Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، نقدم اختبار الثقافة المشتركة سهلة الاستخدام لتحليل الورم الأرومي الدبقي (GBM) الهجرة على الخلايا العصبية المنقوشة. قمنا بتطوير ماكرو في برنامج FiJi لسهولة تحديد كمي لهجرة خلايا GBM على الخلايا العصبية ، ولاحظنا أن الخلايا العصبية تعدل قدرة الخلايا الغازية GBM.

Abstract

الأورام الأرومية الدبقية (GBMs)، الأورام الدبقية الخبيثة من الدرجة الرابعة، هي واحدة من أكثر أنواع السرطان البشري فتكا بسبب خصائصها العدوانية. على الرغم من التقدم الكبير في علم الوراثة من هذه الأورام، كيف تغزو خلايا GBM بارنشيما الدماغ السليمة ليست مفهومة جيدا. وتجدر الإشارة إلى أنه تبين أن خلايا GBM تغزو الفضاء المحيطي عبر طرق مختلفة؛ المصلحة الرئيسية لهذه الورقة هو الطريق على طول مساحات المادة البيضاء (WMTs). لا تتميز تفاعلات الخلايا السرطانية مع مكونات الخلايا العصبية المحيطة بالورم بشكل جيد. هنا، وقد وصفت طريقة تقيم تأثير الخلايا العصبية على غزو الخلايا GBM. تقدم هذه الورقة ثقافة مشتركة متقدمة في الفحص المختبري الذي يحاكي غزو WMT من خلال تحليل هجرة الخلايا الجذعية الشبيهة ب GBM على الخلايا العصبية. يتم مراقبة سلوك خلايا GBM في وجود الخلايا العصبية باستخدام إجراء تتبع تلقائي مع برامج مفتوحة المصدر والوصول الحر. هذه الطريقة مفيدة للعديد من التطبيقات، على وجه الخصوص، للدراسات الوظيفية والميكانية وكذلك لتحليل آثار العوامل الدوائية التي يمكن أن تمنع هجرة خلايا GBM على الخلايا العصبية.

Introduction

الأورام الدبقية الخبيثة الأولية، بما في ذلك GBMs، هي أورام مدمرة، مع معدل بقاء متوسط من 12 إلى 15 شهرا لمرضى GBM. يعتمد العلاج الحالي على استئصال كتلة الورم الكبيرة والعلاج الكيميائي إلى جانب العلاج الإشعاعي ، والذي يمدد معدل البقاء على قيد الحياة لبضعة أشهر فقط. ترتبط الإخفاقات العلاجية ارتباطا وثيقا بضعف تسليم الأدوية عبر حاجز الدم في الدماغ (BBB) والنمو الغازي في المساحات المحيطة بالأوعية الدموية ، السحايا ، وعلى طول WMTs1. غزو الأوعية الدموية، وتسمى أيضا الأوعية الدموية الخيار المشترك، هو عملية مدروسة جيدا، والآليات الجزيئية بدأت في توضيح؛ ومع ذلك، فإن عملية غزو خلايا GBM على طول WMTs غير مفهومة جيدا. الخلايا السرطانية تهاجر إلى الدماغ السليم على طول الهياكل الثانوية شيرر2. في الواقع ، منذ ما يقرب من قرن واحد ، وصف هانز يواكيم شيرر الطرق الغازية ل GBM ، والتي يشار إليها الآن باسم الساتيليات البينوروانية ، وداء الشبع المحيطي والأوعية الدموية ، وانتشار تحت الحيوية ، والغزو على طول WMT (الشكل 1A).

بعض chemokines ومستقبلاتها، مثل الخلايا النجمية المستمدة من عامل-1α (SDF1α) وC-X-C عزر مستقبلات chemokine 4 (CXCR4)، ولكن ليس عامل النمو البطانية الوعائية (VEGF)، ويبدو أن متورطة في غزو WMT3. في الآونة الأخيرة ، وقد تبين أن محور NOTCH1-SOX2 عبر الخلايا ليكون مسارا هاما في غزو WMT من خلايا GBM4. وصف المؤلفون كيف تغزو الخلايا الشبيهة بالجذع GBM الدماغ parenchyma على الخلايا العصبية غير الميالينية جزئيا ، مما يشير إلى تدمير أغماد المايلين بواسطة خلايا GBM. تم الوصول إلى علامة فارقة في عام 2019 عندما تم نشر ثلاث مقالات بشكل قاطع في مجلة نيتشر ، مما يؤكد على دور النشاط الكهربائي في تطوير الورم الدبقي5،6. يلقي العمل الجوهري الذي يقوم به Monje والمتعاونون الضوء على الدور المركزي للنشاط الكهربائي في إفراز neuroligin-3 ، والذي يعزز تطور الورم الدبقي.

