Co-culture de cellules souches de glioblastome sur des neurones à motifs pour étudier la migration et les interactions cellulaires

Résumé

Ici, nous présentons un test de co-culture facile à utiliser pour analyser la migration du glioblastome (GBM) sur des neurones à motifs. Nous avons développé une macro dans le logiciel FiJi pour une quantification facile de la migration des cellules GBM sur les neurones, et avons observé que les neurones modifient la capacité invasive des cellules GBM.

Résumé

Les glioblastomes (GBM), gliomes malins de grade IV, sont l’un des types les plus mortels de cancer humain en raison de leurs caractéristiques agressives. En dépit des avances significatives dans la génétique de ces tumeurs, comment les cellules de GBM envahissent le parenchyme sain de cerveau n’est pas bien comprise. Notamment, on lui a montré que les cellules de GBM envahissent l’espace peritumoral par différentes voies ; l’intérêt principal de cet article est la route le long des étendues de matière blanche (WMTs). Les interactions des cellules tumorales avec les composants peritumoral nerveux de cellules ne sont pas bien caractérisées. Ici, une méthode a été décrite qui évalue l’impact des neurones sur l’invasion cellulaire gbm. Ce document présente une analyse in vitro avancée de co-culture qui imite l’invasion de WMT en analysant la migration de GBM tige-comme des cellules sur des neurones. Le comportement des cellules GBM en présence de neurones est surveillé à l’aide d’une procédure de suivi automatisée avec un logiciel open source et en accès libre. Cette méthode est utile pour de nombreuses applications, en particulier, pour des études fonctionnelles et mécanistes ainsi que pour l’analyse des effets des agents pharmacologiques qui peuvent bloquer la migration cellulaire GBM sur les neurones.

Introduction

Les gliomes malins primaires, y compris gbms, sont des tumeurs dévastatrices, avec un taux de survie moyen de 12 à 15 mois rapportés pour des patients de GBM. La thérapie courante se fonde sur la grande résection de masse de tumeur et la chimiothérapie couplées avec la radiothérapie, qui prolonge seulement le taux de survie de quelques mois. Les échecs thérapeutiques sont intimement liés à une mauvaise administration de médicaments à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE) et à la croissance invasive dans les espaces périvasculaires, les méninges et le long des^{TMM 1.} L’invasion périvasculaire, également appelée co-option vasculaire, est un processus bien étudié, et les mécanismes moléculaires commencent à être élucidés ; cependant, le processus de l’invasion de cellules gbm le long de WMTs n’est pas bien compris. Les cellules tumorales migrent dans le cerveau sain le long des structures secondaires de Scherer². En effet, il y a près d’un siècle, Hans-Joachim Scherer a décrit les voies invasives de la GBM, qui sont maintenant appelées satellitosis périnéuronal, satellitosis périvasculaire, propagation subpial, et invasion le long de la WMT (Figure 1A).

Certaines chimiokines et leurs récepteurs, tels que le facteur 1α dérivé des cellules stromales (SDF1α) et le récepteur 4 des chimiokines à motif C-X-C (CXCR4), mais pas le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), semblent être impliqués dans l’invasion WMT^3. Plus récemment, un axe transcellulaire NOTCH1-SOX2 s’est avéré être une voie importante dans l’invasion WMT des cellules GBM^4. Les auteurs ont décrit comment les cellules souches gbm envahissent le parenchyme de cerveau sur des neurones partiellement unmyelinated, suggérant la destruction des gaines de myelin par des cellules de GBM. Une étape importante a été franchie en 2019 lorsque trois articles ont été publiés de manière concluante dans la revue Nature, soulignant le rôle de l’activité électrique dans le développement du gliome^5,6. Les travaux fondateurs de Monje et de ses collaborateurs ont mis en lumière le rôle central de l’activité électrique dans la sécrétion de neuroligine-3, qui favorise le développement du gliome.

Winkler et ses collaborateurs ont décrit les connexions entre les cellules GBM (microtubes) étant cruciales dans les étapes invasives, et dernièrement, les interactions entre les cellules GBM et les neurones via les synapses de neurogliome nouvellement décrites. Ces structures favorisent la stimulation glutamatergique des récepteurs de l’acide α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) situés à la membrane cellulaire gbm, qui favorise le développement et l’invasion de tumeur. L’invasion de cellules de tumeur est un processus central dans la diffusion des métastases ou des foyers secondaires éloignés, comme observé dans des patients de GBM. Plusieurs facteurs ont été identifiés comme étant importants dans l’invasion du GBM tels que la thrombospondine-1, un facteur de croissance transformant bêta (protéine matricellulaire régulée par TGFβ, ou le récepteur de chimiokine CXCR3)^7,8.

