSV). Agora clique à esquerda no pico de uma curva de velocidade e puxe a linha reta para a linha zero. Determine a medição por um clique com o botão direito do mouse.
4. Agora escolha rica EDV para medir a velocidade enddiastólica (EDV). Clique à esquerda na erupção cutânea mínima da curva de velocidade no final da diastole. Puxe a linha diretamente para a linha zero e determine a medição por um clique com o botão direito do mouse.
5. Escolha o VTI rico para medir o tempo de velocidade integral (VTI). Clique à esquerda no início de uma curva de velocidade e siga a curva com o mouse até o final do planalto diastólico. Em seguida, clique novamente à direita para determinar a medição.
6. Exporte os dados das artérias carótidas internas intracerebral usando o botão de relatório. Pressione exportar e salve os dados como um arquivo VSI Report.
7. Use a mesma abordagem para medir PSV, EDV e VTI das artérias carótidas internas extracranais certas e exportar os dados em conformidade.
8. Prossiga de forma idêntica com o lado esquerdo.

Resultados

Em 6 camundongos, em 3 dos quais a HAS foi induzida usando o modelo de perfuração de filamento endovascular enquanto 3 obtiveram cirurgia falsa, as velocidades de fluxo sanguíneo da artéria carótida interna intracraniana (ICA) e da ICA extracraniana foram determinadas um dia antes da cirurgia, e 1, 3 e 7 dias após a cirurgia. As medições foram realizadas como parte dos exames de ecocardiografia de outro estudo sob anestesia com isoflurano, mantendo a temperatura corporal a 37 °C¹⁹.

Discussão

Até onde sabemos, este estudo é o primeiro a apresentar um protocolo de monitoramento do vasospasmo cerebral em um modelo murino de SAH com ultrassom Duplex codificado por cores transcranais de alta frequência. Mostramos que este método pode medir um aumento das velocidades de fluxo sanguíneo intracraniano após a indução de SAH em camundongos. Na medicina humana este fenômeno é bem conhecido^3,15. Vários estudos clínicos têm demonstrado que as velocid...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balea hair removal creme	Balea; Germany	ASIN B0759XM39V	hair removal creme
C57BL/6N mice	Janvier; Saint-Berthevin Cedex, France	n.a.	mice
Corneregel	Bausch&Lomb; Rochester, NY, USA	REF 81552983	eye ointment, lube
cotton swabs	Hecht Assistent; Sondenheim vor der Röhn, Germany	REF 44302010	cotton swabs
Ecco-XS razor	Tondeo; Soligen, Germany	DE 28693396	razor
Electrode cream	GE; Boston, MA, USA	REF 21708318	conductive paste
Heating plate	Medax; Kiel, Germany	2005-205-01
Isoflurane	Abvie; Wiesbaden, Germany	n.a.	volatile anesthetic
Leukofix	BSN medical; Hamburg, Germany	REF 02137-00	tape
Mechanical arm + micromanipulator	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	P/N 11277
Microbac tissues	Paul Hartmann AG; Hamburg, Germany	REF 981387	antimicrobial tissues
MZ400, 38 MHz linear array transducer	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	REF 51068-30	ultrasound transducer
Sonosid	ASID Bonz GmbH; Herrenberg, Germany	REF 782010	ultrasonography gel
Ultrasound platform with heating plate and ECG-recording	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	P/N 11179
UniVet-Porta	Groppler; Oberperasberg, Germany	S/N BKGM0437	isoflurane vaporizer
Vevo3100	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	REF 51073-45	ultrasonography device
VevoLab software	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	n.a.	evaluation software