وصف وينكلر والمتعاونون الاتصالات بين خلايا GBM (microtubes) بأنها حاسمة في الخطوات الغازية ، وفي الآونة الأخيرة ، التفاعلات بين خلايا GBM والخلايا العصبية عبر نقاط الاشتباك العصبي الموصوفة حديثا. هذه الهياكل تفضل التحفيز الجلوتاماترجية لمستقبلات حمض α الأمينية-3-هيدروكسي-5-ميثيل-4-إيزوكسيزولبروبينيويك (AMPA) الموجودة في غشاء الخلية GBM، الذي يعزز تطور الورم والغزو. غزو الخلايا السرطانية هو عملية مركزية في نشر الانبثاث أو البؤر الثانوية البعيدة ، كما لوحظ في مرضى GBM. وقد تم تحديد عدة عوامل لتكون مهمة في غزو GBM مثل thrombospondin-1, بيتا عامل النمو تحويل (البروتين المصفوفي TGFа المنظمة, أو مستقبلات كيموكيني CXCR3)7,8.

هنا ، تم وصف نموذج المحاكاة الحيوية المبسطة لدراسة غزو GBM ، حيث يتم نقش الخلايا العصبية على مسارات صفمين ، ويتم بذر خلايا GBM عليه ، كخلايا واحدة أو كرويدات(الشكل 1B). وتهدف الإعدادات التجريبية اثنين في إعادة رسملة الغزو على الخلايا العصبية, الذي لوحظ في GBM9,10,11. وقد وضعت هذه النماذج في الماضي كما محاذاة المواد الحيوية nanofiber (core-shell electrospinning) التي تسمح لدراسة هجرة الخلايا عن طريق تحوير الخصائص الميكانيكية أو الكيميائية12. يسمح نموذج الثقافة المشتركة الموصوف في هذه المقالة بفهم أفضل لكيفية هروب خلايا GBM على الخلايا العصبية من خلال تحديد مسارات جزيئية جديدة تشارك في هذه العملية.

Protocol

تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع المرضى (من مستشفى هاوكيلاند، بيرغن، النرويج، وفقا للوائح لجنة الأخلاقيات المحلية). يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للجان أخلاقيات البحوث البشرية والحيوانية في جامعة بوردو. تم إيواء الفئران الحامل وعلاجها في منشأة الحيوانات في جامعة بوردو. تم تنفيذ القتل الرحيم لفأر حامل في الوقت E18 باستخدام CO2. وقد تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية ووافقت عليها لجنة الأخلاقيات المحلية. جميع المنتجات التجارية المشار إليها في جدول المواد.