Ici, un modèle biomimétique simplifié a été décrit pour l’étude de l’invasion gbm, dans lequel les neurones sont modelés sur des pistes de laminine, et les cellules GBM sont ensemencées dessus, comme des cellules uniques ou comme des sphéroïdes (Figure 1B). Les deux décors expérimentaux visent à récapituler l’invasion sur les neurones, qui est observée dans GBM^9,10,11. De tels modèles ont été développés dans le passé sous forme de biomatériaux en nanofibres alignés (électrofilage noyau-coquille) qui permettent d’étudier la migration cellulaire en modulant les propriétés mécaniques ou chimiques^12. Le modèle de co-culture décrit dans cet article permet de mieux comprendre comment les cellules GBM s’échappent sur les neurones en définissant de nouvelles voies moléculaires impliquées dans ce processus.

Protocole

Le consentement écrit éclairé a été obtenu de tous les patients (de l’hôpital Haukeland, Bergen, Norvège, conformément aux règlements du comité d’éthique local). Ce protocole suit les directives des comités d’éthique de la recherche humaine et animale de l’Université de Bordeaux. Des rats gravides ont été logés et traités dans l’installation animalier de l’Université de Bordeaux. L’euthanasie d’une rate enceinte chronométré e18 a été réalisée en utilisant le CO_2. Toutes les procédures relatives aux animaux ont été effectuées conformément aux directives de l’établissement et approuvées par le comité d’éthique local. Tous les produits commerciaux sont référencés dans la table des matières.

1. Préparation des diapositives à motifs

1. Préparation de substrat pour le micropatterning
   1. Traiter les lamelle circulaires en verre de 18 mm par activation air/plasma pendant 5 min. Placer les lamelles dans une chambre fermée avec 100 μL de (3-aminopropyl) triéthoxysilane dans un dessicateur pendant 1 h.
   2. Incuber avec 100 mg/mL de valérate de poly (éthylène glycol)-succinimidyle (poids moléculaire 5 000 (Peg-SVA)) dans un tampon de carbonate de 10 mM, pH > 8, pendant 1 h. Rincer abondamment à l’eau ultrapure et sécher sous une hotte chimique.
      NOTA: À ce stade, l’échantillon peut être conservé à 4 °C dans l’obscurité pour une utilisation ultérieure.
   3. Ajouter le photoinitiateur, le chlorure de 4-benzoylbenzyl-triméthylammonium (PLPP), à 14,7 mg/mL dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
      REMARQUE: Une forme concentrée de PLPP, un gel PLPP, peut également être utilisée. Il en résulte un temps d’éclairage ultraviolet (UV) plus court nécessaire pour dégrader la brosse PEG (100 mJ/mm^2).
2. Dépôt de gel photoinitiateur
   1. Préparer un mélange de 3 μL de gel PLPP et de 50 μL d’éthanol absolu à déposer au centre de la lame. Placer l’échantillon sous une hotte chimique jusqu’à évaporation complète de l’éthanol absolu.
      NOTA: À ce stade, l’échantillon peut être conservé à 4 °C dans l’obscurité pour une utilisation ultérieure.
3. Micropatternage de lames de verre
   1. Montez la lame de couverture dans une chambre Ludin et placez-la sur l’étage motorisé d’un microscope équipé d’un système de mise au point automatique.
   2. Chargez des images correspondant aux micropatterns envisagés dans le logiciel. Appliquer ces paramètres : réplication 4 x 4 fois, espacement de 200 μm, dose UV de 1 000 mJ/mm^2. Après la séquence d’éclairage UV automatique, rincez le PLPP avec plusieurs lavages PBS.
      REMARQUE: Si du gel PLPP a été utilisé, retirez-le par des lavages approfondis à l’eau désionisée, séchez dans un courant de_N2et conservez-le à 4 °C.
   3. Incuber avec de la laminine (50 μg/mL dans du PBS) pendant 30 min. Laver abondamment avec du PBS.
      REMARQUE : Une solution fluorescente de protéine fluorescente verte purifiée (GFP, 10 μg/mL dans le PBS) peut être mélangée à de la laminine pour visualiser les micropatterns par microscopie à fluorescence.