1. إعداد الشرائح المنقوشة

  1. إعداد الركيزة للترنيخ الدقيق
    1. علاج 18 ملم الزجاج الدائري coverslips عن طريق تنشيط الهواء / البلازما لمدة 5 دقائق. ضع الأغطية في غرفة مغلقة مع 100 ميكرولتر من (3-aminopropyl) ثلاثي إيثوكسيسيلين في مجفف لمدة 1 ساعة.
    2. احتضان مع 100 ملغ / مل من بولي (الإيثيلين غليكول) - succinimidyl valerate (الوزن الجزيئي 5000 (بيغ - SVA)) في 10 M م كربونات العازلة ، > 8 ، ل1 ساعة. شطف على نطاق واسع مع المياه فائقة البور، وجافة تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية.
      ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن تخزين العينة عند 4 درجات مئوية في الظلام لاستخدامها بشكل أكبر.
    3. إضافة الضوئية، 4-benzoylbenzyl-trimethylammonium كلوريد (PLPP)، في 14.7 ملغ/ مل في المالحة العازلة بالفوسفات (PBS).
      ملاحظة: يمكن أيضا استخدام شكل مركز من PLPP، وهو هلام PLPP. وينتج عن ذلك وقت إضاءة أقصر للأشعة فوق البنفسجية (UV) مطلوب لإضعاف فرشاة PEG (100 mJ/mm2).
  2. ترسب هلام فوتونيتياتور
    1. إعداد خليط من 3 ميكرولتر من هلام PLPP و 50 ميكرولتر من الإيثانول المطلق لإيداعها في وسط الشريحة. ضع العينة تحت غطاء محرك السيارة الكيميائي حتى التبخر الكامل للإيثانول المطلق.
      ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن تخزين العينة عند 4 درجات مئوية في الظلام لاستخدامها بشكل أكبر.
  3. الترباس المصغر للشرائح الزجاجية
    1. جبل coverlip في غرفة Ludin ، ووضعها على المرحلة الآلية من المجهر مجهزة نظام التركيز التلقائي.
    2. تحميل الصور المقابلة لmicropatterns المتوخاة في البرنامج. تطبيق هذه المعلمات: النسخ المتماثل 4 × 4 مرات، تباعد 200 ميكرومتر، جرعة الأشعة فوق البنفسجية من 1000 مجم / ملم2. بعد تسلسل الأشعة فوق البنفسجية التلقائي الإضاءة، شطف PLPP بعيدا مع يغسل برنامج تلفزيوني متعددة.
      ملاحظة: إذا تم استخدام هلام PLPP، إزالته عن طريق يغسل واسعة مع الماء deionized، الجافة في تيار من N2،وتخزينها في 4 درجة مئوية.
    3. حضانة مع اللامينين (50 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني) لمدة 30 دقيقة. غسل على نطاق واسع مع برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: يمكن خلط محلول فلوري من البروتين الفلوري الأخضر المنقى (GFP، 10 ميكروغرام/مل في PBS) مع اللامينين لتصور المغذيات الدقيقة عن طريق المجهر الفلوري.

2. إعداد الخلايا العصبية وخلايا GBM لثقافة مشتركة

  1. ثقافة الخلايا العصبية فرس النهر الفئران الجنينية
    1. تشريح قرن آمون من الفئران الجنينية (E18)، ونقل الأنسجة إلى محلول الملح المتوازن هانك (HBSS)/1 mM 4-(2-هيدروكسي إيثيل)-1-بيبيرازينيثانسولفونيك حمض (HEPES)/البنسلين-streptomycin الحل في أنبوب 15 مل. إزالة الحل الزائد دون تجفيف قرن آمون.
    2. إضافة 5 مل من حمض التربسين-الإيثيلينديامين رباعي الأسيتيك (EDTA) المكمل بالبنسلين (10,000 وحدة/مل)/الستربتومايسين (10,000 ميكروغرام/مل) و1 مليون هيبس، واحتضانه لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. غسل 2x مع HBSS / HEPES / البنسلين - streptomycin الحل ، والسماح للأنسجة تبقى في هذا الحل لمدة 2-3 دقائق.
    3. فصل الأنسجة باستخدام اثنين من ماصة باستور مصقول اللهب، عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 10x مع كل الأنسجة، مع الحرص على تقليل رغوة. عد الخلايا، وتقييم جدوى تعليق الخلية. لوحة الخلايا العصبية على الأغطية micropatterned كما هو مبين أدناه.
      ملاحظة: معدل صلاحية الخلية هو 85-90٪ بعد الاستخراج.
  2. ثقافة الخلية للخلايا العصبية على الأغطية micropatterned
    1. إعادة ترطيب الشرائح الزجاجية micropatterned مع برنامج تلفزيوني، واحتضان كامل الخلايا العصبية ثقافة المتوسطة.
    2. بذور الخلايا العصبية فرس النهر التي تم الحصول عليها من الفئران E18 سبراغ دولي مباشرة على غطاء الزجاج micropatterned في كثافة 50،000 خلية لكل سم2 في المتوسط العصبي القاعدي (NBM) المخصب مع 3٪ مصل الحصان. ضع الخلايا العصبية المصغرة في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO2)لمدة 48 ساعة.
      ملاحظة: بعد ~ 6 ح, ويمكن رؤية الخلايا العصبية فرس النهر الأولية التمسك micropatterns صفح.
  3. الثقافة المشتركة للخلايا الجذعية مثل GBM الإنسان على الخلايا العصبية
    ملاحظة: لهذه الدراسة، نمت الغشاء GFP إيجابية والنووية الطماطم خلايا GBM المشتقة من المريض وفقا للبروتوكولات المنشورة السابقة10.
    1. كما تنمو الخلايا على شكل كروية في التعليق، والطرد المركزي تعليق لمدة 5 دقائق في 200 × ز. غسل كرويدات مع 5 مل من برنامج تلفزيوني، واحتضان الخلايا مع 0.5 مل من كاشف تفكك الخلية (انظر جدول المواد) لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية.
    2. إضافة 4.5 مل من NBM كاملة (تكملها B27 الملحق, الهيبارين, عامل نمو الخلايا الليفية 2, البنسلين, والستريبتوميسين, كما هو موضح سابقا8), وعد الخلايا باستخدام تقنية العد التلقائي.
    3. البذور 1000 GBM الخلايا على ثقافة الخلايا العصبية micropatterned في NBM المخصب مع 3٪ مصل الحصان. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2،و 95٪ الرطوبة.