2. Préparation des neurones et des cellules GBM pour la co-culture

1. Culture de neurones embryonnaires de l’hippocampe du rat
   1. Disséquer l’hippocampe des rats embryonnaires (E18), et transférer le tissu dans un Hank' solution de sel équilibrée de s (HBSS)/1 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)/penicillin-streptomycin solution dans un tube de 15 ml. Enlever l’excès de solution sans sécher l’hippocampe.
   2. Ajouter 5 mL d’acide tétraacétique trypsine-éthylènediamine (EDTA) complété par de la pénicilline (10 000 unités/mL)/streptomycine (10 000 μg/mL) et du HEPES de 1 mM, et incuber pendant 15 min à 37 °C. Laver 2x avec la solution HBSS/HEPES/pénicilline-streptomycine, et laisser le tissu rester dans cette solution pendant 2-3 min.
   3. Dissociez le tissu à l’aide de deux pipettes Pasteur polies à la flamme, en pipetant de haut en bas 10x avec chaque tissu, en prenant soin de minimiser la formation de mousse. Comptez les cellules et évaluez la viabilité de la suspension cellulaire. Plaquer les neurones sur des lamelle micropatterned comme indiqué ci-dessous.
      REMARQUE: Le taux de viabilité cellulaire est de 85-90% après extraction.
2. Culture cellulaire pour neurones sur des lamelle de couverture micropatterned
   1. Réhydratez les lames de verre micropatterned avec du PBS, et incuber le milieu complet de culture cellulaire neuronale.
   2. Ensemencez les neurones de l’hippocampe obtenus à partir de rats E18 Sprague-Dawley directement sur la lame de couverture en verre micropatterned à une densité de 50 000 cellules par^cm2 en milieu neurobasal (NBM) enrichi avec 3% de sérum de cheval. Placer les neurones micropatterned dans l’incubateur (37 °C, 5%_CO2)pendant 48 h.
      REMARQUE: Après ~ 6 h, neurones de l’hippocampe primaire peut être vu adhérant aux micropatterns de laminine.
3. Co-culture de cellules souches humaines de type GBM sur des neurones
   REMARQUE: Pour cette étude, des cellules GBM Membranaires GFP-positives et nucléaires-dérivées du patient-tomate ont été cultivées selon les protocoles édités précédents^10.
   1. Au fur et à mesure que les cellules en forme de sphéroïde se développent en suspension, centrifugez la suspension pendant 5 min à 200 × g. Laver les sphéroïdes avec 5 mL de PBS et incuber les cellules avec 0,5 mL du réactif de dissociation cellulaire (voir le tableau des matériaux)pendant 5 min à 37 °C.
   2. Ajouter 4,5 mL de NBM complet (complété par un supplément de B27, de l’héparine, un facteur de croissance des fibroblastes 2, de la pénicilline et de la streptomycine, comme décrit précédemment^8),et compter les cellules à l’aide d’une technique de comptage automatique.
   3. Ensemencez 1 000 cellules GBM au-dessus de la culture neuronale micropatterned en NBM enrichie avec du sérum de cheval de 3%. Incuber la plaque à 37 °C, 5 % de_CO2et 95 % d’humidité.

3. Imagerie cellulaire vivante

1. Immédiatement après l’ensemencement des cellules GBM, placez l’échantillon sur la scène d’un microscope inversé équipé d’une chambre thermostatée. Effectuez l’imagerie à cellules vivantes sur le microscope équipé d’un étage motorisé pour enregistrer plusieurs positions en utilisant une boîte à outils d’acquisition multidimensionnelle dans le logiciel. Acquérir des images GFP/Tomate en champ lumineux et en épifluorescence toutes les 5 minutes sur 12 h avec un objectif 20x dans un environnement à température (37 °C) et à gaz contrôlé (5 %_co2).

4. Analyse d’image

REMARQUE: À l’aide de Fidji, la pile d’images bidimensionnelles (2D) a été semi-automatiquement prétraitée ou traitée à l’aide d’un outil fait maison et convivial (disponible à cette adresse : https://github.com/Guyon-J/Coculture_Gliomas-Neurons/blob/main/README.md), qui est écrit en langage de macro IJ1 (Figure 2A). Le flux de travail et les procédures automatisés sont résumés à la figure 2B.