3. تصوير الخلايا الحية

  1. مباشرة بعد GBM زرع الخلية، ضع العينة على خشبة المسرح من المجهر مقلوب مجهزة غرفة الحرارة. إجراء التصوير بالخلايا الحية على المجهر المجهزة بمرحلة آلية لتسجيل مواقف متعددة باستخدام مربع أدوات الاستحواذ متعدد الأبعاد في البرنامج. الحصول على صور GFP/Tomato ذات الحقول الساطعة والفلورية كل 5 دقائق على مدار 12 ساعة مع هدف 20x في درجة حرارة (37 درجة مئوية) وبيئة يتم التحكم فيها بالغاز (5٪ CO2).

4. تحليل الصور

ملاحظة: باستخدام فيجي، تم معالجة مكدس الصور ثنائي الأبعاد (ثنائي الأبعاد) بشكل شبه تلقائي أو معالجته باستخدام أداة محلية الصنع وسهلة الاستخدام (متوفرة في هذا العنوان: https://github.com/Guyon-J/Coculture_Gliomas-Neurons/blob/main/README.md)، والتي تتم كتابتها بلغة الماكرو IJ1(الشكل 2A). يتم تلخيص سير العمل الآلي والإجراءات في الشكل 2B.

  1. تحليل شبكة العصبية (الشكل 2Bi)
    1. حدد صورة واحدة للكدسة. انقر بزر الماوس الأيمن على أداة الشبكة لفتح مربع الحوار خيارات المقابلة وضبط الإعدادات (على سبيل المثال، عتبة = المثلث، لي، هوانغ...، غاوسي طمس،ومرشحات الوسيط = 1، 2، 3...) لإنتاج تجزئة دقيقة من الصور. ثم انقر فوق موافق.
    2. انقر بزر الماوس الأيسر على أداة الشبكة لتنشيط الإجراء التالي تلقائيا.
      1. تكرار الصورة المحددة، وتقسيمها إلى ثلاث قنوات ملونة (الأحمر الرمادي والأخضر).
      2. حدد القناة الرمادية (brightfield)، واؤدي تحسين امتداد التباين (CSE) لتحسين الفصل بين المناطق المختلفة. استخدم كاشف حافة سوبيل (SED) لتنفيذ عملية التواء معالجة الإشارات 2D المجمعة بالفعل تحت أمر Find Edge.
      3. للتصفية المزدوجة (F)، قم بتطبيق ضبابية غاوسية ومرشح متوسط لتقليل الضوضاء وتجانس إشارة الكائن. قم بالتحويل إلى قناع (CM) بتنفيذ خوارزميات العتبة المكيفة للحصول على صورة ثنائية (BIN-grey) مع بكسل أسود (منطقة الخلية) وبيكسلات بيضاء (خلفية). الهيكل العظمي (Sk) منطقة الخلية في شبكة بسيطة (NET)، والجزيئات تصفية (EP) في صورة NET عن طريق إزالة جزيئات صغيرة، غير شبكية.
      4. للقنوات الحمراء والخضراء (النواة والغشاء) ، وإجراء التصفية المزدوجة، وتحويلها إلى قناع باستخدام طريقة العتبة المكيفة ، والسماح BIN -green لتحديد مورفولوجيا الخلية مع الأمر تحليل الجسيمات.
      5. دمج كافة القنوات باستخدام منطقة الاهتمام الخاصة بها (ROI) مع عامل التشغيل OR (الجمع)، وإعادة ضبط لونها الأولي في صورة RGB بسيطة.
  2. تحليل الحركة أحادي الخلية (الشكل 2Bii)
    1. انقر بزر الماوس الأيمن على أداة تتبع الخلية الواحدة لفتح مربع الحوار خيارات المقابلة، وضبط الإعدادات (على سبيل المثال، نوع تريل = النواة أو الغشاء، عتبة = المثلث، لي، هوانغ...، Z الإسقاط = كثافة ماكس، شرائح المجموع...، ضبابية غاوسية ومرشحات الوسيط = 1، 2، 3...) لإنتاج تجزئة دقيقة من الصور. ثم انقر فوق موافق.
    2. انقر بزر الماوس الأيسر على أداة تتبع الخلية المفردة لتنشيط الإجراء التالي تلقائيا.
      1. إزالة القناة الرمادية. تطبيق إسقاط Z على المكدس، والتي سوف تولد صورة المقابلة لمكدس الصورة وفقا للوقت (تي كومة). تصفية مزدوجة وتحويلها إلى قناع المسارات التي خلفتها الخلايا. إزالة جزيئات صغيرة إلى صورة BIN-الأحمر /الأخضر.
      2. باستخدام ROI حدد كل contour من تتبع الخلية ثم حدد مربع الكشف عن حافة تخطي في مربع الحوار خيارات لتخطي هذه الخطوة preprocessing للخطوات اللاحقة.
      3. عزل القناة الحمراء (نوع تريل = Nucleus) على المكدس الأصلي. حدد عائد استثمار واحد وأزل المنطقة الخارجية. تصفية مزدوجة لجميع الصور وتحويلها إلى قناع (BIN-الأحمر). تحديد موضع السنترويد X/Y لكل نواة ثنائية.
    3. باستخدام ماكرو منشور مسبقا لبرنامج جدول البيانات13، احسب متوسط الإزاحة المربعة ونسبة الاتجاه ومتوسط السرعة لهذه الخلية.
  3. تحليل تتبع متعدد الخلايا (الشكل 2Biii)
    1. انقر بزر الماوس الأيمن على أداة التتبع لفتح مربع الحوار خيارات المقابلة وضبط الإعدادات (على سبيل المثال، عتبة = المثلث، لي، هوانغ...، غاوسي طمس وفلاتر الوسيط = 1، 2، 3...) لإنتاج تجزئة دقيقة من الصور. ثم انقر فوق موافق.
    2. انقر بزر الماوس الأيسر على أداة التتبع لتنشيط الإجراء التالي تلقائيا.
      1. إزالة القناة الرمادية.
      2. تقسيم القنوات الحمراء والخضراء، مزدوجة تصفية، وتحويل إلى قناع.
      3. دمج القنوات باستخدام حاسبة الصور... مع عامل التشغيل AND، تاركا فقط إشارة النواة الموجودة في الأغشية.
        ملاحظة: يمكن استخدام العديد من المكونات الإضافية في فيجي لتحديد موضع X/Y لعدة خلايا في هذه الصورة الثنائية المعالجة مسبقا في نفس الوقت (انظر جدول المواد).
    3. باستخدام ماكرو13الموصوف سابقا ، احسب مؤامرة المسار ، ومتوسط الإزاحة المربعة ، ونسبة الاتجاه ، ومتوسط السرعة لهذه الخلايا.
  4. هجرة كروية على حصيرة العصبية (الشكل 2بيف)
    1. انقر بزر الماوس الأيمن على أداة الترحيل لفتح مربع الحوار خيارات المقابلة وضبط الإعدادات (على سبيل المثال، عتبة = المثلث، لي، هوانغ...، ضبابية غاوسية ومرشحات الوسيط = 1، 2، 3...) لإنتاج تجزئة دقيقة من الصور. ثم انقر فوق موافق.
    2. انقر بزر الماوس الأيسر على أداة الترحيل لتنشيط الإجراء التالي تلقائيا.
      1. إزالة القناة الحمراء.
      2. تقسيم القنوات الخضراء والرمادية.
      3. للقناة الرمادية، رسم يدويا كفاف حصيرة العصبية، وقياس مساحتها.
      4. للقناة الخضراء، قم بتصفية المكدس مرتين وتحويله إلى قناع. إزالة المنطقة خارج النقش (BIN) وتحديد منطقة الخلية ثنائية لكل صورة.
        ملاحظة: يتم معايرة المعلمات الموضحة أعلاه عن طريق تغيير قيمها بالنقر بزر الماوس الأيسر فوق رمز الاهتمام. يمكن إجراء هذه المعالجة يدويا. ومع ذلك ، بالنسبة لعدد كبير من الصور (حوالي مائة لكل عملية استحواذ) ، والقنوات (عادة 3 قنوات) ، وخطوات المعالجة ، سيكون من الأفضل استخدام أداة آلية أو شبه آلية.