1. Analyse de réseau neuronal (Figure 2Bi)
   1. Sélectionnez une image de la pile. Faites un clic droit sur l’outil Réseau pour ouvrir la boîte de dialogue Options correspondante et ajuster les paramètres (par exemple, Seuil = Triangle, Li, Huang..., Flou gaussienet Filtres médians = 1, 2, 3...) pour produire une segmentation précise des images. Ensuite, cliquez sur OK.
   2. Cliquez avec le bouton gauche sur l’outil Réseau pour activer automatiquement la procédure suivante.
      1. Dupliquez l’image sélectionnée et divisez-la en trois couches de couleur (rouge-gris-vert).
      2. Sélectionnez le canal gris (champ clair) et effectuez une amélioration de l’étirement du contraste (CSE) pour améliorer la séparation entre les différentes zones. Utilisez le détecteur de bord Sobel (SED) pour effectuer l’opération de convolution de traitement du signal 2D déjà regroupée sous la commande Rechercher un bord.
      3. Pour le double filtrage (F), appliquez un flou gaussien et un filtre médian pour réduire le bruit et lisser le signal de l’objet. Convertir en masque (CM) en exécutant des algorithmes de seuil adaptés pour obtenir une image binaire (bin-gris) avec des pixels noirs (zone de cellule) et des pixels blancs (arrière-plan). Squelettez (Sk) la zone de cellule en un réseau simple (NET) et filtrez les particules (EP) dans une image NET en supprimant les petites particules non en réseau.
      4. Pour les canaux rouges et verts (noyau et membrane), effectuez un double filtrage, convertissez-les en masque à l’aide de la méthode de seuillage adaptée et autorisez BIN-green à déterminer la morphologie des cellules à l’aide de la commande Analyser les particules.
      5. Fusionnez tous les canaux à l’aide de leur région d’intérêt (ROI) avec l’opérateur OR (combine) et réajustez leur couleur initiale en une simple image RVB.
2. Analyse de la motilité unicellulaire( Figure 2Bii)
   1. Cliquez avec le bouton droit sur l’outil Suivi de cellule unique pour ouvrir la boîte de dialogue Options correspondante et ajuster les paramètres (par exemple, Type de piste = Noyau ou membrane, Seuil = Triangle, Li, Huang..., Projection Z = Intensité maximale, Tranches de somme..., Flou gaussien et Filtres médians = 1, 2, 3...) pour produire une segmentation précise des images. Ensuite, cliquez sur OK.
   2. Cliquez avec le bouton gauche sur l’outil de suivi de cellule unique pour activer automatiquement la procédure suivante.
      1. Retirez le canal gris. Appliquez une projection Z sur la pile, qui génère une image correspondant à une pile d’images en fonction de l’heure (T-stack). Double filtrez et convertissez-les en Masque les traînées laissées par les cellules. Retirez les petites particules de l’image BIN-rouge/verte.
      2. À l’aide du retour sur investissement, sélectionnez chaque contour de la trace de cellule et cochez la case Ignorer la détection de bord dans la boîte de dialogue Options pour ignorer cette étape de prétraitement pour les étapes suivantes.
      3. Isolez le canal rouge(Trail type = Nucleus) sur la pile d’origine. Sélectionnez un retour sur investissement et supprimez la zone extérieure. Double filtrez toutes les images et convertissez-les en masque (BIN-rouge). Déterminer la position X/Y du centroïde de chaque noyau binarisé.
   3. À l’aide d’une macro déjà publiée pour le tableur^13,calculez le déplacement carré moyen, le rapport de directionnalité et la vitesse moyenne de cette cellule.
3. Analyse de suivi à cellules multiples( Figure 2Biii)
   1. Faites un clic droit sur l’outil De suivi pour ouvrir la boîte de dialogue Options correspondante et ajuster les paramètres (par exemple, Seuil = Triangle, Li, Huang..., Flou gaussien et Filtres médians = 1, 2, 3...) pour produire une segmentation précise des images. Ensuite, cliquez sur OK.
   2. Cliquez avec le bouton gauche de la souris sur l’outil de suivi pour activer automatiquement la procédure suivante.
      1. Retirez le canal gris.
      2. Divisez les canaux rouges et verts, double filtrez et convertissez-les en masque.
      3. Fusionner les canaux à l’aide de la calculatrice d’images... commande avec l’opérateur AND, ne laissant que le signal de noyau trouvé dans les membranes.
         REMARQUE: Plusieurs plugins à Fidji peuvent être utilisés pour déterminer la position X / Y de plusieurs cellules dans cette image prétraitée binaire en même temps (voir la table des matériaux).
   3. À l’aide d’une macro¹³décrite précédemment, calculez le tracé de trajectoire, le déplacement carré moyen, le rapport de directionnalité et la vitesse moyenne de ces cellules.
4. Migration sphéroïde sur le tapis neural( Figure 2Biv)
   1. Faites un clic droit sur l’outil Migration pour ouvrir la boîte de dialogue Options correspondante et ajuster les paramètres (par exemple, Seuil = Triangle, Li, Huang..., Flou gaussien et Filtres médians = 1, 2, 3...) pour produire une segmentation précise des images. Ensuite, cliquez sur OK.
   2. Cliquez avec le bouton gauche sur l’outil de migration pour activer automatiquement la procédure suivante.
      1. Retirez le canal rouge.
      2. Divisez les canaux vert et gris.
      3. Pour le canal gris, dessinez manuellement le contour du tapis neuronal et mesurez sa surface.
      4. Pour le canal vert, double filtrez la pile et convertissez-la en Masque. Supprimez la zone située à l’extérieur du motif (BIN) et déterminez la zone de cellule binarisée pour chaque image.
         REMARQUE: Les paramètres décrits ci-dessus sont calibrés en modifiant leurs valeurs en cliquant avec le bouton gauche sur l’icône d’intérêt. Ce traitement peut être effectué manuellement. Cependant, pour un grand nombre d’images (environ une centaine par acquisition), de canaux (généralement 3 canaux) et d’étapes de traitement, un outil automatisé ou semi-automatisé serait préférable.

Résultats

Des neurones modelés co-cultivés avec les cellules fluorescentes de GBM ont été préparés comme décrit dans la section de protocole, et des expériences de suivi ont été exécutées. Les cellules GBM ont rapidement modifié leur forme lors de la migration sur les neurones(Figure 1B: panneau 6 et Vidéo 1). Les cellules ont migré le long des extensions neuronales, dans un mouvement aléatoire (Vidéo 1). Les cellules GBM fluorescente...

Discussion

Les glioblastomes envahissent largement le parenchyme en utilisant différents modes: cooptation des vaisseaux sanguins environnants, invasion interstitielle ou invasion sur wmts¹⁸. Ce dernier mode n’est pas bien caractérisé dans la littérature en raison de la difficulté à trouver des modèles in vitro ou in vivo appropriés liés à l’invasion de WMT. Ici, un modèle simplifié a été proposé dans lequel les neurones de rongeurs cultivés ont été modelés sur des su...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-aminopropyl) triethoxysilane	Sigma	440140-100ML	The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA
96-well round-bottom plate	Sarstedt	2582624	Used to prepare spheroids
Accutase	Gibco	A11105-01	Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme
B27	Gibco	12587	Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor	Peprotech	100-18B	Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting ChamberSlides	Invitrogen	C10283	Used to cell counting
Coverslips	Marienfeld	111580	Cell culture substrate
Dessicator cartridges	Sigma	Z363456-6EA	Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment
DPBS 10x	Pan Biotech	P04-53-500	Stored at 4 °C
Fiji software, MTrack2 macro	ImageJ		Used to analyze pictures
Flask 75 cm²	Falcon	10497302
HBSS	Sigma	H8264-500ML
Heparin sodium	Sigma	H3149-100KU	Stored at 4 °C
Laminin		114956-81-9	Promotes neuronal adhesion
Leonardo software			loading of envisioned micropatterns
MetaMorph Software	Molecular Devices LLC	NA	Microscopy automation software
Methylcellulose	Sigma	M0512	Diluted in NBM for a 2% final concentration
Neurobasal medium	Gibco	21103-049	Stored at 4 °C
Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA)			inverted microscope equipped with a motorized stage
Penicillin - Streptomycin	Gibco	15140-122	Stored at 4 °C
PLPP	Alveole	PLPPclassic_1ml	Photoinitiator used to degrade the PEG brush
Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA)	Laysan Bio	VA-PEG-VA-5000-5g	Used as an anti-fouling coating
PRIMO	Alveole	PRIMO1	Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus
Trypan blue 0.4%	ThermoFisher	T10282	Used for cell counting
Trypsin-EDTA	Sigma	T4049-100ML	Used to detach adherent cells