النتائج

تم إعداد الخلايا العصبية المنقوشة المشاركة في استزراع خلايا GBM الفلورية كما هو موضح في قسم البروتوكول ، وأجريت تجارب التتبع. الخلايا GBM تعديل شكلها بسرعة أثناء الهجرة على الخلايا العصبية (الشكل 1B: لوحة 6 والفيديو 1). هاجرت الخلايا على طول امتدادات الخلايا ا...

Discussion

جليوبلاستوماس غزو واسع النطاق parenchyma باستخدام وسائط مختلفة: الخيار المشترك للأوعية الدموية المحيطة بها, غزو الخلالي, أو الغزو على WMTs18. هذا الوضع الأخير لا يتميز بشكل جيد في الأدب بسبب صعوبة في العثور على نماذج مناسبة في المختبر أو في الجسم الحي المتعلقة بغزو WMT. هنا ، ?...

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس بينهما تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة ARC 2020 ، Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde) ، ARTC ، خطة السرطان 2021 ، INCA PLBIO. ويدعم Alveole من قبل وكالة الوطنية دي لا ريشرش (غرانت لابيكس الدماغ ANR-10-LABX-43). جوريس غيون هو حاصل على زمالة من مستشفى جامعة تولوز (CHU تولوز).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
(3-aminopropyl) triethoxysilaneSigma440140-100MLThe amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA
96-well round-bottom plateSarstedt2582624Used to prepare spheroids
AccutaseGibcoA11105-01Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme
B27Gibco12587Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth FactorPeprotech100-18BStored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting ChamberSlidesInvitrogenC10283Used to cell counting
CoverslipsMarienfeld111580Cell culture substrate
Dessicator cartridgesSigmaZ363456-6EAUsed to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment
DPBS 10xPan BiotechP04-53-500Stored at 4 °C
Fiji software, MTrack2 macroImageJUsed to analyze pictures
Flask 75 cm²Falcon10497302
HBSSSigmaH8264-500ML
Heparin sodiumSigmaH3149-100KUStored at 4 °C
Laminin114956-81-9Promotes neuronal adhesion
Leonardo softwareloading of envisioned micropatterns
MetaMorph Software Molecular Devices LLCNAMicroscopy automation software
MethylcelluloseSigmaM0512Diluted in NBM for a 2% final concentration
Neurobasal mediumGibco21103-049Stored at 4 °C
Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA)inverted microscope equipped with a motorized stage 
Penicillin - StreptomycinGibco15140-122Stored at 4 °C
PLPPAlveolePLPPclassic_1mlPhotoinitiator used to degrade the PEG brush
Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA)Laysan BioVA-PEG-VA-5000-5gUsed as an anti-fouling coating
PRIMOAlveolePRIMO1Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus
Trypan blue 0.4%ThermoFisherT10282Used for cell counting
Trypsin-EDTASigmaT4049-100MLUsed to detach adherent cells

References

  1. Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. Current challenges and opportunities in treating glioblastoma. Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).
  2. Scherer, H. J. The forms of growth in gliomas and their practical significance. Brain. 63, 1-35 (1940).
  3. Zagzag, D., et al. Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1α/CXCR4 expression in glioblastomas. American Journal of Pathology. 173, 545-560 (2008).
  4. Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neurosciences. 22, 91-105 (2019).
  5. Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573, 532-538 (2019).
  6. Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573, 539-545 (2019).
  7. Boyé, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571 (2017).
  8. Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146 (2019).
  9. Gritsenko, P. G., et al. p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks. Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).
  10. Guyon, J., et al. A 3D spheroid model for glioblastoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).
  11. Strale, P. O., et al. Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption. Advanced Materials. , (2015).
  12. Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).
  13. Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells. MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).
  14. Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems. Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).
  15. Pasturel, A., Strale, P. -. O., Studer, V. Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates. Advance Healthcare Materials. 9, 2000519 (2020).
  16. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145, 831-834 (2011).
  17. Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140, 898-913 (2017).
  18. Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).
  19. Han, M., et al. Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/β-catenin signalling. Brain. 143, 512-530 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

168

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved